CN108588192A - 一种筛选黑果枸杞离体再生相关msap位点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括：1）培养无菌种苗；2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；5）分别采用EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；6）预PCR扩增反应；7）选择性PCR扩增反应；8）毛细管电泳；9）统计分析，筛选出黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；10）特异性条带的回收、测序和分析；本发明可迅速筛选出叶片再生相关MSAP位点，且与移栽驯化无关；这类位点的挖掘对最终揭示木本植物叶片脱分化和再分化机理有重要意义，丰富了植物表观遗传学内容。
Description
技术领域
本发明属于植物表观遗传学领域，具体涉及一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法。
背景技术
黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木，是一种盐生药用植物，重要的生态经济型树种。在我国，黑果枸杞主要分布在宁夏、山西、甘肃、青海、新疆、西藏等省区。黑果枸杞中含有多种人体必需的氨基酸和微量元素，可提高人体免疫能力；黑果枸杞被称为原花青素之王，其原花青素具有清除自由基、增强免疫力、延长果蝇寿命、降低小鼠血清总胆固醇和甘油三脂、升高血清、肝组织和机体总抗氧化能力等功效；从果汁中提取的黑果枸杞色素稳定性好、着色力强，是国内急需的理想食用天然花色甙，不但可应用于药品和食品中，还可作为天然染料应用于轻纺工业。同时，黑果枸杞具有抗旱、抗寒、耐盐碱、根蘖性强和耐土壤贫瘠等诸多优点，是盐碱地治理、护坡、防止水土流失的良好树种。我们前期研究建立了稳定高效的黑果枸杞离体快速繁殖方法，包括以叶片为外植体的直接和间接器官发生，表明黑果枸杞是研究木本植物叶片脱分化和再分化机理的理想实验材料。
植物组织培养在林业上具有广泛的应用和更加重要的意义。愈伤组织阶段能抹除外植体原有的年龄痕迹，从而使植物材料“返老还童”。因此，经过愈伤组织阶段产生的再生植株通常具备较小的生理年龄而更符合造林需求。但是木本植物外植体脱分化形成愈伤组织的分子机理目前尚不清楚，这限制了木本植物离体再生体系的建立和应用。已有研究证明黑果枸杞是探索木本植物叶片脱分化机理的理想实验材料。本发明在前期研究的基础上，筛选出非常稳定的愈伤特异性MSAP（甲基化敏感的扩增片段长度多态性）位点。对位点相关基因的进一步研究，可为建立更加理想的黑果枸杞再生体系打下基础，为攻克其它木本植物的“组培难”问题和保护濒危珍贵种质资源提供理论依据，为木本植物的分子育种奠定基础。此外，叶片脱分化表观遗传机理的研究可以丰富树木表观遗传学理论、植物细胞全能性理论、基因表达调控理论等。
甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术，用于测定DNA甲基化程度，这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用。这项技术是在AFLP分子标记技术的基础上衍生出来的，是基于PCR扩增的DNA甲基化多态性的检测方法，即将标准的AFLP分子标记分析中使用的高频酶Mse I，替换成了一对同裂酶Hpa II和Msp I，而此对同列酶对甲基化识别位点敏感性不同，而其余操作与AFLP完全一样。主要操作步骤包括基因组DNA双酶切、人工接头连接、MSAP预扩增反应、MSAP选择性扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳、条带统计分析等。MSAP可以检测在DNA序列没有发生变化时，基因组DNA的甲基化修饰水平，又能够对DNA特异性位点的甲基化状态进行检测。MSAP 技术相对其他测定DNA 甲基化程度的技术有如下优点：(1)不需知道被测DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA 序列背景知识未知的生物；(2)操作相对简便，在AFLP 技术体系的基础无需改进，即可操作；(3)可在全基因组范围检测CCGG 位点的胞嘧啶甲基化变化；（4）MSAP技术的引物设计简单。
发明内容
本发明目的是提供一种有效且低成本的筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法。
一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：
1）培养无菌种苗；
2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；
3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；
4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；
5）分别采用 EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；
6）预PCR扩增反应；
7）选择性PCR扩增反应；
8）毛细管电泳；
9）统计分析，筛选出愈伤组织特异性的MSAP位点，即黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；
10）特异性条带的回收、测序和分析；
步骤5）中所述的双酶切，反应体系为：
反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
将混匀的体系，在37℃进行DNA酶切6h之后，每个反应体系添加T4 ligase0.1μL，混匀后在8℃下进行接头连接4h；
