CN107889744A

CN107889744A - 一种金丝揪的组培快繁方法

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Publication number: CN107889744A
Application number: CN201711123613.4A
Authority: CN
Inventors: 韩义; 解孝满; 鲁仪增; 咸洋; 孙涛; 王艳; 刘立江; 仝伯强; 刘鹍
Original assignee: CENTER FOR FOREST GENETIC RESOURCES OF SHANDONG PROVINCE
Current assignee: CENTER FOR FOREST GENETIC RESOURCES OF SHANDONG PROVINCE
Priority date: 2017-11-14
Filing date: 2017-11-14
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2037-11-14
Also published as: CN107889744B

Abstract

本发明提供了一种金丝揪组培快繁方法，涉及植物组培技术领域。一种金丝揪组织培养基：初代培养基、增殖培养基和生根培养基，初代与增殖培养基为Qj培养基：N6+6‑BA 1.25mg/L+IBA 0.07mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，生根培养基选择Qg培养基：1/2MS+6‑BA0.01mg/L+IBA 0.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖15g/L；还包括一种利用上述培养基的组培快繁方法，包括：1)无菌苗获得，选取新枝，长度处理，进行清洁、消毒、除菌、裁截，接种于Qj培养基，培养得无菌苗；2)增殖培养，无菌苗长度处理，转接至培养基Qj，培养得继代苗；3)生根培养，继代苗处理后接于Qg培养基，培养得生根苗；4)炼苗和移栽，生根苗移至温室炼苗后移栽穴盘，培养后移栽。具有生根培养的有效增殖率高，成苗率高，利于工厂化生产的有益效果。

Description

一种金丝揪的组培快繁方法

技术领域

本发明提供一种金丝揪组培快繁方法，涉及植物组织培养技术领域。

背景技术

金丝楸(Catalpa bungei‘jinsiqiu’.)，属紫藏科(Bignoniaceae)梓属(catalpa)高大落叶乔木，是楸树(Catalpa bungei)中一个极为重要的高档材用地方品种，因板材纹路里有金丝线而得名。由于其变异特征明显，并具有一定适应区域，张俊佩等认为金丝楸是楸树的一个地理变种(张俊佩等，2008)。金丝楸不仅材质坚韧、花纹美观，而且其具有树干通直、适应性强、生长速度快等优点，是农林间作、植树造林和园林绿化的优选树种。目前金丝楸主要通过根段扦插和嫁接等手段进行扩繁生产，这些技术手段均受限于母体材料短缺，操作繁琐，导致金丝楸繁殖效率低，无法解决金丝楸造林苗木短缺、金丝楸木材供不应求等社会需求问题。因此，建立金丝楸高效繁殖技术体系是快速提高金丝楸苗木产量亟待解决的核心难题。

组织培养是一种高效的无性繁殖方法。翟晓巧，范国强等(2002)以金丝楸幼嫩茎段为外植体进行芽诱导时认为，基础培养基WPM优于MS，在培养基 WPM+IBA0.3mg/L+BA5mg/L上的芽诱导率为90％，诱导芽块数最高为9；生根培养时1/2MS优于MS，在培养基1/2MS+NAA0.5mg/L上，生根率可达100％。截止到目前，仅有以上两篇文章报道了金丝楸相关组培研究。上述金丝楸组培快繁的研究只对两种基本培养基进行了比较，而且没有体现对激素种类和配比的筛选，因此，金丝楸的最佳快繁体系不明确，构建可用于生产推广的金丝楸高效快繁技术体系仍有许多技术难题需要解决。

金丝楸近缘种、品种的组培快繁体系研究中，有普通楸树组织培养方法相关报道。其中，中国发明专利申请CN104054580 A公开了一种提高楸树增殖系数的组织培养方法，包括以下步骤(1)无菌培养物的建立；(2)腋芽的诱导；(3)腋芽的增殖；(4)芽苗的生根培养；(5)炼苗与移栽等五个步骤，该专利申请最佳腋芽诱导配方为MS+BA 0.8mg/L+IBA 0.l mg/L；最佳腋芽增殖配方为MS+BA l.5 mg/L+ZT 0.lmg/L+IAA 0.2mg/L；最高增殖系数为15，通过瓶苗基部愈伤一起继代的方法虽然获得较高的增殖系数，但不能直接用于生根，另外其增殖主要通过腋芽诱导和腋芽增殖两步实现，操作繁琐，不利于在生产中推广。中国发明专利申请CN104719136A公开了一种楸树组培苗生根培养方法，包括以下步骤：(1) 楸树无菌苗的获取；(2)无菌苗的继代；(3)楸树组培苗生根培养；(4)炼苗与移栽等四个步骤，适用于工厂化生产(苗高2.5-4cm)，其有效扩繁系数为3-3.5，培养基为MS中添加6-BA和TDZ，生根培养为MS全部元素减半的培养基中添加 IBA 0.5mg/L，生根率为96％。该方法虽简化操作，但3-3.5的有效增殖系数明显偏低，如利用该方法进行工厂化扩繁生产，投入产出比率较小，经济指标不理想。另外，直接将现有普通楸树组培方法用于金丝楸组培，其快繁效果不理想。

