CN108782241B - 椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法 - Google Patents

椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，属于椰子组培技术领域。椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4‑D 20～100mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。本发明选用椰子幼嫩花序作为外植体，采用体细胞胚发生途径培养获得椰子再生植株，培养的后代具有与母树完全一致的遗传信息，具有繁殖数量多，稳定性高特点，解决了椰子种子苗后代性状分离，遗传性状不稳定的问题，将为开展优良椰子种苗快速繁殖提供育技术，也可为高效的基因转化提供再生途径。

Description

椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生 与植株再生的方法
技术领域
本发明属于椰子组培技术领域，具体涉及椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法。
背景技术
椰子(Cocos nucifera L.)是棕榈科椰子属多年生乔木，是典型的热带木本油料作物和食品作物，是世界热带地区重要的经济作物。目前我国椰子的产量只能满足总需求量的10％左右，供需矛盾突出，因此急需要加快椰子种植产业的发展。
椰子多为异花授粉植物，生长周期长，繁殖系数低，杂种后代性状分离严重，个体间差异较大，很难获得同一性状的后代群体，同时椰子只有一个独立的茎干而不产生分枝，因而常规的营养繁殖手段如扦插、嫁接、高空压条等无法用于椰子的无性繁殖，因此有必要通过建立完整、高效、实用的椰子组培快繁技术体系，实现椰子优良无性品系培育，为推广优质椰子组织培养苗大规模繁育提供技术参考，也可为高效的基因转化提供再生途径。
然而目前，对于椰子组织培养技术而言，尚无成功的体细胞胚发生和植株再生技术的案例，只能借鉴其他物种的体细胞胚发生技术和植株再生技术进行摸索和研究，但是不同物种遗传背景和生活环境差异巨大，对椰子的组织培养技术的研发帮助甚微。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基，具有对椰子胚性愈伤组织诱导率高的特点。
本发明的目的还在于提供一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，使椰子植株再生实现了创造性突破。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 20～100mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。
优选的，每升基本培养基中还含有2,4-D 40～80mg、TDZ 1～8mg、蔗糖23～28g和植物凝胶1.2～2.5g。
本发明提供了一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤：
1)以椰子幼嫩花序作为外植体，进行消毒，将消毒后的外植体接种至所述的胚性愈伤组织诱导培养基上依次诱导培养和继代增殖培养，获得胚性细胞；
所述诱导培养和继代增殖培养的温度独立为24～28℃；所述诱导培养和继代增殖培养独立为全暗培养；
2)将所述步骤1)中的胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚发生，获得体细胞胚；
所述体细胞胚胎诱导培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D 5～50mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；
所述诱导体细胞胚发生的条件如下：所述培养为光暗交替培养，光照强度900～1200lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃；
3)将所述步骤2)中的体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中成熟培养，获得成熟的鱼雷胚；
所述体细胞胚成熟培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D0～10mg、NAA 0.1～1mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；
所述成熟培养的条件如下：培养温度为25-28℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为10～12h/d，光照的强度为2000～2500lx；
4)挑取所述步骤2)中的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基中萌发培养，获得萌发的体细胞胚；
所述体细胞胚萌发培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有GA30.1～5mg、6-BA 0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；
所述萌发培养条件为：培养温度为25～28℃；萌发培养为光暗交替培养，；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；
5)所述将萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上培养，获得完整的再生植株；
所述植株再生培养基为1/2MS培养基为基本培养基，每升基本培养基含有IBA 0～10mg、NAA 0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；
所述培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光照培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx。
优选的，所述步骤2)中体细胞胚胎诱导培养基为每升基本培养基含有2,4-D10mg、TDZ 2～7mg、蔗糖23～27g和植物凝胶1.5～2.5g。
优选的，所述步骤2)中诱导体细胞胚发生的条件如下：光照强度1000lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃。
优选的，所述步骤3)中所述体细胞胚成熟培养基为每升基本培养基含有2,4-D 2～7mg、NAA 0.3～0.7mg、蔗糖22～27g和植物凝胶1.5～2.5g。
优选的，所述步骤3)中成熟培养的条件如下：培养温度为26℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为11h/d，光照的强度为2200～2400lx。
优选的，所述步骤4)中体细胞胚萌发培养基为每升基本培养基含有GA3 0.5～4mg、6-BA 0.2～0.7mg、蔗糖30～40g和植物凝胶1.6～2.4g。
优选的，所述步骤4)中萌发培养条件为：培养温度为26℃；所述光照培养的时间为11h/d，光照强度为2200～2400lx。
优选的，所述步骤1)中消毒的方法包括以下步骤：将用1号消毒液擦拭椰子幼嫩花序的外层2～3次，然后剥掉外层佛焰苞，将露出的椰子幼嫩花序用2号消毒液浸泡25～35s，冲洗后用3号消毒液浸泡5～6min，冲洗2～3次，再用4号消毒液进行浸泡6～8min，冲洗3～5次，获得消毒后的外植体；
所述1号消毒液为体积分数50％的酒精水溶液；
所述2号消毒液为体积分数75％酒精水溶液；
所述3号消毒液为质量分数0.1％HgCl2溶液；
所述4号消毒液为体积分数6～12％次氯酸钠溶液。
本发明提供了一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 20～100mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。本发明所述诱导培养基是以Y3培养基为基本培养基，但常规的培养基一般选用MS培养基，对椰子体胚发生与再生作用不明显，无法进行脱分化形成胚性愈伤组织；本发明提供的诱导培养基相对于常规使用的MS培养基具有显著诱导率高的特点，同时每升基本培养基中还含有20～100mg的2,4-D，与现有技术相比，本发明中诱导培养基的2,4-D浓度比常规其他作物的胚性愈伤组织培养基的激素浓度(比如2,4-D)至少高1个数量级，本发明提供的2,4-D浓度相对于其他作物中基本达到致死剂量，但是作用于椰子体细胞时不仅保证了成功诱导，而且还能得到较高的诱导率。最后本发明所述诱导培养基将0～10mg/L的TDZ(噻苯隆)与20～100mg/L的2,4-D配比使用，达到更高的诱导率，这与常规的培养方法有很大不同。实验表明，采用本发明提供的诱导培养基进行实验，胚性愈伤组织诱导率达到41％以上。
本发明提供了一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，选用椰子幼嫩花序作为外植体，采用体细胞胚发生途径培养获得椰子再生植株，培养的后代具有与母树完全一致的遗传信息，具有繁殖数量多，稳定性高特点，解决了椰子种子苗后代性状分离，遗传性状不稳定的问题，将为开展优良椰子种苗快速繁殖提供育技术，也可为高效的基因转化提供再生途径。胚性愈伤组织诱导率为41％，出胚率为21％，出苗率约为11％，3个月增殖倍数为2.1，按此计算，100个椰子花序材料，在1个培养周期内，可以获得约400株椰子苗，经过1个周期的初始培养后，每年可培养6000株组培苗。而传统的椰子育苗方法，1个椰子培养成1株椰子苗。因此本发明提供的方法比传统的育苗技术效率大幅度提高。
同时本发明提供的方法具有周期短的特点，所述方法的培养时间为18～24个月。本发明提供的方法对不同品种的椰子都适用，都能够获得最终的椰子再生植株，最终出苗率分别为5～11％，说明本发明的可重复性和稳定性是可靠的。
附图说明
图1是椰子体细胞胚性愈伤组织的形态图；
图2是椰子体细胞诱导的体细胞胚胎的形态图；
图3是椰子体细胞胚胎发育出芽的形态图；
图4是椰子再生植株的形态图。
具体实施方式
本发明提供了一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 20～100mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。
本发明提供的诱导培养基以Y3培养基为基本培养基。所述Y3培养基成分和配制方法见Eeuwens CJ(1976)参考文献(Mineral requirements for growth and callusinitiation of tissue explants excised from mature coconut palms and culturedin vitro.Physiol Plant 36:23-28)。
