CN115245131B - 一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法 - Google Patents
一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115245131B CN115245131B CN202111528977.7A CN202111528977A CN115245131B CN 115245131 B CN115245131 B CN 115245131B CN 202111528977 A CN202111528977 A CN 202111528977A CN 115245131 B CN115245131 B CN 115245131B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- seedlings
- medium
- callus
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000169546 Lycium ruthenicum Species 0.000 title claims abstract description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 9
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 52
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 49
- 244000241838 Lycium barbarum Species 0.000 claims abstract description 32
- 235000015459 Lycium barbarum Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 27
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 26
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 26
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 23
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 23
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 23
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 22
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000015468 Lycium chinense Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 9
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 8
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 244000241872 Lycium chinense Species 0.000 claims description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 6
- 239000012883 rooting culture medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 claims description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 3
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 claims description 2
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 claims description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 claims description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 claims 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 abstract description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000017784 Mespilus germanica Nutrition 0.000 description 2
- 244000182216 Mimusops elengi Species 0.000 description 2
- 235000000560 Mimusops elengi Nutrition 0.000 description 2
- 235000007837 Vangueria infausta Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005972 6-Benzyladenine Substances 0.000 description 1
- -1 6-benzyl adenine Chemical compound 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010016807 Fluid retention Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000028446 budding cell bud growth Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000011869 dried fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000005089 fruit drop Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/002—Culture media for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Abstract
