CN113475402B - 一种利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，包括以下步骤：获得橡胶树幼嫩茎段外植体‑消毒灭菌‑初代培养‑继代壮苗生根培养‑驯化移栽。本发明的有益之处在于：(1)通过橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗，不经过发生愈伤组织而再生，不仅保持了优良橡胶树种苗的遗传稳定性，而且不受时间季节限制，整个生长季，只要有新梢萌发生长，随时可以就地取材，外植体取材的周期长；(2)从选取幼嫩茎段到获得可以移栽的橡胶树试管苗，整个培养周期为60d左右，培养周期短。

Description

一种利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法
技术领域
本发明涉及一种培养橡胶树试管苗的方法，具体涉及一种利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，属于育苗技术领域。
背景技术
巴西橡胶树(Hevea brailiensis)是大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)多年生异花授粉乔木，其所产生的胶乳是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。我国能种植橡胶树的区域是热带北缘地区，面积非常有限，栽培区域已近饱和。我国天然橡胶的消费量逐年增加，需求缺口逐年加大，天然橡胶的产量只能达到消费量的三分之一。因此，提高橡胶树的抗寒性以扩大其栽培范围，提高其抗病性从而提高乳胶的产量均已成为橡胶树育种工作者的关注焦点。
橡胶树遗传背景复杂，从种子萌发到幼龄橡胶树开割，需要7年时间。橡胶树的生长周期长，选育一个优良橡胶品种育种周期一般为30年，常规育种方法进行品种改良周期长，成本高。近二十多年来，基因工程等生物技术的迅速发展为橡胶树品种改良创造了条件，通过转基因途径可使育种周期大大缩短，但目前橡胶树组织培养技术非常困难，且大多数品系体外植株再生的效率非常低，这已经成为从分子水平进行橡胶树遗传改造的重要障碍。
巴西橡胶树花药培养在巴西橡胶树组织培养中研究的较早也较多。我国自上世纪70年代末以来，已从花药诱导出胚性愈伤组织，经过体细胞胚发生得到再生植株，整个培养周期一般在半年以上，而且难以建立胚性细胞悬浮系和转化体系，因此，通过花药培养途径获得转基因株系仍然很困难。
发明内容
目前，通过花药、胚胎培养建立的橡胶树遗传转化体系周期特别长，而且遗传性状容易发生变异。为解决现有技术的不足，本发明的发明人试图通过植物干细胞遗传转化技术对橡胶树优良品种进行改良，提高其产胶量和抗寒性。本发明选取橡胶树刚萌发的新梢，通过筛选合适的培养基和有效的处理方法，短时间内刺激幼嫩茎段的腋芽萌发，促使幼嫩茎段生根产生试管苗植株，为后续通过植物干细胞遗传转化技术获得产胶量高和抗寒性、抗病性强的橡胶优异种质提供大量的试验材料。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第1步：获得橡胶树幼嫩茎段外植体
从田间或者温室大棚内选取橡胶树的幼嫩茎段，将其剪成1.5～2.0cm大小的小茎段，每个小茎段上带有1～2片叶子，将带有叶子的叶柄从叶柄基部抹掉，将抹掉叶柄的小茎段放入盛有无菌水的小烧杯中，待用；
第2步：消毒灭菌
将切割好的小茎段切口朝下，让其悬空流完乳汁，然后用流动的自来水冲洗半个小时以上，之后于超净工作台上对抹掉叶柄的小茎段进行常规的消毒灭菌；
第3步：初代培养
将经过消毒灭菌的橡胶树幼嫩茎段外植体接种在初代培养基上，初代培养基的配方如下：WPM+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，然后放置于培养室内进行初代培养；
第4步：继代壮苗生根培养
待萌发的新芽长到2cm大小时，从新芽连接茎段处切下新芽，然后将新芽接种在壮苗培养基上，壮苗培养基的配方如下：WPM+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，之后放置于培养室内进行20d壮苗培养；壮苗培养20d后，将无菌苗转移到生根培养基上，生根培养基的配方如下：WPM+6-BA 6mg/L+TDZ 0.05mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+活性炭5g/L+琼脂7.5g/L，之后继续放置于培养室内进行生根培养；
第5步：驯化移栽
待橡胶树试管苗长出3～5条须根，并且平均根长大于4cm时，从生根培养基中取出橡胶树试管苗，用流动的自来水将根部培养基冲洗干净，再将其移栽到盛有蛭石草炭土混合基质的小营养钵中，在培养室内生长15d后移栽到装有大田土的塑料花盆中，之后进行粗放管理即可。
前述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第1步中，选去橡胶树的刚萌发的、生长良好且无病虫害的幼嫩茎段。
前述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第2步中，常规的消毒灭菌具体如下：先用体积浓度为75％的酒精浸泡消毒30s，然后用无菌水冲洗1～2次，接着用质量浓度为0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗4～5次。
前述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第3步、第4步和第5步中，培养室的温度为26℃、光照强度为2000lux、每天光照时间为12h。
前述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第5步中，小营养钵中的蛭石和草炭土的体积比为1:1。
前述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第5步中，橡胶树试管苗在小营养钵中培养期间，培养室的湿度保持在90％以上。
本发明的有益之处在于：
(1)通过橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗，不经过发生愈伤组织而再生，不仅保持了优良橡胶树种苗的遗传稳定性，而且不受时间季节限制，整个生长季，只要有新梢萌发生长，随时可以就地取材，外植体取材的周期长；
(2)从选取幼嫩茎段到获得可以移栽的橡胶树试管苗，整个培养周期为60d左右，培养周期短。
附图说明
图1是从田间取回的橡胶树幼嫩茎段在初代培养基上培养15d后的生长情况图；
图2是取自茎段叶腋处的新芽在壮苗培养基上培养20d后的生长情况图；
图3是无菌苗在生根培养基上培养20d后的生长情况图；
图4是无菌苗在生根培养基上培养25d后获得的橡胶树试管苗的生长情况图；
图5是橡胶树试管苗移栽到小营养钵中15d后的生长情况图；
图6是橡胶树试管苗移栽到装有大田土的塑料花盆中20d后的生长情况图。
具体实施方式
本发明通过选取橡胶树刚萌发的新梢以及筛选合适的培养基和有效的处理方法，实现了短时间内刺激幼嫩茎段的腋芽萌发，促使幼嫩茎段生根产生试管苗植株，然后经过一系列的驯化移栽，获得了移栽成活率较高的试管苗。
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明提供的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，具体包括以下步骤：
第1步：获得橡胶树幼嫩茎段外植体
从田间(或者温室大棚内)选取橡胶树的刚萌发的、生长良好且无病虫害的幼嫩茎段，将其剪成1.5～2.0cm大小的小茎段，每个小茎段上带有1～2片叶子，将带有叶子的叶柄从叶柄基部抹掉，将抹掉叶柄的小茎段放入盛有无菌水的小烧杯中，带回实验室备用。
第2步：对橡胶树幼嫩茎段外植体进行消毒灭菌
橡胶树是大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)植物，茎段切割以后容易产生白色乳汁，将切割好的小茎段切口朝下，让其悬空流完乳汁，然后用流动的自来水冲洗半个小时以上，之后拿到超净工作台上进行常规的消毒灭菌，消毒灭菌的过程具体如下：先用体积浓度为75％的酒精浸泡消毒30s，然后用无菌水冲洗1～2次，接着用质量浓度为0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗4～5次。
第3步：初代培养
将经过消毒灭菌的橡胶树幼嫩茎段外植体接种在初代培养基上，初代培养基的配方如下：WPM+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，然后放置于温度为26℃、光照强度为2000lux、每天光照时间为12h的培养室内进行初代培养，初代培养15d后从茎段叶腋处萌发新芽(图1)。
第4步：继代壮苗生根培养
培养基和培养条件的筛选是橡胶树茎段培养成功的关键。针对橡胶树的茎段的继代培养，经过两年多的试验，进行不同激素种类和浓度的组合，最终设计出了如下的三因素三水平的试验：
A1：WPM A2：MS A3：1/2MS
B1：6-BA 2mg/L B2：6-BA 4mg/L B3：6-BA 6mg/L
C1：TDZ 0.05mg/L C2：TDZ 0.1mg/L C3：TDZ 0.2mg/L
9种培养基的配方组合如下：
①A1B1C1 ②A1B2C2 ③A1B3C3
④A2B1C2 ⑤A2B2C3 ⑥A2B3C1
⑦A3B1C3 ⑧A3B2C1 ⑨A3B3C2
基于以上9种培养基，连续系统的跟踪观察橡胶树芽的生长状态、根的生长状况和整个植株的生长状态，最终获得了具有如下配方的壮苗培养基和生根培养基：
(1)壮苗培养基：WPM+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L；
(2)生根培养基：WPM+6-BA 6mg/L+TDZ 0.05mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+活性炭5g/L+琼脂7.5g/L。
继代壮苗生根培养的过程具体如下：
待从茎段叶腋处萌发的新芽长到2cm大小时(一般需要1d时间)，从新芽连接茎段处切下新芽，然后将新芽接种在壮苗培养基上，壮苗培养基的配方如下：WPM+6-BA 2mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，之后放置于培养室内进行壮苗培养，壮苗培养20d后获得的无菌苗的生长情况如图2所示；壮苗培养结束后，将无菌苗转移到生根培养基上，生根培养基的配方如下：WPM+6-BA 6mg/L+TDZ 0.05mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+活性炭5g/L+琼脂7.5g/L，之后继续放置于培养室内进行生根培养，生根培养20d后橡胶树试管苗长出须根，试管苗的生长情况如图3所示。
第5步：驯化移栽
在驯化移栽过程中，针对基质的配方进行了四个不同的试验处理，具体的：
处理1：大田土与草炭土混合，二者的体积比为1:1；
处理2：蛭石与草炭土混合，二者的体积比为1:1；
处理3：大田土与草炭土混合，二者的体积比为3:1；
处理4：蛭石与草炭土混合，二者的体积比为3:1。
在各个处理上分别接种了30株橡胶树试管苗，最后统计成活率，统计结果如下：
处理2上橡胶树试管苗的成活率最高，达到93.3％；处理3上橡胶树试管苗的成活率最低，仅仅为66.7％。
故，最终确定处理2(蛭石与草炭土混合，二者的体积比为1:1)为本发明最优选的基质。
驯化移栽的过程具体如下：
待橡胶树试管苗长出3～5条须根，并且平均根长大于4cm时(一般需要5d时间)，从生根培养基中取出橡胶树试管苗，用流动的自来水将根部培养基冲洗干净(图4)，再将其移栽到小营养钵中，营养钵盛有蛭石草炭土混合基质(蛭石与草炭土的体积比为1:1)，之后继续放置于温度为26℃、光照强度为2000lux、每天光照时间为12h的培养室内生长，期间注意保湿，培养室的湿度保持在90％以上，橡胶树试管苗在培养室内生长15d后(生长情况如图5所示)，移栽到装有大田土的塑料花盆中，之后进行粗放管理即可，试管苗在塑料花盆中培养20d后的生长情况如图6所示。
从选取幼嫩茎段到获得可以移栽的试管苗，整个培养周期为60d左右(初代培养15d+壮苗培养20d+生根培养25d)，较短。
巴西橡胶成龄树茎段组织培养一直是橡胶树组织培养的难点，本发明通过选取橡胶树刚萌发的幼嫩茎段以及筛选合适的培养基和有效的处理方法，实现了不经过发生愈伤组织而再生，短时间内刺激幼嫩茎段的腋芽萌发，促使幼嫩茎段生根产生试管苗植株，然后经过一系列的驯化移栽，获得了移栽成活率较高的试管苗。经统计，橡胶树试管苗的移栽成活率在93％以上。
此外，本发明提供的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，有利于保持橡胶树植株的优良特性，达到遗传性状稳定的优良效果，同时也实现了不受时间季节限制，周年生产橡胶树优异种苗，为橡胶转基因株系和优良株系(例如产胶量高和抗寒性、抗病性强)的繁殖提供了有力的技术支持和保障。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第1步：获得橡胶树幼嫩茎段外植体
从田间或者温室大棚内选取橡胶树的幼嫩茎段，将其剪成1.5～2.0cm大小的小茎段，每个小茎段上带有1～2片叶子，将带有叶子的叶柄从叶柄基部抹掉，将抹掉叶柄的小茎段放入盛有无菌水的小烧杯中，待用；
第2步：消毒灭菌
将切割好的小茎段切口朝下，让其悬空流完乳汁，然后用流动的自来水冲洗半个小时以上，之后于超净工作台上对抹掉叶柄的小茎段进行常规的消毒灭菌；
第3步：初代培养
将经过消毒灭菌的橡胶树幼嫩茎段外植体接种在初代培养基上，初代培养基的配方如下：WPM+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，然后放置于培养室内进行初代培养；
第4步：继代壮苗生根培养
待萌发的新芽长到2cm大小时，从新芽连接茎段处切下新芽，然后将新芽接种在壮苗培养基上，壮苗培养基的配方如下：WPM+6-BA2mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，之后放置于培养室内进行20d壮苗培养；壮苗培养20d后，将无菌苗转移到生根培养基上，生根培养基的配方如下：WPM+6-BA 6mg/L+TDZ 0.05mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖30g/L+活性炭5g/L+琼脂7.5g/L，之后继续放置于培养室内进行生根培养；
第5步：驯化移栽
待橡胶树试管苗长出3～5条须根，并且平均根长大于4cm时，从生根培养基中取出橡胶树试管苗，用流动的自来水将根部培养基冲洗干净，再将其移栽到盛有蛭石草炭土混合基质的小营养钵中，蛭石和草炭土的体积比为1:1，在培养室内生长15d后移栽到装有大田土的塑料花盆中，之后进行粗放管理即可。
2.根据权利要求1所述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第1步中，选取橡胶树的刚萌发的、生长良好且无病虫害的幼嫩茎段。
3.根据权利要求1所述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第2步中，常规的消毒灭菌具体如下：先用体积浓度为75％的酒精浸泡消毒30s，然后用无菌水冲洗1～2次，接着用质量浓度为0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗4～5次。
4.根据权利要求1所述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第3步、第4步和第5步中，培养室的温度为26℃、光照强度为2000lux、每天光照时间为12h。
5.根据权利要求1所述的利用橡胶树幼嫩茎段离体培养试管苗的方法，其特征在于，在第5步中，橡胶树试管苗在小营养钵中培养期间，培养室的湿度保持在90％以上。
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