步骤5）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，冷却后得到；
步骤6）中预PCR扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（酶切连接产物稀释20倍后） 2 μl
Total volume 25 μl；
反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30s，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍；
步骤7）中选择性PCR扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl；
混匀体系，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；
步骤7）所述的选择性 PCR扩增，引物对如下：
EcoRⅠ引物5’端分别用F6-羧基荧光素（FAM）、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺（HEX）或TAMARA等进行标记。
本发明提供了一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括：1）培养无菌种苗；2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；5）分别采用 EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；6）预PCR扩增反应；7）选择性PCR扩增反应；8）毛细管电泳；9）统计分析，筛选出黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；10）特异性条带的回收、测序和分析；本发明可迅速筛选出叶片再生相关MSAP位点，这类MSAP位点属于与再生相关且与移栽驯化无关的MSAP位点，很值得进一步深入研究；这类位点的挖掘对最终揭示木本植物叶片脱分化和再分化机理有重要意义，丰富了植物表观遗传学内容。
附图说明
图1 筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点流程图。
具体实施方式
实施例1一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法
1.获得无菌种苗
将黑果枸杞成熟种子置于37 ℃温水中处理24小时；在无菌超净工作台中用70-75%酒精浸泡种子30 S-1min，迅速将种子置于0.2%的氯化汞水溶液中浸泡2 min；无菌水冲洗4遍后，将种子表面的水吸干并横向平接在不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min），注意种子和培养基一定要紧密接触。将接种的材料置于25 ℃、“光照12 h/黑暗12h”光周期条件下培养，光照为3000 lx。
2.接种叶片外植体获得愈伤组织和再生植株
待上步接种的种子萌发并长出4片以上真叶时，于超净工作台将叶片横向剪为4 mm的小块，接种到添加6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1的MS固体培养基（蔗糖3.5%；琼脂0.45%；pH5.6；121℃高压灭菌16 min）。将接好的材料置于7 lx散射光下培养，培养温度为25 ℃；此条件下叶片外植体迅速脱分化产生黄色愈伤组织；待愈伤组织的表面出现结节样结构时，将其置于“光照12 h/黑暗12h”的光周期条件下培养，光照3000 lx。此条件下愈伤迅速产生不定芽；待不定芽长至2 cm高时，将其剪下插入不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16min）诱导生根。
3.供体植株及叶再生植株移栽驯化
将接有生根完整植株和供体植株的组培玻璃瓶置于自然光下驯化，待叶色浓绿健壮之时进行开瓶移栽。移栽采用环境条件逐级过渡的方式，保鲜膜覆盖保湿和浇灌多菌灵是必要的。完全揭去保鲜膜后，即便盆土保持100%田间持水量，材料地上部分也通常会萎蔫；经过2-7天之后材料又恢复正常。
4.提取基因组总DNA
选取没有玻璃化的非结节样愈伤组织、组培瓶内的供体植株和再生植株的发育完全的健康叶片、移栽后成活的供体植株和再生植株的新发枝条的发育完全的健康叶片用于提取基因组总DNA；至少选取三株供体植株的无性系作为实验材料，同一株系的愈伤组织和再生植株均要设置重复；同一株系的瓶内取材植株和移栽后取材植株要一致；即瓶内取完叶片之后驯化移栽，移栽成活后从新发枝条上再次取叶片作为供试材料；采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取DNA；洗脱DNA采用121℃灭菌20 min的1%的TE缓冲液。采用1%琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白测定仪测量提取DNA的纯度和浓度。
5.MSAP比较分析
MSAP大概步骤如下：
1）接头制作
本实验用到接头序列如下，
EcoRⅠ-adapterⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
EcoRⅠ-adapterⅡ：5’-AATTGGTACGCAGTC-3’
H/M-adapterⅠ：5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’
H/M-adapterⅡ：5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’
