KR101839997B1 - 체세포배발생을 통한 음나무 노령목의 대량번식방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 음나무(약 700년생)를 재료로 2년생 음나무 실생 대목(stock)에 접목하여 접목묘를 육성하고 이것의 신초 줄기의 엽(leaf) 및 엽병(petiole)을 절편으로 체세포배발생 조직을 유도하여 식물체를 대량으로 복제 생산하는 음나무의 대량번식방법에 관한 것으로, 소멸해가는 유용한 산림자원의 보존 복원 및 산업적 이용가능성을 제시하고 있으며, 기타 음나무 천연기념물, 성숙목 활엽수의 배양, 희귀 및 멸종위기 식물의 기내번식에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.

Description

체세포배발생을 통한 음나무 노령목의 대량번식방법{Method for mass propagation technique using somatic embryogenesis in very old Kalopanax septemlobus tree}

본 발명은 체세포배발생을 통한 노령목 음나무의 대량번식방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 음나무 노목으로부터 얻은 절편을 표면살균한 후 조직배양 하여 체세포배발생 조직을 유도하는 단계; 유도된 배발생조직을 배양하여 배발생조직을 유지 및 증식시키는 단계; 유지 및 증식된 배발생 조직을 배양하여 체세포배(somatic embryo)를 유도하는 단계; 체세포배를 배양하여 발아 및 식물체를 유도하는 단계를 포함하는 노령목 음나무의 대량번식방법에 관한 기술이다.

본 발명은 체세포배발생을 통한 노령목 음나무의 대량번식에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연기념물 305호 청원음나무(약 700년생)를 2년생의 음나무에 접목하여 육성한 다음 신초지의 엽 및 엽병을 절편으로 체세포배발생 조직을 유도하여 체세포배유도, 발아 및 식물체를 재생시키는 노령목 음나무의 대량번식방법에 관한 것이다.

체세포배 유도는 조직배양 기술을 응용하여 시험관 내에서 인위적으로 배(embryo, 胚)를 유도한 다음 일련의 배 발달 과정을 거쳐 식물체를 형성하는 기술로 조직배양의 번식기술 가운데 가장 효율이 높은 기술이다. 체세포배 유도기술은 1958년 Steward 등이 당근의 배양세포에서 관찰한 것이 최초이며, 수목류에서는 감귤류(비특허문헌1), Biota orientalis(Konar and Oberoi, 1965), Santalum album(Rao, 1965), Zamia integrifolia(Norstog, 1965) 등의 수종에서 보고되었다.

1985년에는 침엽수종인 독일가문비나무(Picea abies)에서 체세포배가 유도되고 그 후 임목의 체세포배 유도의 연구는 폭발적으로 증가하여 현재까지 150종 이상의 수목류에서 체세포배 유도 결과가 보고되고 있다(Dunstan et al. 1995).

그러나 체세포배 기술은 단세포로부터 완전한 식물체로까지 분화 가능한 획기적인 기술임에도 불구하고 아직도 해결해야 할 많은 문제가 있는데, 그 중에서 가장 어려운 점이 성숙목의 절편으로부터 배발생 조직을 유도하는 것이다(Bodhipadma and Leung, 2002; Dai et al. 2004).

배발생 조직의 유도는 배양하는 조직(tissue)의 유시성(juvenility)과 밀접한 관계가 있고(Bonga 2004; Capuana and Debergh 1997; Chalupa 2000; Feher et al. 2003; Merkle et al. 1997, 1998, 2000, 2003), 이로 인해 접합자배로부터 식물체로 발달해가는 과정에서 보다 유시적인 배양재료를 선택하여 기내 배양조건의 적정화를 통해 배발생 조직을 얻는 것이 가장 중요한 요인의 하나로 자리 잡고 있다(Merkle and Battle, 2000).

