CN113151553B

CN113151553B - 与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记及应用

Info

Publication number: CN113151553B
Application number: CN202110446340.7A
Authority: CN
Inventors: 杨路明; 刘文革; 豆峻岭; 杨会会; 杨森; 朱华玉
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN113151553A

Abstract

本发明公开了两对与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记及应用，属于生物技术领域。本发明的分子标记可以直接用于西瓜少侧枝材料的分子标记辅助育种，提高育种的选择效率，加快育种进程，在西瓜少侧枝理想株型新品种的选育中具有很好的应用价值。另外，利用该分子标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜植株是否为少侧枝性状，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

Description

与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，具体涉及与西瓜植株少侧枝基因Clbl 共分离的分子标记及应用。

背景技术

选择是育种中最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型来进行后续的培育。然而在传统的育种过程中，选择的依据往往是通过植株的表现型来判定，这种选择往往耗时较长且可能与基因型有偏差，造成选择不够准确并且效率低下。而利用分子标记辅助育种可以快速检测到目标基因或与目标性状紧密连锁的位点，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。

dCAPS(衍生型酶切扩增多态性序列)标记是在CAPS(酶切扩增多态性序列)标记的基础上改进而来的。其基本原理为：在设计提议性的扩增引物时引入错配的碱基，使其可以产生新的限制性内切酶作用位点，之后用该引物进行PCR扩增，将获得的扩增产物用特定的限制性内切酶进行酶切，最后采用凝胶电泳进行酶切片段检测，根据是否切开来判断样品间的多态性。 dCAPS标记是共显性标记，可区分杂合和纯合的基因型，可以直接用琼脂糖电泳分析，操作简便快捷。dCAPS标记相对于CAPS标记不需要考虑SNP是否在限制性内切酶位点上，可以最大限度的将SNP转化成标记，使基因组上的 SNP的利用率更高。

作为一种重要的葫芦科作物，西瓜是人们夏季消暑解渴的重要水果，其在世界园艺作物中占有非常重要的地位。而中国作为世界上西瓜生产和消费第一大国，栽培面积及产量巨大，其在农业产业化调整中占有重要的地位。西瓜的坐果方式为主蔓结瓜，生产上中常采用双蔓或三蔓的方式进行整枝，然而西瓜作为一种藤蔓作物，几乎每个节间都会产生侧枝，这些多余的侧枝都需要人工摘除，因此栽培过程中的整枝打杈要花费大量的时间和劳动力。同时过多的侧枝占据了较多的空间，使西瓜栽培过程中必须保持足够的株距及行距，从而降低种植密度。因此，多侧枝特性已经成为当前制约西瓜产业化和规模化发展的一个瓶颈，培育少侧枝甚至无侧枝西瓜新品种，探索轻简化栽培新模式，必将有力的促进西瓜产业化和规模化发展。随着西瓜全基因组测序的完成，近年来关于西瓜的相关研究发展迅速，许多优异的性状已经进行了基因定位，开发出的一些连锁标记也已经开始用到分子标记辅助育种过程当中，而目前关于西瓜植株少侧枝的研究还未见报道。通过对西瓜植株少侧枝的研究，开发出和西瓜植株少侧枝性状共分离的分子标记，不仅可以为西瓜分子标记辅助选择培育少侧枝西瓜新品种提供有效的帮助，同时也可以大大缩短育种进程并提高选择的准确性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种与西瓜植株少侧枝基因Clb/共分离的分子标记。

本发明目的之二在于提供一种上述分子标记在西瓜分子育种的应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定少侧枝西瓜品种的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的两对分子标记，该分子标记为衍生型酶切扩增多态性标记(dCAPS标记)，控制西瓜植株少侧枝性状的基因命名为branchless(缩写为Clbl)，与西瓜植株少侧枝共分离的衍生型酶切扩增多态性分子标记是基于Clbl开发的，两对分子标记命名为dCAPS10和 dCAPS13，扩增所述的dCAPS10分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示；扩增所述的dCAPS13分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物序列如 SEQ.ID.NO.4所示。。

本发明还公开了与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记在西瓜分子育种的应用，该分子标记与西瓜植株少侧枝性状共分离，在分子水平上可以辅助鉴定西瓜植株是否为少侧枝的表型，并且在种子或者苗期即可判定西瓜植株性状，从而提高选择效率、加快育种进程。本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选少侧枝西瓜品种。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。