单链接头复性为双链接头的方法：先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，缓慢冷却至室温，-20 ℃冷冻保存备用。
2）DNA酶切与连接
①反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μ
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
②反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
将混匀体系，在37 ℃进行DNA酶切6 h后，每个反应体系中加入T4 ligase 0.1 μL，混匀后于8 ℃进行接头连接4 h。
3）预扩增
将酶切连接产物稀释20倍用于预扩增；
①预扩增引物为：
EcoRI+A： 5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’
H/M+0: 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’；
②MSAP预扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（稀释后酶切连接产物） 2 μl
Total volume 25 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100bp-1000bp范围内DNA呈弥散状分布为最佳酶切连接结果；根据DNA弥散的亮度，用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍，作为PCR选择性扩增的DNA模板。
4）选择性扩增
采用引物组合H4（表1）用于选择性扩增，EcoRⅠ 引物5’端用FAM进行标记。
MSAP选择性扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮。接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
5）毛细管电泳
选择性扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳确定上样量之后，使用“ABI 3730XL测序仪毛细管”进行毛细管电泳预实验；根据预实验结果调整最终的上样量进行毛细管电泳。
6）数据处理分析
采用Genemarker2.2.0软件将毛细管电泳得到的以上各类材料的峰图打开，按照AFLP的标准导出条带（01矩阵）；将所有单态性条带（各个样本中表现为一致）和软件认定为有疑问的（Suspected）条带去掉，注意只要在一个检测样本中有疑问就将整个条带删除。将删除精简后的01矩阵用Excel公式转换为四进制数据；通过四进制矩阵确定愈伤组织特异的MSAP位点（在瓶内和移栽的供体植株以及瓶内和移栽再生植株叶片中均表现为一种甲基化状态而愈伤组织中表现为另一种不同的状态）。本实施例中我们选取了三株种苗作为供体，共获得三个无性系的材料用于MSAP分析。通过实验，最终筛选出2个稳定可重复的愈伤组织特异性的MSAP位点，即2个黑果枸杞叶片再生相关的表位点。
7）条带回收、测序及生物信息学分析
筛选出的叶片再生相关条带（MSAP位点）可以回收、PCR、连接载体并测定其碱基序列，通过生物信息学等方法对测得的序列进行分析和进一步的深入研究。
表1.用于MSAP分析的选择性扩增引物
实施例2一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法
1.获得无菌种苗
将黑果枸杞成熟种子置于37 ℃温水中处理24小时；在无菌超净工作台中用70-75%酒精浸泡种子30 S-1 min，迅速将种子置于0.1%的氯化汞水溶液中浸泡5 min；无菌水冲洗5遍后，将种子表面的水吸干并横向平接在不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min），注意种子和培养基一定要紧密接触；将接种的材料置于25 ℃、“光照12 h/黑暗12h”光周期条件下培养，光照为3000 lx。
2.接种叶片外植体获得愈伤组织和再生植株
待上步接种的种子萌发并长出4片以上真叶时，于超净工作台将叶片横向剪为5 mm的小块，接种到添加6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1的MS固体培养基（蔗糖3.5%；琼脂0.45%；pH5.6；121℃高压灭菌16 min）；将接好的材料置于7 lx散射光下培养，培养温度为25 ℃；此条件下叶片外植体迅速脱分化产生黄色愈伤组织；待愈伤组织的表面出现结节样结构时，将其置于“光照12 h/黑暗12h”的光周期条件下培养，光照3000 lx；此条件下愈伤迅速产生不定芽；待不定芽长至2 cm高时，将其剪下插入不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（成分设置同步骤1）诱导生根。
3.供体植株及叶再生植株移栽驯化
将接有生根完整植株和供体植株的组培玻璃瓶置于自然光下驯化，待叶色浓绿健壮之时进行开瓶移栽；移栽采用环境条件逐级过渡的方式，保鲜膜覆盖保湿和浇灌多菌灵是必要的；完全揭去保鲜膜后，即便盆土保持100%田间持水量，材料地上部分也通常会萎蔫；经过2-7天之后材料又恢复正常。
4.提取基因组总DNA
选取没有玻璃化的非结节样愈伤组织、组培瓶内的供体植株和再生植株的发育完全的健康叶片、移栽后成活的供体植株和再生植株的新发枝条的发育完全的健康叶片用于提取基因组总DNA；至少选取三株供体植株的无性系作为实验材料，同一株系的愈伤组织和再生植株均要设置重复；同一株系的瓶内取材植株和移栽后取材植株要一致；即瓶内取完叶片之后驯化移栽，移栽成活后从新发枝条上再次取叶片作为供试材料；采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取DNA；洗脱DNA采用121℃灭菌20 min的1%的TE缓冲液；采用1%琼脂糖凝胶电泳和微量核算蛋白测定仪测量提取DNA的纯度和浓度。
5.MSAP比较分析
MSAP大概步骤如下：
1）接头制作
本实验用到接头序列如下，
EcoRⅠ-adapterⅠ 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
EcoRⅠ-adapterⅡ 5’-AATTGGTACGCAGTC-3’
H/M-adapterⅠ 5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’
H/M-adapterⅡ 5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’
单链接头复性为双链接头的方法：先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，缓慢冷却至室温，-20 ℃冷冻保存备用。
2）DNA酶切与连接
①反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μ
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
②反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
将混匀体系，在37 ℃进行DNA酶切6 h后，每个反应体系中加入T4 ligase 0.1 μL，混匀后于8 ℃进行接头连接4 h。
3）预扩增
将酶切连接产物稀释20倍用于预扩增。
①预扩增引物为：
EcoRI+A： 5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’
H/M+0: 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’
②MSAP预扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（稀释后酶切连接产物） 2 μl
Total volume 25 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100bp-1000bp范围内DNA呈弥散状分布为最佳酶切连接结果；根据DNA弥散的亮度，用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍，作为PCR选择性扩增的DNA模板。
4）选择性扩增
采用表1的引物组合B4用于选择性扩增，EcoRⅠ 引物5’端用TAMARA进行标记。
MSAP选择性扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮；接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
5）毛细管电泳
选择性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定上样量之后，使用“ABI 3730XL测序仪毛细管”进行毛细管电泳预实验；根据预实验结果调整最终的上样量进行毛细管电泳。
6）数据处理分析
采用Genemarker2.2.0软件将毛细管电泳得到的以上各类材料的峰图打开，按照AFLP的标准导出条带（01矩阵）；将所有单态性条带（各个样本中表现为一致）和软件认定为有疑问的（Suspected）条带去掉，注意只要在一个检测样本中有疑问就将整个条带删除；将删除精简后的01矩阵用Excel公式转换为四进制数据；通过四进制矩阵确定愈伤组织特异的MSAP位点（在瓶内和移栽的供体植株以及瓶内和移栽再生植株叶片中均表现为一种甲基化状态而愈伤组织中表现为另一种不同的状态）；本实施例中我们选取了三株种苗作为供体，共获得三个无性系的材料用于MSAP分析；通过实验，最终筛选出1个稳定可重复的愈伤组织特异性的MSAP位点，即1个黑果枸杞叶片再生相关的表位点。
7）条带回收、测序及生物信息学分析
筛选出的叶片再生相关条带（MSAP位点）可以回收、PCR、连接载体并测定其碱基序列，通过生物信息学等方法对测得的序列进行分析和进一步的深入研究。
实施例3一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法
1.种植无菌种子获得无菌种苗
将黑果枸杞成熟种子置于37 ℃温水中处理24小时；在无菌超净工作台中用70-75%酒精浸泡种子30 S-1 min，迅速将种子置于0.2%的氯化汞水溶液中浸泡2 min；无菌水冲洗4遍后，将种子表面的水吸干并横向平接在不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（添加0.45%的琼脂和2%的蔗糖，pH值用1M的KOH调为5.8, 121℃高压灭菌16 min），注意种子和培养基一定要紧密接触；将接种的材料置于25 ℃、“光照12 h/黑暗12h”光周期条件下培养，光照为3000 lx。
2.接种叶片外植体获得愈伤组织和再生植株
待上步接种的种子萌发并长出4片以上真叶时，于超净工作台将叶片横向剪为4 mm的小块，接种到添加6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1的MS固体培养基（蔗糖3.5%；琼脂0.45%；pH5.6；121℃高压灭菌16 min）；将接好的材料置于7 lx散射光下培养，培养温度为25 ℃；此条件下叶片外植体迅速脱分化产生黄色愈伤组织；待愈伤组织的表面出现结节样结构时，将其置于“光照12 h/黑暗12h”的光周期条件下培养，光照3000 lx；此条件下愈伤迅速产生不定芽；待不定芽长至2 cm高时，将其剪下插入不含任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基（成分设置同步骤1）诱导生根。
3.供体植株及叶再生植株移栽驯化
将接有生根完整植株和供体植株的组培玻璃瓶置于自然光下驯化，待叶色浓绿健壮之时进行开瓶移栽；移栽采用环境条件逐级过渡的方式，保鲜膜覆盖保湿和浇灌多菌灵是必要的；完全揭去保鲜膜后，即便盆土保持100%田间持水量，材料地上部分也通常会萎蔫；经过2-7天之后材料又恢复正常。
4.提取基因组总DNA
选取没有玻璃化的非结节样愈伤组织、组培瓶内的供体植株和再生植株的发育完全的健康叶片、移栽后成活的供体植株和再生植株的新发枝条的发育完全的健康叶片用于提取基因组总DNA；至少选取三株供体植株的无性系作为实验材料，同一株系的愈伤组织和再生植株均要设置重复；同一株系的瓶内取材植株和移栽后取材植株要一致；即瓶内取完叶片之后驯化移栽，移栽成活后从新发枝条上再次取叶片作为供试材料；采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）提取DNA；洗脱DNA采用121℃灭菌20 min的1%的TE缓冲液；采用1%琼脂糖凝胶电泳和微量核算蛋白测定仪测量提取DNA的纯度和浓度。
5.MSAP比较分析
MSAP大概步骤如下：
1）接头制作
本实验用到接头序列如下，
EcoRⅠ-adapterⅠ 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
EcoRⅠ-adapterⅡ 5’-AATTGGTACGCAGTC-3’
H/M-adapterⅠ 5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’
H/M-adapterⅡ 5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’
单链接头复性为双链方法：先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合。后将混合接头煮沸5 min，缓慢冷却至室温，-20 ℃冷冻保存备用。
2）DNA酶切与连接
①反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μ
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
②反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
将混匀体系，在37℃进行DNA酶切6h后，每个反应体系中加入T4 ligase 0.1 μL，混匀后于8℃进行接头连接4h。
3）预扩增
将酶切连接产物稀释20倍用于预扩增。
①预扩增引物为：
EcoRI+A：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’
H/M+0: 5’-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3’
②MSAP预扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 2.5 μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（稀释后酶切连接产物） 2 μl
Total volume 25 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30 S，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在100bp-1000bp范围内DNA呈弥散状分布为最佳酶切连接结果；根据DNA弥散的亮度，用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍，作为PCR选择性扩增的DNA模板。
4）选择性扩增
采用表1的引物组合B4和H4用于选择性扩增，EcoRⅠ 引物5’端分别用TAMARA和FAM进行标记。
MSAP选择性扩增体系如下：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl
混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮；接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
5）毛细管电泳
选择性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定上样量之后，使用“ABI 3730XL测序仪毛细管”进行毛细管电泳预实验；根据预实验结果调整最终的上样量进行毛细管电泳。
6）数据处理分析
采用Genemarker2.2.0软件将毛细管电泳得到的以上各类材料的峰图打开，按照AFLP的标准导出条带（01矩阵）；将所有单态性条带（各个样本中表现为一致）和软件认定为有疑问的（Suspected）条带去掉，注意只要在一个检测样本中有疑问就将条带删除；将删除精简后的01矩阵用Excel公式转换为四进制数据；通过四进制矩阵确定愈伤组织特异的MSAP位点（在瓶内和移栽的供体植株以及瓶内和移栽再生植株叶片中均表现为一种甲基化状态而愈伤组织中表现为另一种不同的状态）；本实施例中我们选取了三株种苗作为供体，共获得三个无性系的材料用于MSAP分析；通过实验，最终筛选出3个稳定可重复的愈伤组织特异性的MSAP位点，即3个黑果枸杞叶片再生相关的表位点。
7）条带回收、测序及生物信息学分析
筛选出的叶片再生相关条带（MSAP位点）可以回收、PCR、连接载体并测定其碱基序列，通过生物信息学等方法对测得的序列进行分析和进一步的深入研究。
Claims (8)