따라서 식물에서 보다 어린 조직을 선택하여 배발생조직을 유도하는 것이 중요하며(Raemakers et al. 1999; Sharp wt al. 1980; Vendrame et al. 2001; Vookova et al. 2003), 최근에는 여러 가지 재유령화 기술 적용 및 스트레스 처리를 통해 성숙목으로부터 배발생을 유도하는 기술이 개발되고 있다(Blasco M, 2013; von Aderkas P and Bonga JM, 2000).

음나무가 속해 있는 두릅나무과 식물에서는 두릅나무, 음나무에 대한 체세포배 유도연구가 본 발명자들 등에 의해 개발된 바 있다. 두릅나무는 유묘의 신초 및 10년생의 동아지를 절편으로 체세포배발생 조직을 유도한 식물체 재생기술이 개발되었고(Moon and Youn, 1999 ), 음나무에 대해서는 액아절편으로부터의 줄기 유도기술(Moon et al. 2002), 종자로부터의 체세포배발생 유도기술(Moon et al. 2005), 유전자형에 따른 체세포배 유도기술(Park et al. 2011) 및 40년생 음나무로부터 스트레스 처리에 의한 체세포배 배발생 유도기술 등이 최근에 개발되었다(Moon et al. 2015).

하지만 수백년된 음나무의 노령목으로부터 체세포배발생 조직을 유도하여 식물체를 재생한 결과는 아직까지 발표된 바 없다. 이에 본 발명자는 지금까지 기내배양이 어려웠던 노령목을 대상으로 접목묘 신초지의 엽 및 엽병으로부터 체세포배발생 조직을 유도하여 음나무 노령목의 대량번식방법을 제공하고자 한다.

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본 발명의 목적은 첫째, 유시적인 묘목을 이용한 종래기술과 달리 노령화된 식물종인 청원음나무(약 700년생)을 재료로 체세포배를 유도하여 노령목 음나무의 대량번식방법을 제공하는 것이고, 둘째, 상기 대량번식방법에 의해 얻은 음나무를 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여,

(a) 노령목 음나무 접목묘의 신초지 엽 및 엽병 절편을 표면살균 후 체세포배발생 조직을 유도하는 단계;

(b) 상기 유도된 체세포배발생 조직을 배양하여 증식시키는 단계;

(c) 상기 증식된 체세포배발생 조직에서 체세포배를 유도하는 단계;

(d) 상기 유도된 체세포배를 배양하여 발아 및 식물체를 유도하는 단계를 포함하는 음나무 노령목의 대량번식방법을 제공한다.

본 발명은 지금까지 기내배양이 어려웠던 천연기념물 305호 ‘청원음나무’ 노령목으로 대상으로 접목묘 신초지의 엽 및 엽병으로부터 체세포배발생 조직을 유도하고, 배발생 캘러스를 유지 및 증식시키며, 이것을 재료로 체세포배 유도, 성숙 및 발아과정을 통하여 완전한 식물체를 유도할 수 있다.

이러한 결과를 토대로 보존가치가 큰 천연기념물 음나무의 복제 증식 및 복원이 기대되며, 특히 배발생 조직의 초저온저장을 통한 생식질 보존이 가능하여 소멸해가는 유전자원의 현지 외 증식 및 보존이 가능하다.

아울러 다른 천연기념물 음나무와 유사한 활엽수종의 기내번식 기술 개발로 본 발명의 자료가 유용하게 활용될 수 있을 것이며, 배발생 세포라인을 이용한 유전자 삽입 등 첨단 생물공학 기술의 응용에도 활용이 가능하다.

도 1은 청원음나무’노령목(천연기념물 305호, 약 700년생)의 사진이다.
도 2는 청원음나무를 2년생 음나무 실생 대목에 접목하여 신초가 자라는 사진이다.
도 3은 청원음나무 접목묘 신초지의 잎에서 유도된 체세포배발생 조직의 사진이다.
도 4는 체세포 배발생조직에서 유도된 체세포배(somatic embryo)의 사진이다.
도 5는 체세포배가 발아(germination)되어 식물체로 재생된 사진이다.
도 6은 체세포배로부터 유도된 식물체를 인공상토에 이식하여 순화된 사진이다.
도 7은 인공상토에서 순화된 묘목을 토양에 이식하여 생장한 2년생 묘목의 사진이다.