本发明属于木本植物组织培养繁育技术领域，涉及一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法，所述方法包括(1)制备外植体；(2)愈伤组织诱导培养；(3)丛芽分化诱导培养；(4)生根诱导培养；(5)组培苗驯化移栽。通过上述方法建立了高效的扁果枸杞组织培养再生体系，为建立扁果枸杞高效遗传转化体系、脱毒苗和转基因苗的扩繁、优良品种选育奠定了基础；同时克服了扁果枸杞幼苗繁殖的季节限制，适合在生物技术领域推广运用。
Description
技术领域
本发明属于木本植物组织培养繁育技术领域，具体涉及一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法。
背景技术
宁夏枸杞(Lycium barbarum L)是一种我国西北地区广泛栽培的经济灌木，耐旱、耐盐碱、耐贫瘠性极强，常用于防风固沙和开发盐碱地的先锋旱生植物，也是一种家畜的优良牧草。同时，宁夏枸杞还是西北半干旱地区重要的药用栽培经济林种，其根、叶、果实均可入药，尤其是其干燥果实——枸杞子，作为名贵中药和滋补品已有两千多年的历史，在东南亚地区享有盛誉。宁夏枸杞具有极强的耐旱性，其发达的角质层蜡质，对提高地上部器官的保水性和增强干旱环境的适应性有重要的作用。对宁夏枸杞角质层蜡质合成分子机制开展深入研究可为系统理解旱生植物的抗旱适应机制挖掘其相关功能基因奠定理论基础，这对我国西北干旱地区生态环境建设和栽培作物的抗旱性遗传改良具有十分重要的理论意义和实践价值；同时，研究植物表皮蜡质的合成机制也对提高植物的抗病、抗虫性有重要意义。
扁果枸杞(Lycium barbarum Bianguo)是宁夏枸杞的一个品种，也是研究植物表皮蜡质合成的良好实验材料。在基因功能验证的实验过程中，需要通过组织培养进行遗传转化，建立完善的组织培养再生体系必不可少。
发明人在实验过程中首次发现，以扁果枸杞的茎段为外植体诱导愈伤组织可以分化得到完整的植株，但是存在以下两个问题：(1)茎段在诱导不定芽时容易出现茎节腋芽残留，进而出现假阳性不定芽，影响组培苗培育。(2)一般茎段数量有限，不能满足大规模侵染需要；因此，在本发明中，发明人以叶组织块为外植体，诱导愈伤、丛芽，从而得到完整的植株。避免了假阳性的问题，同时也可以大大缩短实验周期。除此之外，发明人在实验过程中发现，愈伤组织诱导培养、丛芽分化诱导培养和生根诱导培养的培养基组成成分以及配比也显著的影响实验结果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法，包括以下步骤：
A制备外植体：采用扁果枸杞无菌实生苗或无菌扦插苗的叶作为外植体，无菌手术刀将叶切成方块状；接种到愈伤组织诱导培养基中培养3周得到有愈伤组织的叶组织块；所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0-2mg/L的6-BA、0.2-2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；所述愈伤组织诱导培养基的pH＝5.8；
B愈伤组织诱导培养：将步骤A的得到的叶组织块，接入新鲜的愈伤组织诱导培养基中培养4周，诱导出愈伤组织；
C丛芽分化诱导培养：将步骤B得到的愈伤组织转接到丛芽分化培养基中培养4-5周，长出丛芽，当不定芽长出4-6片叶时用于生根诱导；所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0-2mg/L的6-BA、0-2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；所述丛芽分化培养基的pH＝5.8；
D生根诱导培养：将步骤C的长出4-6片叶的丛芽接到生根培养基上培养2周，长出不定根；所述生根培养基由1/2MS培养基、30g/L的蔗糖、0-0.3mg/L的6-BA、0.2-0.6mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；所述生根培养基的pH＝5.8；
E组培苗驯化移栽：当步骤D的不定芽长成幼苗，幼苗长至4～6cm高时，揭开培养瓶上的封口膜，晾3-5天后，取出幼苗，洗去根部的琼脂，移栽入营养土中，完成再生体系的建立。
优选的，步骤A中所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0-2mg/L的6-BA、1-2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成。
优选的，步骤A中所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的6-BA、1mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成。
优选的，步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2-1mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；或步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、2mg/L的6-BA、0-0.5mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成。
优选的，步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；或步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；或步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、2mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成。
优选的，步骤D所述生根培养基由1/2MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2-1mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成。
优选的，步骤D所述生根培养基由1/2MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成。
优选的，在步骤A中，所述扁果枸杞无菌实生苗的培养方法如下：(1)挑选成熟饱满的种子，将其放在三角瓶中，三角瓶中加入洗洁精和无菌水，震荡洗涤6-10min；(2)在超净工作台上用2％次氯酸钠浸泡8-10min，后用无菌水冲洗5-8次；(3)用75％的无水乙醇震荡洗涤两次，每次30s，无菌水冲洗5-8次；(4)冲洗干净后，用无菌滤纸吸干扁果枸杞种子表面水分，将种子接种于有MS培养基的培养瓶中；(5)每瓶接种5粒种子，黑暗培养5-7d待种子萌发后移入人工气候箱培养4周，得到无菌实生苗。
优选的，在步骤A中，取无菌实生苗从顶芽向下第4和第5茎节处的叶，剪成0.3cm×0.3cm的叶组织块。
优选的，所述无菌实生苗培养在温度25±2℃，光照/黑暗周期为16h/8h，光照强度1800Lx的条件下进行。