本发明提供的诱导培养基包括2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)。所述2,4-D的浓度为每升基本培养基含有20～100mg，优选为40～80mg，更优选为50～70mg，最优选为60mg。所述2,4-D是一类植物生长素，胚性愈伤组织的形成起主要诱导作用。本发明对所述2,4-D的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的2,4-D即可。
本发明提供的诱导培养基包括TDZ(噻苯隆)。所述TDZ的浓度为每升基本培养基含有0～10mg，优选为1～8mg，更优选为3～6mg，最优选为4.5mg。本发明对所述TDZ的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的TDZ即可。在本发明中，当诱导培养基中含有TDZ时，2,4-D和TDZ的质量比优选为10～50：5～2，更优选为15：1。
本发明提供的诱导培养基包括蔗糖。所述蔗糖的浓度为每升基本培养基含有20～30g，优选为23～28g，更优选为24～27g，最优选为25g。所述蔗糖能够为椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导提供碳源。本发明对所述蔗糖的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的蔗糖即可。
本发明提供的诱导培养基包括植物凝胶。所述植物凝胶的浓度为每升基本培养基含有1～3g，优选为1.2～2.5g，更优选为1.5～2.2g，最优选为2g。所述植物凝胶有利于培养基形成固体形态。本发明对所述植物凝胶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物凝胶即可。
在本发明中，所述诱导培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的培养基的配制方法即可。
本发明提供了一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤：
1)以椰子幼嫩花序作为外植体，进行消毒，将消毒后的外植体接种至所述的胚性愈伤组织诱导培养基上依次诱导培养和继代增殖培养，获得胚性细胞；
所述诱导培养和继代增殖培养的温度独立为24～28℃；所述诱导培养和继代增殖培养独立为全暗培养；
2)将所述步骤1)中的胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚发生，获得体细胞胚；
所述体细胞胚胎诱导培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D 5～50mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；
所述诱导体细胞胚的发生的条件如下：所述培养为光暗交替培养，光照强度900～1200lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃；
3)将所述步骤2)中的体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中成熟培养，获得成熟的鱼雷胚；
所述体细胞胚成熟培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D0～10mg、NAA 0.1～1mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；
所述成熟培养的条件如下：培养温度为25～28℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为10～12h/d，光照的强度为2000～2500lx；
4)挑取所述步骤2)中的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基中萌发培养，获得萌发的体细胞胚；
所述体细胞胚萌发培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有GA30.1～5mg、6-BA 0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；
所述萌发培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光暗交替培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；
5)所述将萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上再生培养，获得完整的再生植株；
所述植株再生培养基为1/2MS培养基为基本培养基，每升基本培养基含有IBA 0～10mg、NAA 0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；
所述再生培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光暗交替培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx。