본 발명은 체세포배발생을 통한 음나무 노령목의 대량번식방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는

(a) 노령목 음나무 접목묘의 신초지 엽 및 엽병 절편을 표면살균 후 체세포배발생 조직을 유도하는 단계;

(b) 상기 유도된 체세포배발생 조직을 배양하여 증식시키는 단계;

(c) 상기 증식된 체세포배발생 조직에서 체세포배를 유도하는 단계;

(d) 상기 유도된 체세포배를 배양하여 발아 및 식물체를 유도하는 단계를 포함한다.

바람직하게는 상기 신초지는 당년생인 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는 상기 절편의 표면살균은 당년생 신초지가 약 5cm로 자랐을 때 엽 및 엽병을 잘라서 250ml 삼각플라스크에 넣고 트윈 20을 첨가하여 흔들어 거품을 낸 다음 수돗물로 씻어낸 후, 무균상에서 1) 70% 에탄올에 3분 동안 침지하고, 2) 트리톤X-100이 첨가된 2%(w/v) 차아염소산나트륨(NaClO) 용액에 침지하여 15분 동안 살균한 후, 3) 멸균된 증류수로 5회 세척하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 트리톤X-100은 2%(w/v) 차아염소산나트륨(NaClO) 용액에 0.01~0.05%로 첨가하는 것임을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기의 살균과정 2) 및 3)에서 살균효과를 높이기 위해 알코올램프를 이용하여 약 40~50℃ 정도로 가온하는 상태로 흔들어 주며 표면살균을 실시하는 것을 특징으로 할 수 있다.

체세포배발생 조직의 유도는 상기 엽과 엽병을 절편으로 1mm 이하의 두께로 예리한 해부용 칼로 절단하여 1.0㎎/L 2,4-D, 3% 슈크로즈, 1g/L L-글루타민 및 0.2~0.5% 젤라이트가 포함된 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 치상하여 암배양의 조건에서 4주~16주 동안 배양하는 것을 포함할 수 있다.

상기에서 유도된 체세포배발생 조직의 유지 및 증식은 1.0~2.0㎎/L 2,4-D, 2~5% 슈크로즈, 1g/L L-글루타민, 0.2~0.5% 젤라이트를 포함된 MS 배지에서 3~4주간의 계대배양 주기로 암배양하는 것을 포함할 수 있다.

상기 체세포배발생 조직에서 체세포배의 유도는 0.1mg/L 에브시식산(ABA,absicsic acid), 7% PEG-40000, 5% 슈크로즈, 0.05% 활성탄이 포함된 1/2MS 배지에서 명배양하여 체세포배를 유도하는 것을 포함할 수 있다.

상기 체세포배의 발아 및 식물체의 유도는 상기 (c)방법으로 유도된 어뢰형배(torpedo stage embryo) 또는 초기자엽형(early cotyledonary stage embryo)의 체세포배를 생장조절물질이 처리되지 않은 1/2MS 기본배지(Murashige and Skoog, 1962) 혹은 1/2MS 배지에 0.5~1.0mg/L 지베렐릭산(GA₃), 3% 슈크로즈, 0.3% 젤라이트가 함유된 배지에서 명배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 음나무 노령목의 대량번식방법은 상기(d)단계에 의해 유도된 어린 식물체를 인공상토에 이식하여 순화시킨 후 포지에 이식하여 묘목을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 어린 식물체의 순화는 식물체를 배지에서 조심스럽게 꺼내어 젤라이트를 물로 씻어내고, 인공상토(peatmoss: perlite: vermiculite 1:1:1 v/v/v) 에 이식한 다음 90~95%의 고습도가 유지되는 순화실에서 순화시키는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 음나무 노령목의 대량번식방법에서, 음나무 노령목은 청원음나무인 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 음나무 노령목의 대량번식방법에 의해 번식된 음나무를 제공한다.