优选的，所述MS培养基包括1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、370mg/L MgSO4·7H2O、170mg/L KH2PO4、440mg/L CaCL2·2H2O、22.3mg/L MnSO4·4H2O、8.6mg/L ZnSO4·7H2O、6.2mg/L H3BO3、0.83mg/L KI、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O、37.3mg/L Na2-EDTA、27.8mg/L FeSO4·4H2O、2.0mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L烟酸和100mg/L肌酸。
优选的，步骤B、C、D所述的愈伤组织诱导培养、丛芽分化诱导培养、生根诱导培养均在温度25±2℃，光照/黑暗周期为16h/8h，光照强度1800Lx的条件下进行。
优选的，步骤A、C、D中采用1mol/L NaOH调节培养基pH。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供的扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法，使用愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0-2mg/L的6-BA、0.2-2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成，可以显著促进扁果枸杞叶组织块愈伤组织的形成；愈伤组织诱导率达70％以上，最高可达97.5％；
(2)本发明提供的扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法，使用丛芽分化培养基，步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；或步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；或步骤C中所述丛芽分化培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、2mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成。可以显著促进扁果枸杞叶组织块愈伤组织的形成丛芽；丛芽的分化率超过80％，最高达86.7％；
(3)本发明提供的扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法，使用生根培养基，所述生根培养基由1/2MS培养基、30g/L的蔗糖、0-0.3mg/L的6-BA、0.2-0.6mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成；可以显著促进扁果枸杞丛芽的生根；生根率超过70％，最高达93.3％。
(4)利用植物组织培养技术对扁果枸杞优良性状进行保留并世代传递，避免种性退化和遗传变异；利用植物组织培养技术对扁果枸杞进行再生体系构建，培养条件不受外界天气变化和病虫害的影响；该方法成本低廉、愈伤组织诱导率高、重复性好、生产和生长周期短。
(5)通过上述方法建立了高效的扁果枸杞组织培养再生体系，为建立扁果枸杞高效遗传转化体系、脱毒苗和转基因苗的扩繁、优良品种选育奠定了基础；同时克服了扁果枸杞幼苗繁殖的季节限制，适合在生物技术领域推广运用。
附图说明
图1扁果枸杞叶组织块形态
图2扁果枸杞叶组织在愈伤组织诱导培养基上培养3周后形态
图3扁果枸杞叶组织在愈伤组织诱导培养基上培养7周后形态
图4扁果枸杞叶组织在不定芽分化培养基上培养4周后形态
图5扁果枸杞不定芽长成幼苗
具体实施方式
下面将结合本发明实例中的附图，对本发明实例中的技术方案进行清楚完整的描述，很显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动力前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本文发明主题做任何限制。在本申请中，必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用术语“包括”以及其他形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。
本发明所述的“NAA”是指1-萘乙酸，是一种有机化合物，分子式是C12H10O2，简称NAA。不溶于水，但微溶于热水，且在潮湿环境中易分解。萘乙酸系萘类具有生长素类活性的植物生长调节剂，由根、茎、叶吸收。萘乙酸广泛用于农业、林业、蔬菜、花卉、果树等领域，诱发不定根形成，提高树木扦插成活率；提高座果率，防止采前落果。
本发明所述的“6-BA”是6-苄氨基嘌呤，别称有6-苯甲基腺嘌呤等，化学物品，分子式为C12H11N5，白色结晶粉末，难溶于水，微溶于乙醇，在酸、碱中稳定。6-苄氨基嘌呤的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。可用于提高茶叶、烟草的质量及产量；蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育，明显提高果品及叶片的品质。
实施例一、一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法
(1)无菌实生苗培养
2020年10月中旬，挑选成熟饱满的种子，将其放在100ml三角瓶中，三角瓶中加入第一滴洗洁精和10ml的无菌水，震荡洗涤6-10min，然后在超净工作台上用2％的次氯酸钠浸泡8-10min，结束后无菌水冲洗5-8次，再用75％的无水乙醇震荡洗涤两次，每次30s，无菌水冲洗5-8次。冲洗干净后，用无菌滤纸吸干扁果枸杞种子表面残余水分，将种子接种于有MS培养基的350mL培养瓶中。每瓶接种5粒种子，黑暗培养5-7d待种子萌发后移入人工气候箱培养4周，得到无菌实生苗。
(2)外植体制备
2020年11月中旬，取步骤(1)的无菌实生苗从顶芽向下第4和第5茎节处的叶，剪成0.3cm×0.3cm(图1)；接种外植体时间为9月中旬至次年5月中旬最佳(图1)。
(3)愈伤组织诱导
将步骤(2)的叶组织块接种到愈伤组织诱导培养基中培养至2020年12月上旬，得到叶边缘有少量愈伤组织的叶组织块(图2)；将叶边缘的少量愈伤组织切下，接入新鲜的愈伤组织诱导培养基中培养至2021年1月上旬，得到大量愈伤组织(图3)；愈伤组织诱导培养基由MS培养基、30g/L蔗糖、0.2mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA、5.5g/L琼脂组成，pH＝5.8；在温度25±2℃，光照/黑暗周期为16h/8h，光照强度1800Lx的条件下进行培养；
(4)诱导丛芽分化