本发明以椰子幼嫩花序作为外植体，进行消毒，将消毒后的外植体接种至所述的胚性愈伤组织诱导培养基上依次诱导培养和继代增殖培养，获得胚性细胞；所述诱导培养和继代增殖培养的温度独立为25～28℃；所述诱导培养和继代增殖培养独立为全暗培养。
在本发明中，所述椰子幼嫩花序优选为佛焰苞未开裂的幼嫩花序，长度小于40cm，更优选为长度为10cm～35cm的未开裂外层佛焰苞的椰子幼嫩花序。
在本发明中，所述消毒的方法包括以下步骤：将用1号消毒液擦拭椰子幼嫩花序的外层2～3次，然后剥掉外层佛焰苞，将露出的椰子幼嫩花序用2号消毒液浸泡25～35s，冲洗后用3号消毒液浸泡5～6min，冲洗2～3次，再用4号消毒液进行浸泡6～8min，冲洗3～5次，获得消毒后的外植体；
所述1号消毒液为体积分数50％的酒精水溶液；
所述2号消毒液为体积分数75％酒精水溶液；
所述3号消毒液为质量分数0.1％HgCl2溶液；
所述4号消毒液为体积分数6～12％次氯酸钠溶液。
在本发明中，将消毒后的外植体优选切块，将切块后的外植体接种至所述的胚性愈伤组织诱导培养基上诱导培养，得到胚性愈伤组织。所述切块的厚度优选为1～1.5mm，更优选为1.2mm。所述接种至胚性愈伤组织诱导培养基的接种量优选为12～20个/皿，更优选为16个/皿。所述诱导培养的条件如下：全暗诱导培养，诱导培养的温度为24～28℃。所述诱导培养的温度优选为25～27℃，最优选为26℃。所述诱导培养时第20～30d后培养物开始膨胀，培养30d后可见分裂旺盛的胚性愈伤组织(见图1)。
在本发明中，得到胚性愈伤组织后，本发明将所述胚性愈伤组织优选接种于新的胚性愈伤组织诱导培养基上进行继代增殖培养，获得胚性细胞。所述接种至胚性愈伤组织诱导培养基的接种量优选为4～16个/皿，更优选为9个/皿。所述继代增殖培养优选每20d转接1次，有利于可维持胚性愈伤组织的再生能力。
得到胚性细胞后，本发明将所述胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚发生，获得体细胞胚；所述体细胞胚胎诱导培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D 5～50mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；所述诱导体细胞胚的发生的条件如下：所述培养为光暗交替培养，光照强度900～1200lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃。
在本发明中，所述接种至体细胞胚胎诱导培养基的接种量优选为4～16个/皿，更优选为9个/皿。所述体细胞胚胎诱导培养基优选为每升基本培养基含有2,4-D 10mg、TDZ 2～7mg、蔗糖23～27g和植物凝胶1.5～2.5g。所述诱导体细胞胚的发生的条件优选如下：温度26℃，光照时间为10h，光照强度为1000Lx。诱导的时间优选为38～42d，更优选为40d。所述培养至20d后肉眼可见到体细胞胚的出现。
得到体细胞胚后，本发明将所述体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中成熟培养，获得成熟的鱼雷胚；所述体细胞胚成熟培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D 0～10mg、NAA(萘乙酸)0.1～1mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；所述培养的条件如下：培养温度为25～28℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为10～12h/d，光照的强度为2000～2500lx。
在本发明中，所述接种至体细胞胚成熟培养基的接种量优选为4-9个/皿，更优选为5个/皿。所述体细胞胚成熟培养基优选为每升基本培养基含有2,4-D 2～7mg、NAA 0.3～0.7mg、蔗糖22～27g和植物凝胶1.5～2.5g。所述培养的条件如下：培养温度为26℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为11h/d，光照的强度为2200～2400lx。光照的强度更优选为2300lx。培养时间优选为180～300d，更优选为200d。
得到鱼雷胚后，本发明挑取所述鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基中萌发培养，获得萌发的体细胞胚(见图3)；所述体细胞胚萌发培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有GA3(赤霉素)0.1～5mg、6-BA 0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；所述培养条件为：培养温度为25～28℃；萌发培养为光暗交替培养；光照的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx。
在本发明中，所述鱼雷胚优选为成熟鱼雷胚。成熟鱼雷胚的长度优选为0.8～1.5cm，更优选为1cm。
在本发明中，所述接种至体细胞胚萌发培养基的接种量优选为1-5个/瓶，更优选为4个/瓶。所述体细胞胚萌发培养基优选为每升基本培养基含有GA3 0.5～4mg、6-BA 0.2～0.7mg、蔗糖30～40g和植物凝胶1.6～2.4g。所述培养条件优选为：培养温度为26℃；所述光照培养的时间为11h/d，光照强度为2200～2400lx。所述培养的时间优选为3.5～4.5周，更优选为4周。