因此，探索适用于金丝楸组培的培养基、激素种类和配比，构建高增值效率的金丝楸快繁体系对推动金丝楸苗木工厂化生产具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种有效增值率高，成苗率高的金丝揪组织培养基与组培快繁方法，解决了现有技术中金丝揪组培投入产出比率小，快繁效果不理想的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种金丝揪的组织培养基，包括初代培养基，增殖培养基和生根培养基，所述初代培养基和所述增殖培养基为Qj培养基，所述生根培养基为Qg培养基，所述Qj培养基为N6+6-BA 1.25mg/L+IBA 0.07mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，所述Qg培养基为1/2MS+6-BA0.01mg/L+IBA 0.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖15g/L。

作为进一步地优选，所述Qj培养基的PH值为5.8，所述Qg培养基的PH 值为5.8。

一种金丝揪组培快繁方法，包括以下步骤：

1)金丝楸无菌苗获得

4-6月份取金丝楸嫁接苗当年萌发新枝，去除叶片、叶柄、梢头和已木质化基部，剪成3-5cm长带腋芽茎段，将带芽茎段用饱和洗洁净水浸泡10min，用软毛刷轻刷表面后置于流水下冲洗1h；在超净工作台上，用75％酒精处理30s，无菌水冲洗2遍，再用10％次氯酸钠溶液处理3min，无菌水冲洗7遍，截成1.5cm 带芽茎段后接种于培养基Qj中，每瓶接种1个进行培养，培养获得金丝楸无菌苗；

2)金丝楸无菌苗继代培养

将培养25-28d，长4-6cm，叶片浓绿健壮的金丝楸无菌苗截成0.5-1cm的基部丛生芽，转接至培养基Qj中，每瓶接种2个，培养得用于生根或继续继代的金丝楸组培苗；

3)金丝楸组培苗生根培养

选取步骤(2)继代培养中高度大于1cm金丝楸组培苗，保留最上端两个叶片，其他叶片则沿叶柄基部贴茎杆处剪除，转接至生根培养基Qg中，每瓶接种 2个，培养得金丝楸生根瓶苗；

4)炼苗和移栽

将金丝楸生根苗带瓶移至温室炼苗，在温度25-28℃，湿度80％，自然光条件下适应3d，再开盖适应3d，之后洗净根系上培养基，移栽至含草炭：蛭石为1:1基质的穴盘中，待长出新叶后，按常规管理继续在温室中培养30d，即可移栽至大田。

作为进一步地优选，步骤1)的培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d。

作为进一步地优选，步骤2)的培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d。

作为进一步地优选，步骤3)的培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d。

作为进一步地优选，步骤2)中所述裁切后的基部丛生芽至少含1个腋芽茎段。

本发明的有益效果：增殖过程中无玻璃化现象，初代培养时的增殖培养系数可达15.5，增殖培养时的增殖系数达15.5，生根培养的有效增殖率高，增殖系数可8.1，生根率达97.2％，平均生根条数4.6，炼苗移栽时成活率高，出苗率可达 95％，利于工厂化生产。

附图说明

图1是金丝揪增殖培养示意图；

图2是金丝揪生根培养示意图。

具体实施例

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1)金丝楸无菌苗获得

4-6月份取金丝楸嫁接苗当年萌发新枝，去除叶片、叶柄、梢头和已木质化基部，剪成3-5cm长带腋芽茎段，将带芽茎段用饱和洗洁净水浸泡10min，用软毛刷轻刷表面后置于流水下冲洗1h；在超净工作台上，用75％酒精处理30s，无菌水冲洗2遍，再用10％次氯酸钠溶液处理3min，无菌水冲洗7遍，截成1.5cm 带芽茎段后接种于初代培养基，初代培养基为Qj培养基，N6+6-BA 1.25 mg/L+IBA 0.07mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，PH为5.8，每瓶接种1个，培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d，获得金丝楸无菌苗。

2)金丝楸无菌苗继代培养

将培养25-28d，长4-6cm，叶片浓绿健壮的金丝楸无菌苗截成0.5-1cm至少含1个腋芽茎段及基部丛生芽，一起转接至增殖培养基，增殖培养基为Qj培养基：N6+6-BA 1.25mg/L+IBA 0.07mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，PH为5.8，每瓶接种2个。培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d，可得用于生根或继续继代的金丝楸组培苗。

