CN111213584B - 一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法 - Google Patents

一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法，包括原代培养、继代培养、不定芽的诱导、壮苗生根培养等步骤；不定芽诱导培养基为：改良的N6基础培养基+6‑BA 2.5 mg/L+IBA 0.01 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0 g/L；本发明操作简便，可在短时间内实现金丝楸组培苗的快速扩增，为金丝楸优秀种植资源保护及规模化快速生产提供技术支持，同时为金丝楸基因工程育种打下基础，对开展金丝楸分子机理研究及种质资源改良都具有十分重要的意义。

Description

一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法
技术领域
本发明涉及一种金丝楸离体叶片高频诱导再生体系的方法，属于楸树组织培养快速扩繁技术领域。
背景技术
楸树(Catalpa bungei C.A.Mey.)为紫葳科(Bignoniaceae)梓属(Catalpa)的落叶乔木，原产于我国，已有2000多年的栽培历史，它广泛分布于长江和黄河流域，适应性强，用途广，是优良园林绿化树种和珍贵的家具用材。金丝楸(Catalpa bungei var.)又称黄楸、箭楸,是楸树中的一个优良地理变种,为华北地区的乡土树种，自然分布于山东、河南、江苏、安徽等省,抗旱、抗病虫害能力强，造林成活率高，可在华北平原以及黄淮、江淮流域推广种植。金丝楸枝叶茂密，树干通直，树形优美，生长速度快，遮阴绿化效果好，开花时花枝繁茂、花色艳丽。金丝楸能隔音降噪，对二氧化硫、氯气等有害气体具有较强的吸收作用,是理想的园林绿化观赏树种。金丝楸木材材质优良,质地坚韧细密、抗压耐腐，纹理美观并有特殊的金黄色，同时也是珍贵的高档家具用材树种。
由于楸树的自交不亲和性，结实出种率低，种子萌发率也不高，采用播种育苗比较困难。因此，楸树繁育多采用借助楸树根部萌蘖能力的埋根摧芽育苗法和嫩枝扦插育苗法，但埋根育苗法存在种根较少、繁殖材料不足的问题，在实际生产中很难大量种植推广；扦插育苗法则存在生根率、成活率不高的瓶颈。目前，金丝楸繁殖、推广存在较大障碍，资源短缺匮乏，在园林绿化、环保、木材市场上供不应求。通过植物组织培养的无性繁殖技术不受季节的限制，能在短时间内实现对优良品种的快速扩增。近年来人们开始研究不同培养基尤其是植物激素的组合和配比对楸树组培的影响，并发现不同楸树基因型对激素的需求变化很大，因此针对不同的楸树品种需要有针对性的建立对应的组培快繁体系。目前针对金丝楸的组织培养技术十分匮乏，并且现有的楸树组培快繁技术多采用以茎尖、茎段为外植体进行扩繁，但是诱导率低、分化效率有限。本发明利用金丝楸叶片为外植体建立无性系繁殖体系，通过诱导从叶片上直接再生出大量的不定芽，进而诱导形成完整的植株，极大的提高了金丝楸的再生率和增殖率，可在短时间内实现再生植株的大量扩增。更为重要的是，人们要深入研究金丝楸的的分子机制并对其进行遗传转化改良，就需要建立金丝楸叶片高效再生体系，然后通过农杆菌介导的叶盘转化法实现转基因。本发明的建立无疑将为金丝楸的基因转导和遗传改良打开通路，将为金丝楸优秀种植资源的保存、种苗的快速扩增以及金丝楸分子机理研究及遗传改良奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便、快速的金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法。
本发明的技术解决方案是：
一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法，其特征是：包括以下步骤：
1)原代培养
取当年生3cm长、带腋芽的金丝楸茎段作为外植体，先用质量百分数0.05％的洗洁精浸泡10min，再用自来水反复冲洗至无气泡；转入超净工作台，无菌水冲洗2～5次，70％乙醇消毒10～60s，无菌水冲洗2～5次，再用0.1％的HgCl2+0.25％的吐温-20消毒5～10min，用无菌水冲洗3～8次，最后用无菌吸水纸吸去表面水分；将茎段接入原代培养基中，培养温度25±2℃，光照强度1000～3000lx，光照时间为16h/d；在原代培养基的诱导下腋芽逐渐萌动、膨大，并逐渐分化出叶片；
原代培养基为：MS基础培养基+6-BA 0.1～5.0mg/L+NAA 0.01～0.1mg/L+KT0.01～1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH值5.7～6.0；
2)继代培养
将原代培养10d以后的萌发腋芽切下，接种到继代培养基上培养；7～10d后接种的腋芽在继代增殖培养基上快速生长，发育成健壮的无菌苗，并且有新的植株分化；
继代培养基为：MS基础培养基+6-BA 0.1～5.0mg/L+IBA 0.01～1.0mg/L+PVP 1.0～50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH值5.7～6.0；
3)不定芽的诱导
选取生长健壮、叶片浓绿的楸树无菌苗，切下叶片，将叶片切成面积1cm2小块，接种在不定芽诱导培养基表面，轻轻按压叶片边缘，使其充分接触培养基；
不定芽诱导培养基为：改良的N6基础培养基+6-BA 0.1～5.0mg/L+IBA 0.01～1.0mg/L+TDZ 0.01～1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L；
所述改良的N6基础培养基为：KNO3 2500mg/L、NH4SO4 650mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO4 270mg/L、CaCl2 165mg/L、KI 0.83mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、H3BO3 6.2mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.25mg/L、FeSO4·7H2O27.85mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、Vitamin B1 1.0mg/L、Vitamin B6 0.5mg/L、Inositol100mg/L、Nicotinic acid 0.5mg/L、Glycine 2.0mg/L、Vitamin C 10mg/L；
4)壮苗生根培养
将金丝楸的壮苗和生根一步完成：切取上述步骤金丝楸叶片诱导产生的不定芽，转接到壮苗生根培养基中进行培养，不定芽发育成为独立生长的健壮的试管苗，并且逐渐产生根，10d后茎的基部可看到白色突起,14d后有白色根形成，最终得到完整的金丝楸试管苗；
所述壮苗生根培养基为：MS培养基+6-BA 0.01～1.0mg/L+NAA 0.01～1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH值5.7～6.0；培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1000～3000lx，光照时间为16h/d。
步骤2)继代培养的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1000～3000lx，光照时间为16h/d。
步骤3)不定芽的诱导的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1000～3000lx，光照时间为16h/d。
本发明方便、快速，为金丝楸规模化快速生产提供技术，同时为金丝楸基因工程育种打下基础，对开展金丝楸分子机理研究及种质资源改良将具有十分重要的意义。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1金丝楸的原代培养照片。
图2金丝楸叶片经诱导再生不定芽照片。
图3金丝楸再生植株照片。
具体实施方式
一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法，其特殊之处在于包括以下步骤：
1)原代培养
取当年生3cm左右带腋芽的金丝楸茎段作为外植体，先用用质量百分数0.05％的洗洁精浸泡10min，再用自来水反复冲洗至无气泡。转入超净工作台，无菌水冲洗3次，70％乙醇消毒30S，无菌水冲洗3次，再用0.1％的HgCl2+0.25％的吐温-20消毒8min，用无菌水冲洗5次，最后用无菌吸水纸吸去表面水分。在该消毒条件下外植体污染及褐化枯死情况都比较低。将茎段接入原代培养基中，培养温度25±1℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为16h/d。在原代培养基的诱导下腋芽逐渐萌动、膨大，并逐渐分化出叶片。
原代培养基为：MS基础培养基+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH值5.8。
2)继代培养
将原代培养10d以后的萌发腋芽切下，接种到继代培养基上。培养温度25±1℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为16h/d。7-10d后接种的腋芽在继代增殖培养基上快速生长，发育成健壮的无菌苗，并且有新的植株分化。
继代培养基为：MS基础培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)20mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH值5.8。
3)不定芽的诱导
选取生长健壮、叶片浓绿的楸树无菌苗，切下叶片，将叶片切成面积约1cm2小块，接种在不定芽诱导培养基表面，轻轻按压叶片边缘，使其充分接触培养基。培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为16h/d。
不定芽诱导培养基先以常规的MS为基础培养基，添加6-BA、IBA和TDZ(苯基噻二唑基脲)等植物激素，其中TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的诱导不定芽的活性，可以促进外植体愈伤组织是生产和芽的再生。分别将三种激素设定3个浓度水平设计正交试验，共产生9种不定芽诱导培养基，每种培养基5瓶，每个三角瓶接种3个叶片，观测并统计每种培养基的再生植株频率，以确定最适宜的不定芽诱导培养基。
不定芽再生频率＝再生不定芽总数/接种的外植体数。
实验结果见表1，结果所有设计的不定芽诱导培养基均不能诱导再生芽的产生，可见采用常规技术手段很难达到本发明的目的。
表1 MS基础培养添加不同浓度的植物激素对不定再生芽产生的影响
Figure BDA0002379244730000051
经过反复实验，我们对基础培养基进行了改良，在N6培养基的基础上结合MS培养基对营养成分进行调整，最终确定了改良的N6基础培养基，具体包括以下成分：KNO32500mg/L、NH4SO4 650mg/L、MgSO4·7H2O 370mg/L、KH2PO4 270mg/L、CaCl2 165mg/L、KI0.83mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、H3BO3 6.2mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.25mg/L、FeSO4·7H2O 27.85mg/L、Na2-EDTA 37.25mg/L、VitaminB1(盐酸硫胺素)1.0mg/L、Vitamin B6(烟酸吡哆醇)0.5mg/L、Inositol(肌醇)100mg/L、Nicotinic acid(烟酸)0.5mg/L、Glycine(甘氨酸)2.0mg/L、Vitamin C 10mg/L(培养基灭菌后放冷至60℃加入)。在此基础培养中附加6-BA、IBA和TDZ3种激素各3个浓度水平设计正交试验，实验结果见表2。
表2改良的N6基础培养基添加不同浓度的植物激素对不定再生芽诱导的影响
Figure BDA0002379244730000061
经过10-14d诱导后，2号和3号培养基上的金丝楸叶片外植体成功再生出不定芽，其中2号培养基的不定芽再生频率为5.2；3号培养基的不定芽再生频率为11.3,其余培养基的激素组合均不能成功诱导不定芽的再生。由此说明诱导金丝楸叶片产生再生不定芽对培养基的营养成分和激素配比的要求十分苛刻，成分稍有变动便不能成功诱导不定芽的产生。而最终确定的3号培养基：改良的N6基础培养基+6-BA 2.5mg/L+IBA 0.01mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L可以达到理想的诱导叶片再生不定芽的效果，能够产生10倍以上的再生率，确定为不定芽诱导培养基。
4)壮苗生根培养
将金丝楸的壮苗和生根一步完成：切取上述步骤金丝楸叶片诱导产生的不定芽生，转接到壮苗生根培养基中进行培养，不定芽可发育成为独立生长的健壮的试管苗，并且逐渐产生根，10d后茎的基部可看到白色突起,14d后有白色的根形成，最终得到完整的金丝楸试管苗。
所述壮苗生根培养基为：MS培养基+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH值5.8。培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度1500～2000lx，光照时间为16h/d。

Claims (3)

1.一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法，其特征是：包括以下步骤：
1）原代培养
取当年生3cm长、带腋芽的金丝楸茎段作为外植体，先用质量百分数0.05%的洗洁精浸泡10 min，再用自来水反复冲洗至无气泡；转入超净工作台，无菌水冲洗2~5次，70%乙醇消毒10~60 s，无菌水冲洗2~5 次，再用0.1%的HgCl2+0.25%的吐温-20消毒5~10 min，用无菌水冲洗3~8 次，最后用无菌吸水纸吸去表面水分；将茎段接入原代培养基中，培养温度25±2 ℃，光照强度1000~3000 lx，光照时间为16 h/d；在原代培养基的诱导下腋芽逐渐萌动、膨大，并逐渐分化出叶片；
原代培养基为：MS基础培养基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.1 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7.0 g/L，pH值5.8；
2）继代培养
将原代培养10d以后的萌发腋芽切下，接种到继代培养基上培养；7~10 d后接种的腋芽在继代增殖培养基上快速生长，发育成健壮的无菌苗，并且有新的植株分化；
继代培养基为：MS基础培养基+ 6-BA 2.0 mg/L+ IBA 0.1 mg/L+PVP20 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0 g/L，pH值5.8；
3）不定芽的诱导
选取生长健壮、叶片浓绿的楸树无菌苗，切下叶片，将叶片切成面积1cm2小块，接种在不定芽诱导培养基表面，轻轻按压叶片边缘，使其充分接触培养基；
不定芽诱导培养基为：N6基础培养基+ 6-BA 2.5 mg/L+ IBA 0.01 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂7.0 g/L；
所述改良的N6基础培养基为：KNO3 2500 mg/L、NH4SO4 650 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、KH2PO4 270 mg/L、CaCl2 165 mg/L、KI 0.83 mg/L、MnSO4·H2O 10 mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、ZnSO4·7H2O 4.3 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L、CoCl2·6H2O 0.25 mg/L、FeSO4·7H2O27.85 mg/L、Na2-EDTA 37.25 mg/L、Vitamin B1 1.0 mg/L、Vitamin B6 0.5 mg/L、Inositol 100 mg/L、Nicotinic acid 0.5 mg/L、Glycine 2.0 mg/L、Vitamin C 10 mg/L；
4）壮苗生根培养
将金丝楸的壮苗和生根一步完成：切取上述步骤金丝楸叶片诱导产生的不定芽，转接到壮苗生根培养基中进行培养，不定芽发育成为独立生长的健壮的试管苗，并且逐渐产生根，10 d后茎的基部可看到白色突起, 14 d 后有白色根形成，最终得到完整的金丝楸试管苗；
所述壮苗生根培养基为：MS培养基+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂7.0g/L，pH值5.8；培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度1500~2000 lx，光照时间为16 h/d。
2.根据权利要求1所述的一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法，其特征是：步骤2）继代培养的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1000~3000 lx，光照时间为16 h/d。
3.根据权利要求1所述的一种金丝楸叶片高频诱导再生植株的方法，其特征是：步骤3）不定芽的诱导的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1000~3000 lx，光照时间为16 h/d。
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