将步骤(3)的愈伤组织的转接到丛芽分化培养基中培养至2021年2月上旬，长出丛芽(图4)，当不定芽长出4-6片叶时用于生根诱导；丛芽分化培养基由pH为5.8的MS培养基、30g/L蔗糖、0.2mg/L NAA、5.5g/L琼脂组成；在温度25±2℃，光照/黑暗周期为16h/8h，光照强度1800Lx的条件下进行培养；
(5)诱导不定芽生根
将步骤(4)的丛芽接到生根培养基上培养至2021年3月上旬，长出不定根(图5)，生根培养基由1/2MS培养基、30g/L蔗糖、0.2mg/L NAA、5.5g/L琼脂组成；生根培养基的pH＝5.8；在温度25±2℃，光照/黑暗周期为16h/8h，光照强度1800Lx的条件下进行培养；
(6)无菌苗的炼苗驯化
将步骤(5)的生根不定芽培养至2021年4月上旬，株高4～6cm时，揭开培养瓶上的封口膜，晾3-5天后，取出幼苗，自来水洗去根部的琼脂，移栽入灭菌的营养土中，培育成完整的再生植株。在温度25±2℃，光照/黑暗周期为16h/8h，光照强度1800Lx的条件下进行培养。
实验结果分析
表1不同激素配比对扁果枸杞外植体愈伤组织诱导的影响
注：显著性水平p<0.05，同一列相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异具有显著性。
表2不同激素配比对扁果枸杞愈伤组织分化不定芽的影响
注：显著性水平p<0.05，同一列相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异具有显著性。
表3不同激素配比对扁果枸杞不定芽生根诱导的效果
注：显著性水平p<0.05，同一列相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异具有显著性。
不同激素配比对扁果枸杞外植体愈伤组织诱导的影响如表1所示，从表1中可知，当愈伤组织诱导培养基中含有1.0mg/L或2.0mg/L NAA；或含有0.2mg/L 6-BA，且1.0mg/L或2.0mg/L NAA；或0.5mg/L 6-BA，且0.5mg/L或2.0mg/L NAA；或1mg/L 6-BA，且2.0mg/L NAA；或2mg/L 6-BA，且2.0mg/L NAA时，由扁果枸杞叶组织块诱导愈伤组织的诱导率可达70％以上，愈伤组织诱导培养基中含有0.2mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA时的诱导率达97.5％(表1)，叶组织块可完全脱分化成愈伤组织，愈伤组织鲜嫩且活力好。
不同激素配比对扁果枸杞愈伤组织分化不定芽的影响如表2所示，从表2中可知，当MS培养基中含有0.2mg/L NAA；或2mg/L 6-BA；或2mg/L 6-BA，且0.5mg/L NAA时，扁果枸杞由愈伤组织分化为不定芽的分化率可达70％以上，丛芽分化培养基中含有0.2mg/L NAA时的分化率达86.7％(表2)，不定芽多，分化明显。
不同激素配比对扁果枸杞不定芽生根诱导的影响如表3所示，从表3中可知，当1/2培养基中含有0.2mg/L NAA；或0.6mg/L NAA时，扁果枸杞不定芽的生根率可达70％以上，生根培养基中含有0.2mg/L NAA时的分化率达93.3.7％(表3)，根主根长且粗，须根繁密，生长快。
综上所述，本发明所述的一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法，能够由叶组织块经愈伤组织、不定芽长成完整植株。本发明所述方法操作简便，适于推广应用，具有广阔的市场前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种扁果枸杞组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
A、制备外植体：采用扁果枸杞无菌实生苗或无菌扦插苗的叶作为外植体，无菌手术刀将叶切成方块状；接种到愈伤组织诱导培养基中培养3周得到有愈伤组织的叶组织块；所述愈伤组织诱导培养基由MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的 6-BA、1.0mg/L的 NAA、5.5g/L的琼脂组成；所述愈伤组织诱导培养基的pH＝5.8；
B、愈伤组织诱导培养：将步骤A的得到的叶组织块，接入新鲜的愈伤组织诱导培养基中培养4周，诱导出愈伤组织；
C、丛芽分化诱导培养：将步骤B得到的愈伤组织转接到丛芽分化培养基中培养4-5周，长出丛芽，当不定芽长出4-6片叶时用于生根诱导；所述丛芽分化培养基由 MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成； 所述丛芽分化培养基的pH＝5.8；
D、生根诱导培养：将步骤C的长出4-6片叶的丛芽接到生根培养基上培养2周，长出不定根；所述生根培养基由 1/2MS培养基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂组成； 所述生根培养基的pH＝5.8；
E、组培苗驯化移栽：当步骤D的不定芽长成幼苗，幼苗长至4～6cm高时，揭开培养瓶上的封口膜，晾3-5天后，取出幼苗，洗去根部的琼脂，移栽入营养土中，完成再生体系的建立；
所述MS培养基为1900mg/L KNO3、1650mg/L NH4NO3、370mg/L MgSO4·7H2O、170mg/LKH2PO4、440mg/L CaCL2·2H2O、22.3mg/L MnSO4·4H2O、8.6mg/L ZnSO4·7H2O 、6.2mg/LH3BO3、0.83mg/L KI、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O、37.3mg/L Na2-EDTA、27.8mg/L FeSO4·4H2O、2.0mg/L 甘氨酸、0.1mg/L 盐酸硫胺素、0.5mg/L 盐酸吡哆醇、0.5mg/L 烟酸和100mg/L 肌酸。
2.如权利要求1所述的扁果枸杞组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，在步骤A中，所述扁果枸杞无菌实生苗的培养方法如下：（1）挑选成熟饱满的种子，将其放在三角瓶中，三角瓶中加入洗洁精和无菌水，震荡洗涤6-10min；（2）在超净工作台上用2% 次氯酸钠浸泡8-10min，后用无菌水冲洗5-8次；（3）用75%的无水乙醇震荡洗涤两次，每次30s，无菌水冲洗5-8次；（4）冲洗干净后，用无菌滤纸吸干扁果枸杞种子表面水分，将种子接种于有MS培养基的培养瓶中；（5）每瓶接种 5粒种子，黑暗培养5-7d待种子萌发后移入人工气候箱培养4周，得到无菌实生苗。
3.如权利要求1所述的扁果枸杞组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，在步骤A中，取无菌实生苗从顶芽向下第4和第5茎节处的叶，剪成0.3cm×0.3cm的叶组织块。
4.如权利要求2所述的扁果枸杞组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，所述无菌实生苗培养在温度25±2℃，光照/黑暗周期为 16h/8h，光照强度 1800Lx的条件下进行。