3)金丝楸组培苗生根培养

选取步骤(2)继代培养中高度大于1cm金丝楸组培苗，保留最上端两个叶片，其他叶片则沿叶柄基部贴茎杆处剪除，转接至生根培养基Qg，Qg： 1/2MS+6-BA 0.01mg/L+IBA0.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖15g/L，PH为5.8，每瓶接种2个。培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度 25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d，得到金丝楸生根瓶苗，生根率97.2％。

4)炼苗和移栽

将金丝楸生根苗带瓶移至温室炼苗，在温度25-28℃，湿度80％，自然光条件下适应3d，再开盖适应3d，之后洗净根系上培养基，移栽至含草炭：蛭石为 1:1基质的穴盘中，待长出新叶后，按常规管理继续在温室中培养30d，即可移栽至大田，出苗率可达95％以上。

培养基选择实验

1.金丝楸无菌苗获得、金丝楸无菌苗继代培养中Qj培养基的筛选

根据已公布资料初选适于金丝楸组培繁殖的激素浓度，选择WPM培养基中添加不同浓度6-BA和NAA，同时添加琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，调节PH≈5.8。接种时每个处理接种不低于30瓶，培养25-28d调查生长情况，具体见表1。

表1 6-BA和NAA比较实验

其中增值系数1指基部丛生芽一起继代的增殖比例；增值系数2指高度大于 1cm芽(可直接用于生根培养)的增殖比例。

可以看出6-BA 1.3mg/L，NAA 0.13mg/L利于金丝楸分化，但普遍存在生长缓慢，叶色发黄等问题。适宜的基本培养基不仅能促进金丝楸的健壮生长，对增殖也有一定促进作用。因此，为进一步优化，在不同基本培养基中添加6-BA 1.3mg/L，NAA 0.13mg/L琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，调节PH≈5.8，培养25-28d 调查生长情况，筛选适于金丝楸快繁的基本培养基，具体结果见表2。

表2 不同培养基实验

编号	培养基	增值系数1	增殖系数2	描述
					1	1/2MS	6.5	2.3	叶片发黄，生长缓慢，增殖系数低
2	MS	9.2	4.1	叶片浓绿开展，植株健壮，增殖系数高
					3	N6	9.5	4.3	植株健壮，叶片绿色，增殖系数最高
4	WPM	6.3	1.7	叶片绿色，植株生长慢，增殖系数低
					5	DKW	5.5	1.9	叶片发黄，植株生长慢，增值系数低

结果显示，N6培养基比其他基本培养基更适于金丝楸组培。进一步优化，在N6培养基中添加不同种类浓度的生长素及6-BA 1.3mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖 30g/L，调节PH≈5.8，培养25-28d调查生长情况，具体结果见表3。

表3 IBA、NAA、IAA激素选择实验

编号	生长素	增值系数1	增殖系数2	描述
					1	NAA 0.13mg/L	9.3	3.7	增值效果一般，可直接用于生根培养数量少
2	IBA0.1mg/L	11.5	4.3	增值效果一般，可直接用于生根培养数量偏少
					3	IBA0.07mg/L	13.6	6.1	增值系数高，可直接用于生根培养数量多
4	IBA0.05mg/L	12.8	4.5	增值效果一般，可直接用于生根培养数量偏少
					5	IAA0.13mg/L	3.3	1.2	增殖系数低，可直接用于生根培养数量少
6	IAA0.1mg/L	4.2	1.4	增殖系数低，可直接用于生根培养数量少
					7	IAA0.07mg/L	4.3	1.1	增殖系数低，可直接用于生根培养数量少

结果显示：IBA比NAA、IAA更适于金丝楸组培快繁，添加IBA 0.07mg/L，金丝楸增值系数高，生长快，可直接用于生根培养组培苗数量多。为进一步优化，筛选适于金丝楸组培激素种类和配比，在添加了琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，PH≈5.8的N6培养基中添加下列不同激素，培养25-28d调查生长情况，实验结果见表4。

表4 不同过激素种类选择实验

编号	激素种类	增值系数1	增殖系数2	描述
					1	6-BA+IBA	15.1	7.5	植株健壮，可直接用于生根培养数量多
2	6-BA+TDZ	8.5	5.3	植株健壮，可直接用于生根培养数量偏少
					3	6-BA+ZT+IAA	13.5	1.8	易出现玻璃化，可直接用于生根培养数量少
4	6-BA+KT+IBA	3.5	1.1	易出现玻璃化，增值系数低
					5	ZT+IBA	2.7	0.9	增值系数低甚至不分化
6	KT+IBA	3.5	1.5	增殖系数低甚至不分化
					7	KT+TDZ+IBA	2.5	0.7	易出现玻璃化，增值系数低

结果表明:单独使用6-BA与IBA就能对金丝楸组培产生很好增殖效果，植株生长健壮，产生可直接用于生根培养的组培苗数量多，单一使用6-BA更节约成本，利于在生产上推广。为进一步优化6-BA浓度，在添加IBA 0.07mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，PH≈5.8的N6培养基中添加不同浓度6-BA，实验结果见表5。

表5 6-BA浓度选择

编号	6-BA浓度	增值系数1	增殖系数2	描述
					1	1.0mg/L	6.4	2.5	生长健壮，增值系数低
2	1.2mg/L	12.2	4.3	生长健壮，增殖系数低
					3	1.25mg/L	15.5	8.1	继代3次保持较高增殖效率，无玻璃化现象
4	1.3mg/L	15.1	6.1	继代3次增值系数降低，8％瓶苗出现玻璃化

由于继代次数增加，激素在植物体内积累，3次继代后高浓度6-BA容易导致玻璃化苗出现，增值系数下降等问题，因此优选适于金丝楸增殖的培养基为 N6+6-BA 1.25mg/L+IBA 0.07mg/L，琼脂6.5g/L，蔗糖30g/L，调节PH≈5.8。

2.步骤(3)中Qg培养基的筛选

在含有琼脂6.5g/L，蔗糖15g/L，PH≈5.8的1/2MS培养基中添加不同浓度 6-BA和IBA，培养25-28d调查生根情况，具体见表6。

表6 Qg培养基选择实验

结果表明：在1/2MS+6-BA0.01mg/L+IBA 0.5mg/L培养基上，金丝楸生根效果最好，植株健壮，生根率可达97.2％，平均生根条数4.6，炼苗移栽时易成活。

说明：筛选过程中使用1/2MS培养基为MS培养基中大量元素减半；上述筛选过程只列出产生有意义结果的部分，并未列出全部筛选过程。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种金丝揪的组织培养基，其特征在于，包括初代培养基，增殖培养基和生根培养基，所述初代培养基和所述增殖培养基为Qj培养基，所述生根培养基为Qg培养基，所述Qj培养基为N6+6-BA 1.25mg/L+IBA 0.07mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，所述Qg培养基为1/2MS+6-BA 0.01mg/L+IBA 0.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖15g/L。

2.根据权利要求1所述的一种金丝揪的组织培养基，其特征在于，所述Qj培养基的PH值为5.8，所述Qg培养基的PH值为5.8。

3.利用权利要求1所述的一种金丝揪的组织培养基的金丝揪组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)金丝楸无菌苗获得

4-6月份取金丝楸嫁接苗当年萌发新枝，去除叶片、叶柄、梢头和已木质化基部，剪成3-5cm长带腋芽茎段，将带芽茎段用饱和洗洁净水浸泡10min，用软毛刷轻刷表面后置于流水下冲洗1h；在超净工作台上，用75％酒精处理30s，无菌水冲洗2遍，再用10％次氯酸钠溶液处理3min，无菌水冲洗7遍，截成1.5cm带芽茎段后接种于培养基Qj中，每瓶接种1个进行培养，培养获得金丝楸无菌苗；

2)金丝楸无菌苗继代培养

将培养25-28d，长4-6cm，叶片浓绿健壮的金丝楸无菌苗截成0.5-1cm的基部丛生芽，转接至培养基Qj中，每瓶接种2个，培养得到用于生根或继续继代的金丝楸组培苗；

3)金丝楸组培苗生根培养

选取步骤(2)继代培养中高度大于1cm金丝楸组培苗，保留最上端两个叶片，其他叶片则沿叶柄基部贴茎杆处剪除，转接至生根培养基Qg中，每瓶接种2个，培养得金丝楸生根瓶苗；

4)炼苗和移栽

4.根据权利要求3所述的一种金丝揪组培快繁方法，其特征在于，步骤1)的培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d。

5.根据权利要求4所述的一种金丝揪组培快繁方法，其特征在于，步骤2)的培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d。

6.根据权利要求4所述的一种金丝揪组培快繁方法，其特征在于，步骤3)的培养条件：光照-黑暗交替培养，光照14h，光照强度3000lx，温度25℃，黑暗10h，温度18℃，培养25-28d。

7.根据权利要求3-6任意所述的一种金丝揪组培快繁方法，其特征在于，步骤2)中所述的裁切后的基部丛生芽至少含1个腋芽茎段。