1.一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，它包括以下步骤：
1）培养无菌种苗；
2）接种叶片外植体，获得愈伤组织和再生植株；
3）将供体植株及叶再生植株驯化移栽；
4）提取愈伤组织、移栽和未移栽供体植株叶片、移栽和未移栽再生植株叶片的DNA；
5）分别采用EcoRⅠ联合MspⅠ或者HpaⅡ对提取的各类DNA进行双酶切，并连接双链接头；
6）预PCR扩增反应；
7）选择性PCR扩增反应；
8）毛细管电泳；
9）统计分析，筛选出愈伤组织特异性的MSAP位点，即黑果枸杞叶片再生相关的MSAP位点；
10）特异性条带的回收、测序和分析。
2.根据权利要求1所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤5）中所述的双酶切，反应体系为：
反应体系1（EcoRⅠ与HpaⅡ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
HpaⅡ（10 U/μL） 0.3 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
反应体系2（EcoRⅠ与MspⅠ）：
BSA（10 mg/L） 1 μL
H/M adaptor（25 μM） 1 μL
EcoRⅠ adaptor（2.5 μM） 1 μL
EcoRⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
MspⅠ（20 U/μL） 0.15 μL
DNA 150 ng
加去离子水补足到总反应体积为 20 μL；
将混匀的体系，在37℃进行DNA酶切6h之后，每个反应体系添加T4 ligase0.1μL，混匀后在8℃下进行接头连接4h。
3. 根据权利要求2所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤5）中所述的双链接头，是先把两个单链的接头复性为双链结构，EcoRⅠ接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至5 μM后等量混合；H/M接头Ⅰ和Ⅱ分别用无菌ddH2O稀释至50 μM后等量混合；后将混合接头煮沸5 min，冷却后得到。
4.根据权利要求3所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤6）中预PCR扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 2.5μl
dNTPs （10 mM） 0.5 μl
EcoRⅠ adaptor+A（5 μM） 1 μl
H/M adaptor+0 （5 μM） 1 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl） 0.2 μl
PCR water 17.8 μl
DNA模板（酶切连接产物稀释20倍后） 2 μl
Total volume 25 μl；
反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，56 ℃复性30s，72 ℃延伸60 S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min；用0.1×TE buffer 稀释预扩增产物5-20倍。
5. 根据权利要求4所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤7）中选择性PCR扩增反应体系为：
10×PCR reaction buffer 1.5 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.15 μl
EcoRⅠ primer（5 μM） 0.6 μl
H/M primer（5 μM） 0.6 μl
Taq DNA polymerase（5 U/μl) 0.2 μl
PCR water 9.95 μl
DNA模板（预扩增稀释产物） 2 μl
Total volume 15 μl；
混匀体系，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 S，65 ℃复性30 S，72 ℃延伸80S，以后每轮循环温度递减1 ℃，扩增10轮。
6.接着95℃变性30S，56 ℃复性30S，72 ℃延伸80S，共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
7.根据权利要求5所述的一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤7）所述的选择性PCR扩增，引物对如下：
EcoRⅠ引物5’端分别用F6-羧基荧光素（FAM）、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺（HEX）或TAMARA等进行标记。
8. 一种筛选黑果枸杞离体再生相关MSAP位点的方法，其特征在于：步骤8）所述的毛细管电泳；为选择性扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定上样量之后，使用“ABI 3730XL测序仪毛细管”进行毛细管电泳预实验；根据预实验结果调整最终的上样量进行毛细管电泳。
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- 2018-03-30 CN CN201810289868.6A patent/CN108588192A/zh not_active Withdrawn
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