得到体细胞胚后，本发明将所述萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上再生培养，获得完整的再生植株(见图4)；所述植株再生培养基为1/2MS培养基为基本培养基，每升基本培养基含有IBA(吲哚丁酸)0～10mg、NAA 0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；所述再生培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光暗交替培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx。
在本发明中，所述萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上接种量为1～5个/瓶，更优选为4个/瓶。
在本发明中，所述植株再生培养基优选为每升基本培养基含有IBA(吲哚丁酸)2～8mg、NAA 0.3～0.7mg、蔗糖25～40g和植物凝胶1.5～2.5g，pH值为5.8；所述培养条件优选为：培养温度为26℃；培养为光照培养；所述光照培养的时间为11h/d，光照强度为2200～2400lx。MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配制方法见Murashige T,Skoog F(1962)(A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissuecultures.Physiol Plant15:473–497)。1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/2，其余成份不变。所述培养的时间优选为3.5～4.5周，更优选为4周。
下面结合实施例对本发明提供的椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 20mg、蔗糖20g和植物凝胶1g。将蔗糖和植物凝胶添加至基本培养基中混合，调节pH值至5.8，灭菌，将灭菌后的培养液加入过滤灭菌后的2,4-D，混合，得到椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基。
实施例2
一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 100mg、TDZ 10mg、蔗糖30g和植物凝胶2g。将蔗糖和植物凝胶添加至基本培养基中混合，调节pH值至5.8，灭菌，将灭菌后的培养液加入过滤灭菌后的2,4-D和TDZ，混合，得到椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基。
实施例3
一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 80mg、TDZ 4mg、蔗糖25g和植物凝胶3g。将蔗糖和植物凝胶添加至基本培养基中混合，调节pH值至5.8，灭菌，将灭菌后的培养液加入过滤灭菌后的2,4-D和TDZ，混合，得到椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基。
对比例1
以MS培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 80mg、TDZ 4mg、蔗糖25g和植物凝胶3g。按照实施例3的方法制备常规诱导培养基。
实施例4
高效诱导椰子体细胞胚胎发生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体及其处理
采集海南本地高种椰子未成熟的花序作为外植体，先用体积分数50％的酒精水溶液擦拭椰子花序外层2-3次，然后剥掉外层佛焰苞，将椰子幼嫩花序置于超净工作台上，先用体积分数75％酒精水溶液浸泡30s，无菌水冲洗后放入质量分数0.1％HgCl2溶液中浸泡5min，每隔2分钟摇晃1次，无菌水冲洗3次，再用体积分数6％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗5次，获得消毒后的外植体。
(2)胚性愈伤组织的诱导与增殖
用无菌解剖刀将表面消毒处理后的花序切成1.2mm的小片，用无菌镊子放置小片花序分别接种到实施例1～3制备的胚性愈伤组织诱导培养基上进行全暗培养，培养温度26℃。30d后培养物开始膨胀，培养30d后可见分裂旺盛的胚性愈伤组织(图1)，以接种在对比例1中制备的常规诱导培养基为对照组。然后将胚性愈伤组织转接到新的胚性愈伤组织诱导培养基中进行继代增殖培养，获得胚性细胞。每20天转接1次，可维持胚性愈伤的再生能力。
统计诱导成功的胚性愈伤组织的个数，计算胚性愈伤组织的诱导率。
胚性愈伤组织的诱导率结果见表1。
表1实施例1～3和对比例1制备的诱导培养基对诱导结果影响一览表
项目 接种总数 胚性愈伤组织个数 诱导率(100％)
实施例1 50 5 10
实施例2 50 8 16
实施例3 50 18 36
对比例1 50 2 4
实施例5
高效诱导椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体及其处理
采集海南黄矮椰子品种未成熟的花序作为外植体，先用体积分数50％的酒精水溶液擦拭椰子花序外层2次，然后剥掉外层佛焰苞，将椰子幼嫩花序置于超净工作台上，先用体积分数75％酒精水溶液浸泡20s，无菌水冲洗后放入质量分数0.1％HgCl2溶液中浸泡6min，每隔2分钟摇晃1次，无菌水冲洗3次，再用体积分数8％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，获得消毒后的外植体。
(2)胚性愈伤组织的诱导与增殖
用无菌解剖刀将表面消毒处理后的花序切成1.5mm的小片，用无菌镊子放置小片花序到胚性愈伤组织诱导培养基上进行全暗培养，培养温度28℃。20d后培养物开始膨胀，培养30d后可见分裂旺盛的胚性愈伤组织。然后将胚性愈伤组织转接到新的胚性愈伤组织诱导培养基中进行继代增殖培养，获得胚性细胞。每20天转接1次，可维持胚性愈伤的再生能力。所述的胚性愈伤组织诱导培养基成分为，Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)50mg、TDZ(噻苯隆)5mg、蔗糖30g、植物凝胶2g，pH5.8。
(3)体细胞胚的诱导与成熟
取继代培养后180d的胚性细胞，在体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚的发生。培养条件，光照强度1000lx，光照时间10h/d，培养温度28℃。20d后肉眼可见到体细胞胚的出现，到40d时，可见到大量的体细胞胚。挑选体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基，培养条件，光照强度1000lx，光照时间10h/d，培养温度28℃。获得成熟的鱼雷胚。
所述的体细胞胚胎诱导培养基成分为，Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)5mg、TDZ(噻苯隆)2mg、蔗糖30g、植物凝胶2g，pH值5.8。其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
所述的体细胞胚成熟培养基为：Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)2mg、NAA(萘乙酸)0.2mg/L、蔗糖30g、植物凝胶2g，pH值5.8。其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
(4)体细胞胚萌发与植株再生
挑选1cm左右的成熟的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基上培养，光照强度1000lx，光照时间10h/d，培养温度26±2℃，培养4周左右两片鱼雷开始膨大，并开始长出芽和根。萌发后的体细胞胚转移到植株再生培养基上，光照强度1000lx，光照时间10h/d，培养温度28℃，培养4周，进一步发育成为完整的再生植株。
所述的体细胞胚萌发培养基为：Y3培养基为基本培养基，每升含有GA3(赤霉素)0.2mg、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.1mg/L、蔗糖40g、植物凝胶2g。pH5.8，其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
所述的植株再生培养基为：1/2MS培养基为基本培养基，每升含有IBA(吲哚丁酸)0.2mg、NAA(萘乙酸)0.1mg/L、蔗糖40g和植物凝胶2g。pH值为5.8，其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
实施例6
高效诱导椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体及其处理
采集海南本地黄椰子品种未成熟的花序作为外植体，先用体积分数50％的酒精水溶液擦拭椰子花序外层2次，然后剥掉外层佛焰苞，将椰子幼嫩花序置于超净工作台上，先用体积分数75％酒精水溶液浸泡20s，无菌水冲洗后放入质量分数0.1％HgCl2溶液中浸泡6min，每隔2分钟摇晃1次，无菌水冲洗2次，再用体积分数8％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，获得消毒后的外植体。
(2)胚性愈伤组织的诱导与增殖
用无菌解剖刀将表面消毒处理后的花序切成1.5mm的小片，用无菌镊子放置小片花序到胚性愈伤组织诱导培养基上进行全暗培养，培养温度26℃。20d后培养物开始膨胀，培养30d后可见分裂旺盛的胚性愈伤组织，愈伤组织诱导率可达60％以上。然后将胚性愈伤组织转接到新的胚性愈伤组织诱导培养基中进行继代增殖培养，获得胚性细胞。每20天转接1次，可维持胚性愈伤的再生能力。所述的胚性愈伤组织诱导培养基成分为，Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)50mg、TDZ(噻苯隆)5mg、蔗糖30g、植物凝胶2g，pH值5.8。
(3)体细胞胚的诱导与成熟
取继代培养后180d的胚性细胞，在体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚的发生。培养条件，光照强度900lx，光照时间10h/d，培养温度26℃。20d后肉眼可见到体细胞胚的出现，到40d时，可见到大量的体细胞胚。挑选体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基，培养条件，光照强度900lx，光照时间12h/d，培养温度28℃。获得成熟的鱼雷胚。
