KR102022245B1 - 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법 - Google Patents

잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 잔털벚나무 성숙목 유래의 기내 식물체 뿌리 절편을 배발생 세포 유도배지에 접종하여 배발생 세포를 유도하는 단계, (b) 상기 유도된 배발생 세포를 체세포배 유도배지에 접종하여 체세포배를 유도하는 단계, (c) 상기 유도된 체세포배를 체세포배 발아배지에 접종하여 기내 유식물체를 유도하는 단계, 및 (d) 상기 유도된 기내 유식물체를 순화하는 단계를 포함하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에 관한 것이다.

Description

잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법{Method of regeneration using somatic embryogenesis of adult Cherry tree(Prunus serrulata var. pubescens)}
본 발명은 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 잔털벚나무 성숙목을 재료로 기내에서 배양된 기내 식물체의 뿌리 절편을 이용하여, 그로부터 체세포배를 유도하고 최종적으로는 식물체까지 재분화가 가능한 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에 관한 것이다.
잔털벚나무는 다른 벚나무류와 비교하여 지하고가 높고 수형이 통직하여 미래 유망 활엽수 용재수로서의 가치가 있다. 이러한 우수한 특성을 가진 수목을 대량생산하기 위해, 일반적으로 삽목 혹은 접목과 같은 영양번식(vegetative propagation)방법이 주로 이용된다.
목본의 영양번식은 유전 획득량(genetic gain)을 유지하고, 대량의 식물체를 생산할 수 있는 효과적인 방법이다 (Park, Y.S., J.M. Bonga. (1992) Ed. M.R. Ahuja. Kluwer Academic, Dordrecht, pp 457470).
이중 체세포배 유도법(somatic embryogenesis)은 최근 상업적으로 생산되는 임목의 대량생산을 위해 사용되는 기술 중의 하나로 좋은 형질의 임목을 선발하여 급속증식이 가능한 기술로도 알려져 있다 (Theor. Appl. Genet. (1993) 86:427436).
그러나, 수령이 많은 나무, 즉 성숙목은 통직성 등 상업적으로 고부가치의 임목을 대량생산하기 위해 이용되는 기술인 접목 및 삽목 등으로 영양번식이 매우 어렵다는 것이다 (Plant Cell Tissue Organ Cult. (2010) 100:241254). 그 이유는 성숙목의 새로이 생장된 어린 줄기를 이용하더라도 성숙목의 특성상 그 세포는 이미 목질화되어 있고, 반면에 유시 조직은 결핍되어 있어 그 기술로는 증식이 힘든 것으로 알려져 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 체세포배 유도법은 성숙목 유래의 동일 유전자형을 갖는 클론묘를 생산시 매우 유용한 방법이다 (Tree Genet. Genomes (2013) 9:883899).
성숙목의 줄기, 엽 및 뿌리 등 체세포 조직과 같은 식물재료를 이용한 체세포배 유도기술 개발에 관한 연구보고는 드물다. 그러나 최근 조직배양 기술의 발달과 체세포배 유도 기작에 관한 많은 연구가 이루어지면서 성숙목으로부터 체세포배 유도가 가능한 수준까지 도래하였다.
12년생 유카리(Eucalyptus globulus , E. saligna×E. maidenii)의 경우 수관부의 신초정아로부터 체세포배 유도 및 식물체 재분화까지 가능하였고 (Tree Physiol.(2015) 6:678-690), 최근에는 700년생 음나무의 엽 및 엽병 절편으로부터 체세포배를 유도하여 식물체를 생산한 연구 또한 보고되고 있다 (Tree (2017) 31:1439-1451).
그러나, 상기 종래기술들은 우수한 형질을 갖는 클론묘를 생산하는데 한계가 있기 때문에, 성숙목 유래 기내 식물체로부터 체세포배를 유도하여 식물체를 생산할 수 있는 새로운 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 잔털벚나무 성숙목의 기내 식물체를 재료로 배발생세포 유도, 이로부터 체세포배 유도 및 유도된 체세포배로부터 식물체를 생산하는 일련의 공정을 통하여 효율적으로 식물체를 재분화할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 잔털벚나무 성숙목 유래의 기내 식물체 뿌리 절편을 배발생 세포 유도배지에 접종하여 배발생 세포를 유도하는 단계, (b) 상기 유도된 배발생 세포를 체세포배 유도배지에 접종하여 체세포배를 유도하는 단계, (c) 상기 유도된 체세포배를 체세포배 발아배지에 접종하여 기내 유식물체를 유도하는 단계, 및 (d) 상기 유도된 기내 유식물체를 순화하는 단계를 포함하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 잔털벚나무 성숙목의 클론 생산에 적합한 효율적인 체세포배 유도법 기술을 제공할 수 있고, 또한 이렇게 개발된 벚나무류의 체세포배 유도법은 차후 다양한 유용 활엽수종에까지 적용할 수 있다.
도 1은 30년생의 잔털벚나무를 재료로 한 기내 식물체의 뿌리로부터 유도된 배발생 세포를 나타내는 사진이다.
도 2는 배발생 조직에서 유도된 체세포배를 나타내는 사진이다.
도 3은 발아된 체세포배의 자엽과 본엽이 발생한 상태를 나타내는 사진이다.
도 4는 정상적으로 생육한 기내 잔털벚나무 유식물체를 나타내는 사진이다.
도 5는 순화된 잔털벚나무 폿트묘를 나타내는 사진이다.
본 발명은 (a) 잔털벚나무 성숙목 유래의 기내 식물체 뿌리 절편을 배발생 세포 유도배지에 접종하여 배발생 세포를 유도하는 단계, (b) 상기 유도된 배발생 세포를 체세포배 유도배지에 접종하여 체세포배를 유도하는 단계, (c) 상기 유도된 체세포배를 체세포배 발아배지에 접종하여 기내 유식물체를 유도하는 단계, 및 (d) 상기 유도된 기내 유식물체를 순화하는 단계를 포함하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법을 제공한다.
성숙목으로부터 체세포배 유도에 관한 연구 보고의 공통점은 성숙목 일지라도 유시성이 높은 부분을 재료를 선택하여 사용한 점이다. 줄기정아 및 연속접목 후 얻어진 엽과 엽병 절편체 모두 유시성이 높은 조직을 포함하고 있는 것에 착안하여, 본 발명에서는 유시성이 높다고 판단된 성숙목 유래 기내 식물체의 뿌리를 체세포배 유도를 위한 재료로 사용하였다.
전통적인 성숙목의 무성번식은 주로 삽목 방법을 사용해 왔는데, 이 방법은 수종과 유전자형(genotype)에 따라 증식율의 차이가 있으며, 성숙목을 재료로 한 삽목은 발근이 저조하고, 삽수의 대량 공급에 어려움이 있어 대량 증식에 한계가 있다.
그러나 기내에서 체세포배 유도 방법을 이용하면, 적은 양의 재료를 이용해서 동일한 유전형질(genotype)을 갖는 나무를 단기간에 계절의 제약 없이 생산하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명에 의한 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법은 성숙목 벚나무 기내 식물체의 다양한 부위로부터 체세포배를 유도하고 단기간에 식물체를 생산하여 이러한 문제점을 해결할 수 있는 기술로서, 성숙목 클론의 대량생산이 가능하기 때문에 임목 육종기간을 단축할 수 있는 좋은 수단이 될 수 있다.
본 발명의 상기 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에서, 상기 잔털벚나무 성숙목은 30년생 이상, 바람직하게는 30년~50년생의 잔털벚나무일 수 있다.
본 발명의 상기 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에서, 상기 기내 식물체 뿌리 절편은 상기 기내 식물체의 뿌리를 0.5~2cm, 바람직하게는 0.5~1.5cm, 보다 바람직하게는 1 cm의 길이로 절단한 뿌리 절편일 수 있다.
본 발명의 상기 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에서, 상기 배발생 세포 유도배지는 MS(Murashige and Skoog) 배지에, 1.0mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 3%(w/v)의 글루코오스 및 0.3%(w/v)의 젤라이트(gelrite)가 첨가된 배지일 수 있다.
본 발명의 상기 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에서, 상기 체세포배 유도배지는 MS(Murashige and Skoog) 배지에, 1.0mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 3%(w/v)의 슈크로오스 및 0.3%(w/v)의 젤라이트가 첨가된 배지일 수 있다.
본 발명의 상기 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에서, 상기 체세포배 발아배지는 염류의 양을 1/2로 줄인 1/2 MS(Murashige and Skoog) 배지에, 1.0mg/L의 지베렐린산(GA3)과 2%(w/v)의 슈크로오스 및 0.8%(w/v)의 아가가 첨가된 배지일 수 있다.
본 발명의 상기 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에서, 상기 (d) 단계는 상기 유도된 기내 유식물체의 배지를 제거한 후, 버미큘라이트, 피트모스 및 펄라이트를 1:1:1의 부피비로 포함하는 인공상토에 식재하여 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법에서, 상기 MS(Murashige and Skoog) 배지는 하기 표 1과 같은 성분 및 함량으로 조성된다.
Figure 112017111119613-pat00001
본 발명은 또한 상기의 방법에 의해 재분화된 잔털벚나무를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> (기내 식물체의 뿌리로부터 배발생 세포의 유도)
국립산림과학원에서 선발한 30년생 잔털벚나무의 근맹아 재료로 만들어진 기내 식물체의 뿌리를 재료로 사용하였다. 기내 식물체를 키우기 위해 유리 배양병에 1/2MS 배지에 2% 슈크로오스(sucrose)와 8%(w/v) 아가가 첨가된 배지에서 5주간 생육시킨 후, 발근된 뿌리를 1cm의 길이로 절단하여 절편으로 사용하였다.
상기 절편은 배발생 세포를 유도하기 위해, MS 배지에 1.0mg/L 2,4-D와 3% 글루코오스(glucose) 및 0.3% 젤라이트(gelrite)가 첨가된 페트리디쉬에 접종하였다. 배양을 위해 온도 25±1℃의 배양실에서 암배양으로 실시하였다.
도 1은 30년생의 잔털벚나무를 재료로 한 기내 식물체의 뿌리로부터 유도된 배발생 세포를 나타내는 사진이다.
또한, 하기 표 2는 30년생 잔털벚나무 개체목과 첨가한 탄소원의 종류에 따른 배발생 세포의 유도율을 나타낸 것이다.
잔털벚나무 개체 배발생세포 유도율(%)
3% 글루코오스 3% 슈크로오스
잔털벚나무1 61 36
잔털벚나무2 4 0.5
잔털벚나무3 20 3
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 배발생 세포 유도율은 개체에 따라서 큰 차이를 보이고, 첨가한 탄소원의 종류에 따라 배발생세포 유도율의 차이를 보여주고 있다.
3% 글루코오스를 첨가한 배지에서 배발생 세포의 유도율이 더 높았으며, 배발생 세포를 유도하는 요인으로 개체목간과 탄소원의 종류가 중요한 요인이 됨을 알 수 있다.
<실시예 2> (체세포배의 유도)
체세포배 유도 단계는 실시예 1과 같이 유도된 배발생 세포에서 체세포배를 유도하는 단계로서, 5~7주 후 유도된 배발생 세포로부터 체세포배를 유도하기 위해, 페트리디쉬에 MS배지, 1.0mg/L 2,4-D와 3% 슈크로오스 및 0.3% 젤라이트가 첨가된 체세포배 유도배지에서 체세포배를 유도하였다. 배양을 위해 온도 25±1℃의 배양실에서 암배양으로 실시하였다.
도 2는 배발생 조직에서 유도된 체세포배를 나타내는 사진이다.
또한, 하기 표 3은 개체목과 첨가한 탄소원의 종류에 따른 체세포배 유도효과를 나타낸 것이다.
잔털벚나무 개체 체세포배 유도율(%)
3% 슈크로오스 3% 글루코오스
잔털벚나무1 43 25
잔털벚나무2 9 2
잔털벚나무3 18 5
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 체세포배 유도율과 유도수는 개체목간 그리고 탄소원의 종류에 따라서 큰 차이를 나타내었는데, 3% 슈크로오스를 첨가한 배지에서 체세포배 유도율과 유도수가 높음을 알 수 있다.
따라서, 체세포배 유도를 위해서는 3% 슈크로오스를 첨가하는 것이 효과적이었다.
<실시예 3> (기내 유식물체(발아체)의 유도)
체세포배로부터 기내 유식물체(발아체)를 유도하기 위해, 유리 배양병에 1/2MS 배지, 1.0mg/L GA3와 2% 슈크로오스 및 0.8% 아가가 첨가된 배지에 체세포배를 접종하였다.
유식물체 생육을 위해 온도 25±1℃, 1일 16시간 조명, 조도는 냉백색 형광등 하에서, 60 μmol·m-2·s-1로 1일 16시간 조명, 8시간 조건으로 배양하였다.
도 3은 발아된 체세포배의 자엽과 본엽이 발생한 상태를 나타내는 사진이고, 도 4는 정상적으로 생육한 기내 잔털벚나무 유식물체를 나타내는 사진이다.
또한, 하기 표 4는 유식물체의 유도를 위한 GA3의 효과를 나타낸 것이다.
잔털벚나무 개체 유식물체 유도율(%)
무첨가 GA3 첨가
잔털벚나무 32 68
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 유식물체의 유도율과 유식물체의 유도수는 GA3의 첨가 여부에 따라 차이를 내었는데, 1.0mg/L GA3를 첨가한 배지에서 유식물체의 유도율과 유도수가 높음을 알 수 있다.
따라서, 유식물체(발아체)를 생산하기 위해서는 GA3의 첨가가 필수적임을 알 수 있다.
<실시예 4> (기외 순화)
상기 실시예 3에서 유도된 기내 유식물체를 순화하기 위하여, 인공토양으로 이식하기 전에 식물체의 뿌리에 붙어있는 배지를 완벽하게 제거한 후, 인공상토(버미큘라이트 : 피트모스 : 펄라이트 = 1 : 1 : 1의 부피비)에 이식하였다.
이식 후 충분히 관수하고, 순화실에서 주기적인 관수로 고습도(90%)를 유지하며, 온도 25±1℃, 1일 16시간 조명, 조도는 냉백색 형광등 하에서, 60 μmol·m-2·s-1로 1일 16시간 조명, 8시간의 조건으로 생육시켰다.
도 5는 순화된 잔털벚나무 폿트묘를 나타내는 사진이다.
또한, 하기 표 5는 기내 식물체의 순화 3개월 후 생존율과 줄기 길이를 나타낸 것이다.
순화기간 3개월
생존율(%) 50
줄기 길이(cm) 12.2
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 생존율은 50%, 줄기 길이는 평균 12.2cm로 나타났으며, 모두 정상적인 형태를 가진 묘목으로 생장하였다.
상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (8)

  1. (a) 잔털벚나무 성숙목 유래의 기내 식물체 뿌리 절편을 배발생 세포 유도배지에 접종하여 배발생 세포를 유도하는 단계로서, 상기 배발생 세포 유도배지는 MS(Murashige and Skoog) 배지에, 1.0mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 3%(w/v)의 글루코오스 및 0.3%(w/v)의 젤라이트가 첨가된 단계;
    (b) 상기 유도된 배발생 세포를 체세포배 유도배지에 접종하여 체세포배를 유도하는 단계;
    (c) 상기 유도된 체세포배를 체세포배 발아배지에 접종하여 기내 유식물체를 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 유도된 기내 유식물체를 순화하는 단계를 포함하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 잔털벚나무 성숙목은 30년생 이상인 것을 특징으로 하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기내 식물체 뿌리 절편은 상기 기내 식물체의 뿌리를 0.5~2cm의 길이로 절단한 것을 특징으로 하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 체세포배 유도배지는 MS(Murashige and Skoog) 배지에, 1.0mg/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 3%(w/v)의 슈크로오스 및 0.3%(w/v)의 젤라이트가 첨가된 것을 특징으로 하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 체세포배 발아배지는 염류의 양을 1/2로 줄인 1/2 MS(Murashige and Skoog) 배지에, 1.0mg/L의 지베렐린산(GA3)과 2%(w/v)의 슈크로오스 및 0.8%(w/v)의 아가가 첨가된 것을 특징으로 하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 유도된 기내 유식물체의 배지를 제거한 후, 버미큘라이트, 피트모스 및 펄라이트를 1:1:1의 부피비로 포함하는 인공상토에 식재하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 잔털벚나무 성숙목의 체세포배 유도를 이용한 식물체의 재분화 방법.
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