5.如权利要求1-4任一项所述的扁果枸杞组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤B、C、D所述的愈伤组织诱导培养、丛芽分化诱导培养、生根诱导培养均在温度25±2℃，光照/黑暗周期为 16h/8h，光照强度 1800Lx的条件下进行。
6.如权利要求1所述的扁果枸杞组织培养再生体系的建立方法，其特征在于，步骤A、C、D中采用1mol/L NaOH调节培养基pH。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111528977.7A CN115245131B (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111528977.7A CN115245131B (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115245131A CN115245131A (zh) | 2022-10-28 |
| CN115245131B true CN115245131B (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=83697777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111528977.7A Active CN115245131B (zh) | 2021-12-14 | 2021-12-14 | 一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115245131B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116636460A (zh) * | 2023-05-29 | 2023-08-25 | 江南大学 | 一种高抗氧化活性的宁夏枸杞愈伤组织诱导培养基及诱导方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107135950A (zh) * | 2017-06-19 | 2017-09-08 | 南京晓庄学院 | 一种快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法 |
| CN108588192A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-09-28 | 沈阳农业大学 | 一种筛选黑果枸杞离体再生相关msap位点的方法 |
-
2021
- 2021-12-14 CN CN202111528977.7A patent/CN115245131B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107135950A (zh) * | 2017-06-19 | 2017-09-08 | 南京晓庄学院 | 一种快速获得黑果枸杞再生苗的培育方法 |
| CN108588192A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-09-28 | 沈阳农业大学 | 一种筛选黑果枸杞离体再生相关msap位点的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 乔永旭 ; .黑果枸杞高频再生体系的建立.中药材.2015,(第10期),第2031-2034页. * |
| 乔永旭 ; 张永平 ; 张红心 ; 陈超 ; 王桂兰 ; .宁夏枸杞再生体系的建立.江苏农业科学.2011,(第01期),全文. * |
| 高思丹 等."青海野生黑果枸杞再生体系的建立及遗传稳定性分析".《西北植物学报》.2020,第第40卷卷(第第2期期),第252-260页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115245131A (zh) | 2022-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102301952B (zh) | 一种甘菊繁殖方法 | |
| CN100334946C (zh) | 一种迎红杜鹃组培快繁和移栽方法 | |
| CN102577969A (zh) | 灰毡毛忍冬渝蕾1号组培种苗的繁育方法 | |
| CN104285813A (zh) | 一种金花茶组培繁殖方法 | |
| CN104642109A (zh) | 一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法 | |
| CN109122312B (zh) | 一种使报春石斛种子快速繁殖成苗的培养基及方法 | |
| CN115245131B (zh) | 一种扁果枸杞组织培养再生体系的构建方法 | |
| CN103155868B (zh) | 樱桃砧木zy-1组培快速育苗方法 | |
| CN109156350B (zh) | 一种抗风桐繁芽与生根培养基及促进抗风桐离体快速繁殖的方法 | |
| CN109122315B (zh) | 一种利用矾根叶柄培育种苗的方法 | |
| CN108391591B (zh) | 一种黄花风铃木组织培养快繁方法 | |
| CN104686336A (zh) | 一种臭椿组培快繁殖方法 | |
| CN115152629A (zh) | 一种树莓组织培养方法 | |
| CN115005105A (zh) | 一种蓝莓组织培养方法 | |
| CN107484665A (zh) | 一种利用黑果枸杞休眠枝条成苗的方法 | |
| CN112273229B (zh) | 八仙花一步成苗方法 | |
| CN110169360B (zh) | 一种丝带草繁殖培育的方法 | |
| CN113678736A (zh) | 一种花叶芋的组培快速繁殖方法 | |
| CN102948370A (zh) | 一种马比木的快速繁殖方法 | |
| CN109526748B (zh) | 一种白鹤芋花序组织培养方法 | |
| CN109258475B (zh) | 一种木槿繁殖培育的方法 | |
| CN102487825B (zh) | 以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法 | |
| CN105340742A (zh) | 一种云南樱桃成年优良单株“广州”樱的组培快繁方法 | |
| CN110583486A (zh) | 一种高抗逆性构树的培育方法 | |
| CN104145821A (zh) | 黄果银桦的离体培养再生植株方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |