KR100883188B1 - 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 호접란의 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리 또는 기저부의 생장점을 포함한 섬유질 부위를 절취하는 단계; 상기 절취된 부위를 젤라이트가 함유된 원괴체(PLB; protocorm like body) 유도용 배지에 치상하는 단계; 및 상기 배지에서 상기 치상된 부위로부터 원괴체(PLB)를 유도하는 단계를 포함하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법 및 상기 방법으로 제조된 호접란 원괴체에 관한 것이다. 본 발명의 원괴체 유도방법은 원괴체 유도 성공율이 높아 농가에서도 쉽게 적용하여 클론묘를 생산할 수 있는 방법으로 생장점이 포함된 줄기조직을 취함으로써 원래 개체는 그대로 유지하면서 증식에 활용할 수 있으므로, 호접란의 특정개체의 대량증식을 위해 호접란의 조직배양에 널리 활용될 수 있다.

Description

호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법{Induction Method of Protocorm like Body from Phalaenopsis Adult Plant}

도 1은 호접란의 유식물체에서 줄기 마디 눈(화경 액아)만을 절취하여 원괴체의 유도, 증식 및 클론묘를 연속적으로 생산하는 과정도이고,

도 2는 호접란의 유식물체에서 절취한 줄기 마디 눈을 원괴체 유도용 배지에 치상한 상태를 나타낸 사진이고.

도 3은 상기 치상된 호접란의 유식물체에서 절취한 줄기 마디 눈으로부터 유도된 호접란 원괴체를 나타내는 사진이고,

도 4는 상기 유도된 호접란 원괴체로부터 증식된 원괴체의 상태를 나타내는 사진이고,

도 5는 상기 도 2 내지 도 5의 호접란 유식물체의 줄기 마디 눈의 치상, 이로부터 유도된 원괴체 및 증식된 원괴체를 비교하여 나타낸 사진이다.

본 발명은 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 호접란의 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리 또는 기저부의 생장점을 포함한 섬유질 부위를 절취하고, 이를 젤라이트가 함유된 원괴체(PLB; protocorm like body) 유도용 배지에 치상하고, 상기 치상된 부위로부터 원괴체(PLB)를 유도하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 관한 것이다.

난과 식물은 단자엽 식물에 속하는 식물학적으로 가장 진화된 식물로서 전 세계적으로 725속에 25,000여 종이나 되는 대단히 많은 종이 있으며, 남ㆍ북극을 제외하고는 지구 전역에 분포되어 있으며 특히 열대 지방에 많다. 열대 지방이 원산인 난들은 화형, 화색이 화려해서 세계 각국의 난 애호가나 전문가들에 의해 재배되고 있으며, 한편 한국, 중국, 일본 등 온대 지방의 난들은 대개 향기가 있고, 식물의 외모에 기품이 있어 예부터 동양인들에게 애호되어 온 것들이 많다(Roberts, L. and Dressler, 1981, Orchids natural history and classification, Havard University, Press London, England, p 1-21).

우리나라에서 자생하고 있는 난의 종류는 100여종이 넘지만 상업적으로 재배되는 난 종류는 수종에 불과하며 그것도 지역적으로 상당히 제한되어 재배되고 있다. 특히, 열대지방이 원산인 난들은 심비디움(Cymbidium), 온시디움(Oncidium), 호접란(Phalaenopsis) 등 몇 가지 종류만 재배되고 있으며 그 중에서도 호접란, 온시디움 등의 묘는 대부분 수입에 의존하고 있다(첨단원예기술개발연구센터, 21세기를 향한 도전, 충북화훼산업, 1996; 첨단원예기술개발연구센터, 화훼재배기술개발 (Ⅰ), 1997, 충북대학교 첨단원예기술개발연구센터). 난의 수입국은 태국, 뉴질랜드, 네덜란드, 싱가폴, 대만, 일본 순이며 호접란은 대만과 태국에서 국내 소비량의 약 50%를 수입하였다.

호접란은 고온 다습한 열대 아시아 지역 특히 인도, 필리핀, 북부오스트레일리아, 인도네시아 지역에서 50여종이 자생하며(Intuwong, O. et al., 1972, Na Okika O Hawaii-Hawaii Orchid J., 1: 13-18), 단경성 착생란(Intuwong, O. et al., 1972, Na Okika O Hawaii-Hawaii Orchid J., 1: 13-18; Tanaka, M. and Y. Sakanishi, 1977, Amer. Orchid Soc. Bull., 46(8): 733; Homma, Y. and T. Asahira, 1985, J. Japan. Soc. Hort. Sci., 54(3): 379-387)으로 꽃의 모양이 나비를 닮았다하여 호접란이라고 불리우며, 우아한 꽃을 가지고 있으며, 아치형의 꽃대 모양을 하고 있고 화색은 백색, 분홍색, 백적색이 주종을 이루고 있으며 잎은 두껍고 넓은 편이다.

호접란의 개화기는 길고 생육이 빨라 실생에서 파종 후 2년 정도에 개화한다. 또한, 고온성 식물로서 겨울에는 18℃ 이상 유지하여야 하며 여름에는 30℃ 이상 고온에 오래두면 생육 장애가 나타난다. 화아분화는 18~22℃에서 20~30일 정도에 촉진된다.

최근 호접란은 많은 양이 재배되고 있으며, 수요도 그에 따라 급격이 늘어나고 있다. 국내외로 절화용, 분화용 등으로 최근 그 수요 및 생산량이 급격히 증가하고 있어 원예적으로 중요한 화훼로 취급되고 있다.

호접란은 재배기간이 짧으며 단위 면적당 재배본수가 많이 들어가기 때문에 좁은 면적에서 대량재배가 가능하지만 현재 영리 재배되고 있는 호접란의 실생묘 재배는 육묘시 묘 손실이 많고 묘의 생육속도 밑 화성유도의 저온감수성이 개체에 따라 달라 목적한 시기에 일제히 개화시키기 어려우며, 화형, 화색, 화수, 화경장 등 주요 형질의 차이로 인해 계획생산과 경영에 어려움이 초래된다(Morel. G.M., 1960, Amer. Orchid Soc. Bull., 29: 495-497).

지난 10년간 호접란은 상업적으로 분화용이나 절화용으로 많은 발전이 있었다.

조직배양에 의한 호접란의 클론 증식(clonal propagation)의 성공은 Rotor(Rotor, G., 1949, Amer. Orchid Soc. Bull., 18: 738-739)의 화경배양으로부터 묘목(plantlet)을 얻음으로써 성공하였고, 이 방법은 여러 학자들에 의하여 연구되었다(Sagawa, Y., 1961, Amer. Orchid Soc. Bull., 30: 808-809; Kotomori, S. and T. Murashige, 1965, Amer. Orchid Soc. Bull., 34: 484-489; Scully, R.M., 1965, Bull, Pacific Orchid Soc., 23: 13-16); Urata, U. and E.T. Iwanaga, 1965, Amer. Orchid Soc. Bull., 34: 410-413; Tse, A.T.U. et al., 1971, Amer. Orchid Soc. Bull., 40: 807-810; Intuwong, O. et al., 1972, Na Okika O Hawaii-Hawaii Orchid J., 1: 13-18; Fu, F.M.L., 1979, Orchids Rev., 87: 308-310; Zimmer, K. and Piper, 1978, Orchid Rev., 86: 223-227; Tanaka, M. and Y. Sakanishi, 1980, Amarin Press, Bankok, p 215-221; Ichihashi, S., 1992, Lindleyana, 7(4): 208-215).

식물조직 배양은 식물체를 영양 번식시키는데 있어서 가장 급속도로 증식시킬 수 있는 효과적인 방법이다. 절편체를 배지에 배양하면 세포 분열이 일어나 다수의 절편체를 분리할 수 있는 세포덩어리(cell cluster)를 형성하고, 이들 조직에서 식물체를 분화시키거나 또는 절편체를 계속 증식시켜 나감으로써 클론 증식이 가능하다. 실제적으로 조직 배양을 통한 클로닝(cloning)이나 미세증식(mocropropagation)은 Haberlande(1902)에 의하여 시작되었지만 1952년까지는 실용화되지 못하였다.

난에 있어서 조직배양법의 적용은 Morel(Morel, G.M., 1960, Amer. Orchid Soc. Bull., 29: 495-497)이 CMV(Cymbidium mosaic virus)에 감염된 심비디움(Cymbidium)의 생장점을 절취하여 배양하였을 때 다른 식물의 생장점 배양에서와 같이 싹과 뿌리가 생겨 개체로 발달하지 않고 생장점이 비대해지면서 기부에 가근(rhozoid)을 가진 소구체(spherule)와 같은 것을 형성하였는데 이들은 그 형태가 난의 종자 발아시 형성되는 원시구경(protocorm)과 유사하여 PLB(protocorm like body; 원괴체)라고 부르게 되었다. 생장점 배양에서 PLB는 잎의 표피나 준표피 세포에서 생긴다(Champagnat, M. et al., 1966, Rev. Gen. Bot., 73: 706-746).

Morel(Morel, G.M., 1960, Amer. Orchid Soc. Bull., 29: 495-497)은 이 PLB를 Knudson C 배지에 치상하여 새로운 PLB를 형성하였다. 이러한 방법의 증식과정은 무한히 반복하여 난을 급속히 다량 증식시킬 수 있어 상업적으로 이용되었다. 현재 육종에서 선발된 우수한 난의 영양계 증식은 거의 이 방법에 의해 이루어지고 있다(한창열, 1982, 식물조직배양, 일조가, p 68-104).

Dilon이 생장점, 즉 분열조직(meristem)으로 증식시킨 것을 영양계 클론(clone)이라 해서 이 생장점 배양법을 메리클론(mericlone)법이라 명명했다(한창열, 1982, 식물조직배양, 일조가, p 68-104). 메리클론 배양에 의해 심비디움, 카틀레야(Cattleya)를 비롯하여 덴드로비움(Dendrobium), 라이카스테(Lycaste), 밀토니아(Miltonia), 오돈톨로섬(Odontolossum), 파이우스(Phaius) 등 여러 종류의 난에서 증식이 가능하게 되었다.

Morel(Morel, G.M., 1964, Amer. Orchid Soc. Bull., 33(6): 473-478)은 Cymbidium, Mitonia, Phaius 등 여러 가지 난과 식물을 조직배양에 의하여 번식시킬 수 있었다. Sagawa와 Shoji(1967)는 Dendrobium 생장점 배양에 성공하였고, Scully(Scully, R.M., 1965, Bull, Pacific Orchid Soc., 23: 13-16)는 Cattleya의 생장점 배양법을 확립하였다.

그 후 Morel(1970), Kunisake 등(Kunisake, J.T. et al., 1972, Amer. Orchid Soc. Bull., 41: 430-439)과 Teo 등(1973)은 Vanda, Phalaenopsis 및 Phynecostylis와 같은 단경성란(monopodial orchid)의 조직배양에 의한 번식을 시도하였다.

Vanda는 측아를 코코낫 물(coconut water)이 15% 들어있는 한천배지에 8주일간 배양하다가 비대해진 눈을 액체배지로 계대해서 2~4주가 지나면 PLB가 증식되는데, 이것을 1~2% 한천배지에 옮기면 식물체가 분화되고 증식이 계속되었다.

한편, Tanaka 등(Tanaka, M. et al., 1975, J. Japan Soc. Hort. Sci., 44(1): 47-58)은 호접란과 Vanda에 생장점 조직 이외의 엽조직을 배양함으로서 PLB를 유지시키는데 성공하였고 Tanaka와 Sakanishi(Tanaka, M. and Y. Sakanishi, 1978, Scientia Hort., 8: 169-178)가 화경에 위치한 액아를 배양하였다.

그 후부터 생장점 이외의 조직을 배양하여 식물체를 분화시키고자 많은 실험이 수행되었다. Scully(Scully, R.M., 1965, Bull, Pacific Orchid Soc., 23: 13-16)는 화경 배양과 화경에 착생해 있는 각 액아를 절취해서 배양을 하였다. 배지로는 Vacin and Went(VW) 배지에 코코낫 우유(coconut milk) 15%를 첨가한 것, Knudson C에 펩톤(peptone)과 코코낫 우유를 첨가한 것 등을 썼다.

호접란 경정 배양에 관한 최초의 학술적 연구는 하와이 대학의 Intuwong과 Sagawa(Intuwong, O. and Y. Sagawa, 1974, Amer. Orchid Soc. Bull., 54: 893-895)에 의해 시도되었는데 모주에서 경정을 적출하여 처음 1개월간 액체 진탕 배양하고 그 후 agar 배지에 배양하여 PLB 유도에 성공하였다. 그러나, 호접란은은 경정의 적출에 의해 모주가 소멸할 위험이 있고, 경정 조직내 페놀성 물질의 과다 침출로 조직이 흑변하여 고사하는 큰 문제점을 가지고 있으므로 이 방법은 일반화되지 않았다. 따라서, 모주에 상처를 주지 않고 배양 재료를 확보할 수 있는 화경절편, 엽절편, 화경액아, 근단 등을 이용하게 되었다.

Tse 등(Tse, A.T.U. et al., 1971, Amer. Orchid Soc. Bull., 40: 807-810)은 화경 배양시 액아가 발육해서 한 개체의 식물체를 형성하는 것이 아니라 다수의 유식물이 형성되는 것을 발견하고 액아를 적출하여 naphtaleneacetic acid(NAA)를 첨가한 Murashige and Skoog(MS) 배지에서 캘러스(callus)를 형성하였고, Koch(Koch, L., 1974, L. Gartenweit, 74: 482-484)는 화장편을 Knudson 액체 배지에 NAA와 6-benzylamionopurine(BA)를 첨가한 배지에서 캘러스를 형성시키는데 성공하였다. Homma와 Asahira(Homma, Y. and T. Asahira, 1985, J. Japan. Soc. Hort. Sci., 54(3): 379-387)는 화경 선단부의 절간 5 ㎜ 길이로 잘라 Thomale GD 배지에 pH 4.8에서 배양하여 PLB를 형성시켰고 Lin(Lin, C.C., 1986, Lindleyana, 1: 158-163)은 화경 절간을 Vacin and Went(VW) 배지에서 배양하여 62.9~77.1%의 식물체에서 PLB가 형성되었다고 보고하였다.

또한, Homma와 Asahira(Homma, Y. and T. Asahira, 1985, J. Japan. Soc. Hort. Sci., 54(3): 379-387)에 의하면 호접란 화경 절편 배양시 액체 배지에서 절편체의 한쪽 부분에서만 PLB 형성이 이루어졌으며 고체 배지에서는 절편체 상단부가 배지에 닿게 치상한 것은 PLB가 전혀 형성되지 않았으므로 이를 통해 화경 조직에서 PLB 형성에 극성이 작용하기 때문이라고 하였다. 그러나, 화경 배양시 개화 후 오래된 화경은 오염율이 높고 액아가 휴면에 들어가 발육이 안되는 문제점이 있어 Tse 등(Tse, A.T.U. et al., 1971, Amer. Orchid Soc. Bull., 40: 807-810)과 Zimmer와 Pieper(Zimmer, K. and Piper, 1978, Orchid Rev., 86: 223-227)는 어린 화경의 액아 배양을 시도하여 오염율을 낮추고 쉽게 증식시킬 수 있었다.

Kotomori와 Murashige(Kotomori, S. and T. Murashige, 1965, Amer. Orchid Soc. Bull., 34: 484-489)는 코코낫 우유 150 ㎖ 첨가한 Vacin and Went(VW) 배지에서 화경액아를 배양하여 유묘를 얻었고 Sagawa(Sagawa, Y., 1961, Amer. Orchid Soc. Bull., 30: 808-809)와 Intuwong와 Sagawa(Intuwong, O. and Y. Sagawa, 1974, Amer. Orchid Soc. Bull., 54: 893-895)도 코코낫 우유 150 ㎖ 첨가한 Vacin and Went(VW) 배지에서 경정과 화경 액아를 배양하여 PLB가 형성되었음을 보고하였다. Withner(Withner, C.C., 1943, Amer. Orchid Soc. Bull., 11: 236-261)가 Paphiopedium 배주 배양에서 코코낫 물과 바나나 즙이, Ernst(Ernst, R., 1967, Amer. Orchid Soc. Bull., 36: 694-704)는 호접란 무균 발아시 코코낫 우유가 원괴체 형성에 효과적이라고 하였으며, Homma와 Asahira(Homma, Y. and T. Asahira, 1985, J. Japan. Soc. Hort. Sci., 54(3): 379-387)는 배지내 100 ㎖의 코코낫 우유 첨가가 PLB 형성에 효과적이라고 보고하였다.

유기된 PLB의 증식을 위해서 Tanaka와 Sakanishi(Tanaka, M. and Y. Sakanishi, 1980, Amarin Press, Bankok, p 215-221)는 설탕(sucrose)이 첨가되지 않고 코코낫 물 200 ㎖가 첨가된 Vacin and Went(VW) 배지에 PLB를 진탕 배양하였을 때 PLB가 증식율이 높았으며, Griesbach(Griesbach, G.J., 1983, Scientia Hort., 19: 363-366)는 효모 추출액 2g/ℓ을 첨가한 MS 액체 배지에서 회전 진탕 배양하였을 때 높은 PLB 증식율을 얻었다. Tanaka 등(Tanaka, M. et al., 1988, Sci. Hort., 35: 117-126)은 코코낫 물 20 ㎖와 한천(agar) 1 g/ℓ를 첨가한 Vacin and Went(VW) 배지에서 횡단 이분할 하였을 때 PLB 증식율을 더욱 높일 수 있었다.

Kobayshi 등(Kobayshi, M. et al., 1990, Bull. Tochigi. Agric. Exp. Stn., 37: 57-70)은 PLB 증식용 배지로 1/2 또는 1/3 MS 배지가 MS 배지보다 PLB 증식에 효과적이라고 하였다. 배지내 산화 방지를 위해 Fu(Fu, F.M.L., 1979, Orchids Rev., 87: 308-310)는 호접란의 원괴체로부터 유모 생육시 활성탄 2 g/ℓ 첨가가 유묘 생장에 효과적이라고 보고하였다. Kimura와 Kurihara(1991)는 PLB 증식을 위하여 hyponex 배지 및 수정 Homma 배지에 활성탄(activated charcoal; AC)을 첨가한 한천 배지가 좋았고 고체 배지보다 액체 배지가 더 좋았다고 보고하였다.

Park(Park, S.J., 1998, Ph.D.Thesis, Graduate School of Kon-kuk Univ.)은 Vacin and Went(VW) 액체 배지가 Phalaenopsis의 PLB 증식율을 위해서 가장 적합한 것으로 30% PLB 증식율을 보여 주었다고 하였다.

이와 같이, 호접란 육종을 통하여 우수한 형질을 가진 개체가 선발될 경우 이 개체의 형질을 그대로 가진 영양개체를 만들어내기 위해 성숙한 개체의 잎(Tanaka and Sakanishi, Bull. Univ. Osaka pref. Ser. B37:1-4, 1985), 뿌리(Tanaka et al., Am. Orchid Soc. Bull. 45:1022-1024, 1976), 화경옆절편(Pieper and Zimmerman, Acta Horticulturae 64: 21-23, 1976), 액아(Zimmerman and Pieper, Orchid Rev. 86:223-227, 1978), 화경절간 절편체(Lin, Lindleyana, 1: 58-65, 1986) 등을 이용한 조직배양이 응용되고 있다. 그러나, 잎과 뿌리조직을 이용하는 경우에는 원괴체(PLB) 유도 성공율이 낮고, 시간이 많이 걸리며, 조직자체의 오염과 다량의 갈변물질의 발생으로 대량증식에 어려움이 많다(Arditti et al., Orchid Rev. 89: 49-52, 1981).

따라서, 일반적으로 다른 난에서는 생장점배양을 통해서 대량증식을 하고 있지만, 호접란은 조직 배양묘 생산에 대해 연구가 많이 시도되고 있으나 호접란은 단경성란이기 때문에 생장점배양이 실패할 경우는 그 식물체가 없어짐을 의미하여 생장점의 적출에 의해 모주가 소멸할 위험이 있고, 생장점 조직내 페놀성 물질의 과다 침출로 조직이 흑변하여 고사하는 문제점이 있다. 이에, 생장점배양 대신 위에서 언급한 다양한 조직을 이용하여 원괴체 유도에 응용하고 있다. 생장점 배양은 현미경하에서 아주 작은 생장점만을 떼어내는 숙련된 기술이 필요하며 더욱이 호접란 생장점 배양의 경우에는 성공률이 매우 낮아 실제로는 거의 쓰이지 않고 있다(Arditti and Ernst, Micropropagation of Orchids, 467-520, 1993). 생장점배양 대신 엽원기를 붙인 Shoot tip(생장점 선단조직)을 이용한 원괴체 유도 방식(Intuwong and Sagawa, Am.Orchid Soc. Bull. 43: 893-895, 1974)이 개발되기도 했지만 엽원기를 포함한 생장점 부위를 떼내기 위해 여전히 번거로운 절차를 거쳐야 하는 제한점이 있어 많이 응용되지 않고 있다.

따라서, 모주를 희생하지 않고 배양 재료를 확보하는 화경조직절편(Homma, Y. and T. Asahira, 1985, J. Japan. Soc. Hort. Sci., 54(3): 379-387), 엽절편(Tanaka, M. et al., 1975, J. Japan Soc. Hort. Sci., 44(1): 47-58), 화경액아(Tse, A.T.U. et al., 1971, Amer. Orchid Soc. Bull., 40: 807-810; Ichihashi, S., 1992, Lindleyana, 7(4): 208-215), 근단(Kazuo, et al., 1988) 등을 이용하는 방법이 개발되어 왔다. 그러나, 이 방법들은 배양 중에 일어날 수 있는 변이의 원인물질로 의심되고 있는 고농도의 식물 호르몬을 사용하거나 또는 원괴체 유도 성공률이 매우 낮으며 증식의 어려움 등이 있어 실용화 하는데 많은 문제점이 있다.

그 외 화경절간 절편체와 화경액아 배양의 방법은 원괴체 성공률이 비교적 높은 것으로 알려져 있으나(Ichihashi, Phalaenopsis, 68-94, 1993) 이들은 주로 어린 화경을 이용하는 것이 성공율이 높은데 우수한 개체를 선발시에 개화를 완전히 시켜 표현형을 관찰하고 액아와 화경을 채취해야 하므로 역시 시간적 제약과 항상 다량의 시료를 공급받을 수 없다는 것이 문제점으로 지적된다.

그러므로, 보다 쉽고 PLB 유도 성공율이 높은 새로운 방법의 개발과 PLB 유도에서 또 다른 장애요소가 되는 조직배양시 발현되는 페놀성 유해물질의 발생과 축적을 완화시킬 수 있는 배지와 배양방법의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 호접란의 대량생산 체계를 확립하기 위하여 효과적인 대량번식 기술을 확립하고자 수행하고자 노력하던 중, 호접란의 원괴체를 유도하기 위하여 호접란 유식물체의 줄기 마디 눈을 이용하고, 이것을 다양한 변형된 VW 배지에 치상함으로써 효과적으로 원괴체를 유도할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 호접란의 대량증식을 위한 조직배양에 이용하는 호접란의 원괴체 유도방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유도방법으로 제조된 호접란 원괴체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호접란의 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리 또는 기저부의 생장점을 포함한 섬유질 부위를 절취하는 단계; 상기 절취된 부위를 젤라이트가 함유된 원괴체(PLB; protocorm like body) 유도용 배지에 치상하는 단계; 및 상기 배지에서 상기 치상된 부위로부터 원괴체(PLB)를 유도하는 단계를 포함하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 호접란 원괴체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ⅰ) 호접란의 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리 또는 기저부의 생장점을 포함한 섬유질 부위를 절취하는 단계; ⅱ) 상기 절취된 부위를 젤라이트가 함유된 원괴체(PLB; protocorm like body) 유도용 배지에 치상하는 단계; 및 ⅲ) 상기 배지에서 상기 치상된 부위로부터 원괴체(PLB)를 유도하는 단계를 포함하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법을 제공한다.

상기 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 있어서, 상기 절취되는 부위는 줄기의 마디 눈(화경 액아)이고, 이를 손실되지 않도록 절취하는 것이 바람직하다. 또한, 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 있어서, 상기 절취되는 부위의 원괴체 유도배치에 치상은 사면배지에서 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 있어서, 상기 원괴체 유 도용 배지는 VW(Vacin and Went) 변형 배지인 것이 바람직하고, 상기 VW 변형 배지는 VW 배지성분 이외에 코코낫, 설탕(sucrose) 및 젤라이트를 포함하는 것이 보다 바람직하고, 상기 VW 변형 배지는 배지 1 ℓ에 대하여 설탕 농도가 0.1 내지 20 g인 것이 보다 더 바람직하고, 상기 VW 변형 배지는 배지 1 ℓ에 대하여 설탕 농도가 1 내지 10 g인 것이 매우 바람직하다.

또한, 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 있어서, 상기 VW 배지는 VW 배지 1.63 g, 코코낫 150 g 설탕(sucrose) 1 내지 10 g 및 젤라이트 4 g을 함유하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법에 있어서, 상기 원괴체 유도는 치상된 부분에서 싹이 생성될 때마다 이것을 절단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 싹을 절단하여 제거함으로써, 상기 제거된 부위의 잔존 부위가 육질형태의 특성으로 전환된다.

호접란의 대량증식을 위해서는 원괴체(protocorm like body)를 이용한 조직배양을 이용하는 것이 바람직하다. 그런데, 이러한 조직배양을 위해서는 우수한 품종을 선택하는 것뿐만이 아니라, 유식물체의 치상 부위, 치상 부위로부터 원괴체를 유도하는 배지 등을 주의하여 선택하여야 한다. 지금까지, 원괴체를 유도하는데 있어서, 유식물체의 치상 부위는 잎, 뿌리, 줄기, 기저부 등 다양하게 이용되어 왔다. 또한, 유도배지에는 통상적으로 hyponex 배지 또는 MS 배지를 이용하고, 여기에 BA(benzyladenine hormone)을 첨가하여 진행되어 왔다.

본 발명자들은 다양한 테스트에 의하여 호접란의 치상부위로 어떠한 조직이 적합한 지를 조사하고, 특히 줄기 마디의 눈(화경 액아) 부위가 원괴체 유도에 효율적임을 확인하였다. 또한, 줄기 마디 눈의 섬유질 부위를 절단함으로써, 상기 절단된 부위에서 육질 부위가 생성되도록 유도하고, 그로부터 원괴체를 유도하는데 훨씬 효과적임을 발견했다. 구체적으로, 상기 화경 액아 부분의 절단은 가능한 한 액아의 손실부분 없이 작게 절단하는 것이 요구된다. 또한, 상기 섬유질 부위가 절단되면, 상기 부위가 육질 형태로 전환되어 일반 식물의 캘러스(callus)와 유사하며, 이것을 치상하며 효과적으로 원괴체로 전환된다.

상기 절단된 유식물체의 화경 액아 부분을 사면배양 배지에 치상하고, 여기에서 원괴체를 유도한다. 이때, 싹이 생성되는 경우 계속적으로 이것을 제거하여 유식물체로 성장하는 것을 방해하는 것이 요구된다.

상기 원괴체 유도 배지는 통상의 널리 이용되는 hyponex 배지를 이용하는 것이 아니라 변형된 VW 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 변형된 VW 배지는 배지의 고형화를 위해 응고제로 통상 사용되는 한천(agar)이 아니라 젤라이트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 일반적으로 원괴체 유도를 위해 벤질아데닌(BA; benzyladenine) 호르몬을 널리 사용하는데, 상기 BA 호르몬은 호접란으로부터 변이체를 발생하는 부작용이 있으므로 이를 방지하기 위하여, 본 발명에서는 이를 첨가하지 않아도 효율적으로 원괴체 생성이 유도되도록 BA 호르몬을 첨가하지 않는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 유도된 호접란 원괴체를 원괴체 증식용 배지에서 증식시키는 것을 특징으로 하는 호접란 원괴체의 증식방법을 제공한다.

상기 호접란 원괴체의 증식방법에서 이용된 증식용 배지에는 무기염 농도를 상당량 감소시키는 것이 바람직하고, 트립톤을 포함하는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 배지에는 탄수화물은 통상적인 양을 포함시켜도 무방하다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 호접란 원괴체를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 내지 실시예 8 > 줄기 마디 눈(화경 액아) 배양을 통한 원괴체 유도

호접란 중에서 Dtps. Purple Gem(Dor. pulcherrima X Phal. equestris)를 선발하여 도 1에 나타낸 바와 같이 유식물체에서 줄기 마디 눈(화경액아) 부분을 가능한 한 손실없이 절취한 뒤 다시 2∼4개의 작은 절편체를 만들었다. 이때, 섬유질로 된 기부는 육질 형태로 전환되었다. 이것을 다양한 탄수화물 농도의 원괴체유도 배지(표 1)에 치상하여 원괴체를 유도한 결과, 탄수화물 농도, 특히 배지 내의 설탕의 농도가 10 g/ℓ 까지는 원괴체 유도 성공률이 높게 유지되었다(실시예 1 내지 실시예 4).

또한, Phal. Taisuco Snowdian 'Snow'(Phal. Taisuco Snow X Phal. Taisuco Kochdian) 품종으로부터 상기 과정과 동일하게 다양한 탄수화물 농도의 원괴체유도 배지(표 1)에 치상하여 원괴체를 유도한 결과, 탄수화물 농도, 특히 배지 내의 설탕의 농도가 10 g/ℓ 까지는 원괴체 유도 성공률이 높게 유지되었다(실시예 5 내지 실시예 8).

원괴체 유도용 VW 배지(배지 1 ℓ당)(품종 Dtps. Purple Gem)

성분	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4
VW 성분	1.63 g	1.63 g	1.63 g	1.63 g
코코낫	150 g	150 g	150 g	150 g
설탕(sucrose)	0.5 g	2.5 g	10 g	25 g
젤라이트	4 g	4 g	4 g	4 g

원괴체 유도용 VW 배지(배지 1 ℓ당)(품종 Phal. Taisuco Snowdian 'Snow')

성분	실시예 5	실시예 6	실시예 7	실시예 8
VW 성분	1.63 g	1.63 g	1.63 g	1.63 g
코코낫	150 g	150 g	150 g	150 g
설탕(sucrose)	0.5 g	2.5 g	10 g	25 g
젤라이트	4 g	4 g	4 g	4 g

< 실시예 9 > 호접란 조직별 원괴체 유도

호접란의 다양한 조직을 상기 표 1에 기재된 배지에 치상하여 원괴체를 유도하였다. 그 결과, 줄기 마디 눈 조직은 다른 조직을 이용한 방법에 비교해서 매우 높은 성공률을 나타내고 있다(표 3).

호접란 조직배양에서 치상조직별 원괴체 유도 성공률

품종	치상조직	치상수	생존수	원괴체 유도수(%)
Dtps. Purple Gem	근단	40	28	2(5.0)
	화경엽 절편	40	24	4(10.0)
	성숙엽 절편	40	21	0(-)
	와경절간 절편	40	27	1(2.5)
	줄기 마디 눈(화경액아)	40	38	35(87.5)
Phal. Taisuco Snowdian 'Snow'	근단	40	19	0(-)
	화경엽 절편	40	15	0(-)
	성숙엽 절편	40	22	0(-)
	와경절간 절편	40	24	2(5.0)
	줄기 마디 눈(화경액아)	40	39	36(90)

< 실시예 10 > 배지에 따른 원괴체 유도

본 발명에 이용된 VW 변형 배지와 비교하여 통상적으로 널리 이용된 MS 배지와 원괴체 성공률을 비교하였다(표 4). 그 결과, 본 발명의 줄기 마디 눈(화경 액아)은 변형된 VW 배지에서는 원괴체 유도가 힘든 것으로 알려진 유색계 계통에서도 높은 원괴체 성공률을 나타내었을 뿐 만 아니라 품종에 큰 구애를 받지 않고 높은 원괴체 유도율을 나타내었다(표 4).

호접란 조직배양에서 유도 배지에 따른 원괴체 유도 성공률

품종	변형된 VW 배지(표 1 조성과 동일)	MS 배지
Dtps. Purple Gem	87.5%	-
Phal. Taisuco Snowdian 'Snow'	90.0%	2%

< 실시예 11 > 응고제의 배지 조성에 따른 원괴체 유도

본 발명자들은 상기 변형된 VW 배지를 기초로 응고제로 한천 또는 젤라이트를 사용한 경우의 호접란의 원괴체 유도 성공률의 변화를 테스트 하였다(표 5).

원괴체 유도용 VW 배지의 응고제로 한천과 젤라이트에 따른 원괴체 유도 성공률(품종 Dtps. Purple Gem)(기본적 조성은 표 1과 동일하다)

응고제	원괴체 유도 성공률
한천	15 %
젤라이트	87. 5%

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 원괴체 유도방법은 줄기 마디 눈만을 절취하여 원괴체의 유도와 증식 그리고 클론묘를 연속적으로 생산하는 기술을 응용함으로써 클론묘의 순환적 연속대량증식의 체계를 구축할 수 있어 우수 개체를 희생시키지 않고 영양번식 할 때 응용될 수 있으며, 플라스크묘의 대량 연속증식, 화경배양유래의 유식물체를 이용한 원괴체 유도 등 호접란 조직배양에 널리 활용될 수 있다.

Claims (10)

1. ⅰ) 호접란의 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리 또는 기저부의 생장점을 포함한 섬유질 부위를 절취하는 단계;

   ⅱ) 상기 절취된 부위를 VW 성분 1.63 g, 코코낫 150 g, 젤라이트 4 g 및 1 내지 10 g/ℓ의 설탕(sucrose)을 포함한 VW(Vacin and Went) 변형 배지인 원괴체(PLB; protocorm like body) 유도용 배지에 치상하는 단계; 및

   ⅲ) 상기 배지에서 상기 치상된 부위로부터 원괴체(PLB)를 유도하는 단계를 포함하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 절취되는 부위는 줄기의 마디 눈(화경 액아)이고, 이를 손실되지 않도록 절취하는 것을 특징으로 하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 절취되는 부위의 원괴체 유도배지에 치상은 사면배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1항에 있어서, 상기 원괴체 유도는 치상된 부위에서 싹이 생성될 때마다 이것을 절단하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 호접란 유식물체로부터 원괴체의 유도방법.
10. 삭제

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