본 발명은 천연기념물 305호 청원음나무의 효율적인 기내번식 방법을 연구하기 위하여 청원음나무 접목묘의 신초지 엽 및 엽병으로부터, ①체세포배발생 조직의 유도에 미치는 적정 배지 및 생장조절제의 조건 확인, ②배발생 조직의 유지 및 증식을 통해 체세포배 유도 빈도 조사, ③체세포배의 성숙, 발아 및 식물체 재생에 미치는 지베렐릭산(GA₃)의 효과 비교 및 ④재분화된 어린 식물체의 토양순화 및 묘포이식을 통한 생장 조건을 구명하고자 하였다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 구체적인 실시예를 통하여 설명하였으나, 본 발명의 공시재료와 유사한 다른 수종의 체세포배형성(somatic embryogenesis)을 이용한 식물체 생산의 권리범위는 아래에서 설명한 실시예에만 국한되지 않는다.

실시예 1. 절편의 채취

절편으로 천연기념물 305호 청원음나무의 접목묘 신초지를 사용하였으며, 2012년 3월 온실에서 당년생 신초줄기가 약 5cm로 자랐을 때 채취하였다. 줄기는 채취 즉시 실험실로 운반하여 표면살균 후 준비된 배지에 치상하였다.

실시예 2. 배양을 위한 표면살균

표면살균은 식물 조직배양의 일반적인 방법으로 실시하였다. 본 발명에서는 엽과 엽병을 250ml 삼각플라스크에 넣고 트윈(Tween) 20이 0.03% 포함된 수돗물로 흔들어 거품을 낸 후 완전히 씻어낸 다음 무균상 안에서 다음과 같이 표면살균하였다.

1) 절편을 70% 에탄올에 3분간 침지하고 에탄올을 따라낸 다음, 2) 0.03% 트리톤(Triton) X-100이 첨가된 2% NaClO 용액으로 옮겨 15분간 표면 살균한 다음, 3) 마지막으로 멸균증류수로 5회 세척하였다.

이상의 살균과정 2) 및 3)항에서는 살균효과를 높이기 위해 알코올램프를 이용하여 40~50℃로 가온한 상태로 흔들어 주며 표면살균을 실시하였다.

표면살균 후에는 멸균증류수로 5회 씻어내고 다시 멸균증류수에 30분 이상 침지하고 현미경 하에서 예리한 해부용 칼로 엽은 엽맥을 중심으로 1mm 이하의 두께로 박편(thin section)으로 만들고, 엽병도 환(ring)이 생기도록 1mm 이하로 박편 절단한 다음 준비한 배지에 바로 치상하였다.

실시예 3. 배발생조직 유도를 위한 배지 조성 및 조제

엽 및 엽병 조직에서 체세포 배발생조직을 유도하기 위한 배지로는 식물조직배양에서 일반적으로 사용하고 있는 MS배지(Murashige and Skoog, 1962)를 사용하여 탄소원으로 4-5% 수크로오스, 경화제로는 0.3~0.5% 젤라이트(gelrite)를 처리하여 사용하였다.

여기에 아미노산으로 1,000㎎/L L-글루타민(Sigma)을 처리하고, 식물생장조절물질로서 1.0㎎/L 혹은 2.0㎎/L 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)를 단독처리하였다.

산도는 5.8로 조정하였다. L-글루타민은 배지의 열 소독이 끝난 후 배지의 온도가 50℃ 정도로 식었을 때 필터 하여 따로 첨가하였고, 배지의 분주는 87×15㎜ 크기의 플라스틱 페트리디쉬 (녹십자)에 20㎖씩 분주하여 상온에서 하룻밤 동안 굳힌 후 사용하였다.

실시예 4. 배발생 조직의 유도 및 증식

초대배양 후 절편으로부터 오염은 발생되지 않았다. 배양기간이 2주 이상 경과되면서 치상된 절편이 다소 부풀어 오르고 절단면에서 캘러스 형성이 시작되었다.

초대배양 4주 후에는 실시 예 3의 동일한 배지로 계대하였다. 초대배양 8주 후에는 갈변화되어 고사되는 절편이 나타나고 절단면에서 단단한 비배발생 캘러스가 유도 되었다.

완전한 형태의 체세포배발생 조직은 배양 12주 이후에 관찰되었다. 대부분 갈변 고사되는 절편의 일부에서 연노랑색의 깨어지기 쉬운 음나무의 전형적인 배발생 캘러스가 유도되었다.

하기 표 1(청원음나무 성숙목 접목묘로부터 체세포배 발생 조직유도)에 나타난 것처럼 배발생 조직의 유도빈도는 매우 낮아서 절편에 따라 0.05~0.45%까지 유도되었다.

한편 유도된 배발생 조직은 1,000㎎/L L-글루타민, 1.0㎎/L 2,4-D, 3% 슈크로즈, 0.5% 젤라이트가 처리된 MS 배지에 3주의 간격으로 계대배양하여 배발생 조직을 증식하였다. 배양은 온도 25±2℃로 유지되는 배양실에서 암배양(darkness culture)하였다.

실시예 5. 체세포배의 유도

배발생 조직으로부터 체세포배 유도를 위해 염류의 양을 반으로 줄인 1/2MS배지에 20g/L 슈크로즈, 0.02% 활성탄, 0.3% 젤라이트가 첨가된 배지에 에브시식산(ABA)을 0.1㎎/L 처리하였다.

약 0.5g의 배발생 캘러스를 각각의 1회용 샤레에 이식하고 배양 4주 후 어뢰형에서 초기 자엽형까지 유도된 체세포배를 조사하였다. 배양은 온도 25±2℃, 1일 16시간 조명(40μ㏖ m^-2 s^-1)하의 배양실에서 수행되었다.

하기 표 2는 청원음나무 노령목 배발생 세포로부터의 체세포배 유도 빈도를 나타낸 것이다.

실시예 6. 체세포배의 발아 및 식물체 형성

상기 실시예 5에서 초기 자엽형 까지 자란 배를 선발하여 지베렐릭산(GA₃)이 처리된 1/2MS 배지에 3% 슈크로즈, 0.3% 젤라이트를 처리하여 발아 및 식물체 형성을 시험하였다.

지베렐릭산(GA₃)은 필터(filtering) 처리하여 배지에 첨가하였고, 재분화된 어린 식물체는 1/2MS 배지(10x5㎝의 배양병, 30㎖의 배지)에 계대배양 하여 생장을 촉진하였다. 배양은 온도 25±2℃, 1일 16시간 조명(40μ㏖ m^-2 s^-1)하의 배양실에서 수행되었다.

하기 표 3은 배발생 세포로부터 유도된 체세포배의 발아율 및 식물체 재생율을 나타낸 것이다.

실시예 7. 토양이식 순화 및 포지이식 생장

상기 실시예 6에서 체세포배로부터 발아하여 재분화된 어린 식물체(약 7~10㎝ 내외)는 배양용기에서 꺼내어 뿌리에 묻은 젤라이트를 수돗물로 조심스럽게 씻어내고 인공상토에 이식하였다.

상토는 피트모쓰(peatmoss), 펄라이트(perlite) 및 버미큘라이트(vermiculrite)를 등량 용적비(1:1:1 v/v/v)로 섞어 사용하였다.

이식 후 충분히 관수하고 순화실에서 주기적인 관수로 고습도(90% 이상)를 유지하며 순화하였다. 순화는 온도 25±2℃, 1일 16시간 조명(20μ㏖ m^-2 s^-1)되는 순화실에서 수행되었다. 이식 2주 후에는 점차 습도를 낮추어 주며 외부환경에 적응토록 하였다. 순화묘는 묘포에 이식하여 생장을 도모하였다.

표 4는 체세포배로부터 재생된 식물체의 토양이식 순화율을 나타낸 것이다.

본 발명에 의해 음나무 노령목의 체세포배 발생을 통한 식물체 형성 기술이 개발됨으로써 소멸해가는 유용한 산림자원의 보존 복원 및 산업적 이용 가능성을 제시하고 있으며, 본 발명에 의한 배양방법은 기타 음나무 천연기념물, 성숙목 활엽수의 배양, 희귀 및 멸종위기 식물의 기내번식에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (11)

1. (a) 음나무 노령목을 2년생 실생묘에 접목시켜 육성하고, 접목묘의 신초지 엽 및 엽병 절편을 표면살균한 후 체세포배발생 조직을 유도하는 단계;
   (b) 상기 유도된 체세포배발생 조직을 배양하여 증식시키는 단계;
   (c) 상기 증식된 체세포배발생 조직에서 체세포배를 유도하는 단계; 및
   (d) 상기 유도된 체세포배를 배양하여 발아 및 식물체를 유도하는 단계를 포함하되,
   상기 (a)단계의 체세포배발생 조직의 유도는 표면살균된 절편을 1mm 이하의 박편으로 절단하여 배양하는 것인, 음나무 노령목의 대량번식방법.
2. 제1항에 있어서, 신초지는 당년생인 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
3. 제1항에 있어서, 표면살균은 엽 및 엽병 절편에 트윈 20을 첨가하여 세척하고, 70% 에탄올(EtOH)에 침지한 후, 트리톤X-100이 첨가된 차아염소산나트륨(NaClO) 용액에 침지하여 살균한 다음, 멸균증류수로 세척하는 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
4. 제1항에 있어서, 체세포배발생 조직의 유도는 표면살균된 절편을 1mm 이하의 박편으로 절단하여 1.0~2.0㎎/L 2,4-D, 2~5% 슈크로즈, 1g/L L-글루타민 및 0.2~0.5% 젤라이트가 포함된 MS 배지로 암배양의 조건에서 4주~16주 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량 번식방법.
5. 제1항에 있어서, 체세포배발생 조직의 증식은 체세포배발생 조직을 1.0~2.0㎎/L 2,4-D, 2~5% 슈크로즈, 1g/L L-글루타민, 0.2~0.5% 젤라이트가 포함된 MS 배지에서 암배양의 조건에서 2~4주 마다 계대배양 하는 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
6. 제1항에 있어서, 체세포배의 유도는 체세포배발생 조직을 0.01~0.05% 활성탄, 7% PEG-4000, 5% 슈크로즈 및 0.1㎎/L 에브시식산(absicsic acid)이 포함된 1/2 MS 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
7. 제1항에 있어서, 식물체의 유도는 체세포배를 1.0~10.0㎎/L 지베렐릭산, 3% 슈크로즈, 0.1~0.4% 겔라이트가 포함된 1/2MS배지 또는 1/2MS 기본배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 (d)단계에서 유도된 식물체를 인공상토에 이식하여 순화시킨 후 포지에 이식하여 묘목을 생산하는 단계를 포함하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
9. 제8항에 있어서, 식물체의 순화는 식물체를 인공상토에 이식한 후, 온도 25±2℃, 1일 16시간 조명(20μ㏖ m^-2 s^-1)되는 순화실에서 90% 이상의 고습도를 유지하여 식물체를 순화시키는 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 음나무는 청원음나무인 것을 특징으로 하는 음나무 노령목의 대량번식방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 번식된 음나무.

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