所述的体细胞胚胎诱导培养基成分为，Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)10mg、TDZ(噻苯隆)2mg、蔗糖25g、植物凝胶2g，pH值5.8。其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
所述的体细胞胚成熟培养基为：Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)2mg、NAA(萘乙酸)0.2mg/L、蔗糖30g、植物凝胶2g，pH5.8。其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
(4)体细胞胚萌发与植株再生
挑选1cm左右的成熟的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基上培养，光照强度900lx，光照时间12h/d，培养温度26℃，培养4周两片鱼雷开始膨大，并开始长出芽和根。萌发后的体细胞胚转移到植株再生培养基上，光照强度1000lx，光照时间10h/d，培养温度25℃，培养4周，进一步发育成为完整的再生植株。
所述的体细胞胚萌发培养基为：Y3培养基为基本培养基，每升含有GA3(赤霉素)0.2mg、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.1mg/L、蔗糖40g、植物凝胶2g。pH5.8，其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
所述的植株再生培养基为：1/2MS培养基为基本培养基，每升含有IBA(吲哚丁酸)0.2mg、NAA(萘乙酸)0.1mg/L、蔗糖40g和植物凝胶2g。pH值5.8，其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
实施例7
高效诱导椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)外植体及其处理
采集海南高种椰子品种未成熟的花序作为外植体，先用体积分数50％的酒精水溶液擦拭椰子花序外层2次，然后剥掉外层佛焰苞，将椰子幼嫩花序置于超净工作台上，先用体积分数75％酒精水溶液浸泡20秒，无菌水冲洗后放入质量分数0.1％HgCl2溶液中浸泡6min，每隔2分钟摇晃1次，无菌水冲洗2次，再用体积分数8％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，获得消毒后的外植体。
(2)胚性愈伤组织的诱导与增殖
用无菌解剖刀将表面消毒处理后的花序切成1.5mm的小片，用无菌镊子放置小片花序到胚性愈伤组织诱导培养基上进行全暗培养，培养温度28℃。20d后培养物开始膨胀，培养30d后可见分裂旺盛的胚性愈伤组织。然后将胚性愈伤组织转接到新的胚性愈伤组织诱导培养基中进行继代增殖培养，获得胚性细胞。每20天转接1次，可维持胚性愈伤的再生能力。所述的胚性愈伤组织诱导培养基成分为，Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)50mg、TDZ(噻苯隆)5mg、蔗糖30g、植物凝胶2g，pH5.8。
(3)体细胞胚的诱导与成熟
取继代培养后180d的胚性细胞，在体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚的发生。培养条件，光照强度1100lx，光照时间10h/d，培养温度25℃。20d后肉眼可见到体细胞胚的出现，到40d时，可见到大量的体细胞胚。挑选体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基，培养条件，光照强度1100lx，光照时间12h/d，培养温度25℃。获得成熟的鱼雷胚。
所述的体细胞胚胎诱导培养基成分为，Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)50mg、TDZ(噻苯隆)5mg、蔗糖20g、植物凝胶3g，pH值5.8。其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
所述的体细胞胚成熟培养基为：Y3培养基为基本培养基，每升含有2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)2mg、NAA(萘乙酸)0.2mg/L、蔗糖30g、植物凝胶2g，pH5.8。其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
(4)体细胞胚萌发与植株再生
挑选1cm左右的成熟的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基上培养，光照强度1100lx，光照时间10h/d，培养温度25℃，培养4.5周两片鱼雷开始膨大，并开始长出芽和根。萌发后的体细胞胚转移到植株再生培养基上，光照强度1100lx，光照时间12h/d，培养温度28℃，培养4周，进一步发育成为完整的再生植株。
所述的体细胞胚萌发培养基为：Y3培养基为基本培养基，每升含有GA3(赤霉素)0.5mg、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.3mg/L、蔗糖30g、植物凝胶2g。pH值为5.8，其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
所述的植株再生培养基为：1/2MS培养基为基本培养基，每升含有IBA(吲哚丁酸)0.2mg、NAA(萘乙酸)0.1mg/L、蔗糖40g和植物凝胶2g。pH值为5.8，其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
最终统计实施例5～7中胚性愈伤组织诱导率，出胚率，出苗率和培养周期。结果见表2。
表2诱导率，出胚率，出苗率和培养周期的信息一览表
诱导率 出胚率 出苗率 培养周期
实施例1 41％ 21％ 7％ 24
实施例2 45％ 22％ 5％ 20
实施例3 60％ 25％ 11％ 18
本发明的培养时间18～24个月，前期的实验已经获得椰子组培苗，后期的规模性的实验还在进行，其中胚性愈伤组织诱导率为41～60％，出胚率为21～25％，出苗率约为7～11％，3个月增殖倍数为2.1，按此计算，100个椰子花序材料，在1个培养周期内，可以获得约400株椰子苗，经过1个周期的初始培养后，每年可培养6000株组培苗。而传统的椰子育苗方法，1个椰子培养成1株椰子苗，培养2～6个月能够发芽，再需要12～18个月苗圃育苗后出圃。因此本技术比传统的育苗技术效率大幅度提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以椰子幼嫩花序作为外植体，将所述外植体消毒后接种至诱导培养基上依次进行诱导培养和继代增殖培养，获得胚性细胞；所述诱导培养和继代增殖培养的温度独立为24～28℃；所述诱导培养和继代增殖培养独立为全暗培养；
所述诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D 50mg、TDZ 5mg、蔗糖30g和植物凝胶2g；
2)将所述步骤1)中的胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚发生，获得体细胞胚；
所述体细胞胚胎诱导培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基还含有2,4-D50mg、TDZ 5mg、蔗糖30g和植物凝胶3g；所述诱导体细胞胚发生的条件如下：所述培养为光暗交替培养，光照强度900～1200lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃；
3)将所述步骤2)中的体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中成熟培养，获得成熟的鱼雷胚；所述体细胞胚成熟培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基还含有2,4-D2mg、NAA0.2mg、蔗糖30g和植物凝胶2g；
所述成熟培养的条件如下：培养温度为25～28℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为10～12h/d，光照的强度为2000～2500lx；
4)挑取所述步骤2)中的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基中萌发培养，获得萌发的体细胞胚；所述体细胞胚萌发培养基以Y3培养基为基本培养基，基本培养基还含有GA30.5mg、6-BA 0.3mg/L、蔗糖30g和植物胶2g；
所述萌发培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光暗交替培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；
5)将所述步骤4)中萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上进行植株再生培养，获得完整的再生植株；
所述植株再生培养基为1/2MS培养基为基本培养基，每升基本培养基含有IBA0.2mg、NAA 0.1mg、蔗糖40g和植物凝胶2g；
所述植株再生培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光照培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述诱导体细胞胚发生的条件如下：光照强度1000lx，光照时间10h/d，培养温度26℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中培养的条件如下：培养温度为26℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为11h/d，光照的强度为2200～2400lx。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中培养条件为：培养温度为26℃；光照培养的时间为11h/d，光照强度为2200～2400lx。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中消毒的方法包括以下步骤：用1号消毒液擦拭椰子幼嫩花序的外层2～3次，然后剥掉外层佛焰苞，将露出的椰子幼嫩花序用2号消毒液浸泡25～35s，冲洗后用3号消毒液浸泡5～6min，冲洗2～3次，再用4号消毒液进行浸泡6～8min，冲洗3～5次，获得消毒后的外植体；
所述1号消毒液为体积分数50％的酒精水溶液；
所述2号消毒液为体积分数75％酒精水溶液；
所述3号消毒液为质量分数0.1％HgCl2溶液；
所述4号消毒液为体积分数6～12％次氯酸钠溶液。
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