本发明还公开了一种鉴定少侧枝西瓜性状/品种的方法，采用PCR扩增后酶切的方法进行检测，所述方法包括如下步骤：

(1)提取西瓜组织的DNA；

(2)PCR扩增：利用权利要求1所述的引物对，对步骤(1)所提取样品进行PCR扩增；

(3)对步骤(2)中的扩增产物进行酶切处理，之后进行电泳检测；

(4)根据步骤(3)的电泳条带结果进行判定，具体标准为：

对于分子标记dCAPS10，如果酶切产物为长度204bp的特征条带，则待测植株为少侧枝的西瓜植株/品种；如果酶切扩增产物为223bp的特征条带，该待测植株为纯合正常侧枝植株/品种，如果酶切产物为两条长度分别为 223bp、204bp的特征条带，该待测植株为杂合正常侧枝植株/品种；对于分子标记dCAPS13，如果酶切产物为长度105bp的特征条带，则待测植株为少侧枝的西瓜植株/品种；如果酶切扩增产物为125bp的特征条带，该待测植株为纯合正常侧枝植株/品种，如果酶切产物为两条长度分别为125bp、105bp 的特征条带，该待测植株为杂合正常侧枝植株/品种。

具体地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL、2×PCR Mix 5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、灭菌蒸馏水3μL，总体积10μL。PCR 扩增条件为：95℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、50s，共35个循环；72℃、10min；4℃保存。

酶切反应体系为：PCR产物10μL，10buffer1.5μL，Bcll限制性内切酶 0.3μL，灭菌蒸馏水3.2μL，总体积15μL。酶切条件为55℃、4h。

另外，包含上述引物对(一对或者两对)的试剂盒，可以用来鉴定西瓜材料是否具有少侧枝性状，具体应用时，可以选择含有任何一对引物对做成试剂盒，更加优选地，选择两对引物对，检测更加准确。

再者，用于检测dCAPS标记是否存在的试剂在少侧枝基因Clbl定位中的应用，利用本发明的分子标记，可以对少侧枝基因Clbl进行定位，上述这些应用均可以按照常规的方法进行。

本发明还保护含有上述分子标记的载体。所述重组载体可以是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。获得上述重组载体后，本领域技术人员可以根据不同的需要，将重组载体转化到合适的细胞中，得到含有该重组载体的重组细胞。因此，本发明还保护含有所述重组载体的重组细胞。

本发明的优点：

本发明用于鉴定西瓜植株少侧枝的分子标记，可以应用于西瓜少侧枝理想株型分子标记辅助选择育种中。在西瓜选择育种过程中，往往要产生大量的分离群体，采用该分子标记，可以在苗期中鉴定出所需要的植株，不仅减少了育种过程中的占地面积，同时也减少植株长大后鉴定所需的人力物力，大大提高育种的效率、缩短选择年限。

利用该分子标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜植株是否为少侧枝性状，通过其在育种进程中的运用可以大大加快西瓜少侧枝理想株型选择育种的进程，具有检测方便、扩增产物稳定的优点。

附图说明

图1为利用JoinMap4.0软件对西瓜少侧枝性状所做的连锁图谱：

图中，A代表240株F2群体所做的连锁图谱，B代表1406株F2群体所做的连锁图谱，C代表精细定位的图谱，最终候选基因被定位到9011bp的区间内。

图2为分子标记dCAPS10在亲本和F2群体中的酶切电泳图；

图中，M为DL2000 Marker，图中显示的为250bp条带；P₁为正常侧枝西瓜自交系WT2的酶切电泳条带；P₂为少侧枝材料无杈早WM203的酶切电泳条带；F₂为部分F₂群体的酶切电泳条带，F₂中与P₁条带一致的为纯合正常侧枝植株，与P₂条带一致的为纯合少侧枝植株，既有P₁条带又有P₂条带的为杂合正常侧枝植株。

图3为分子标记dCAPS13在亲本和F₂群体中的酶切电泳图；

图中，M为DL2000 Marker，图中显示的为250bp和100bp条带；P₁为正常侧枝西瓜自交系WT2的酶切电泳条带；P₂为少侧枝材料无杈早WM203的酶切电泳条带；F₂为部分F₂群体的酶切电泳条带，F₂中与P₁条带一致的为纯合正常侧枝植株，与P₂条带一致的为纯合少侧枝植株，既有P₁条带又有P₂条带的为杂合正常侧枝植株。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1与西瓜植株少侧枝基因紧密连锁的分子标记的获得

材料说明

父本：西瓜少侧枝材料WM203(国家西瓜甜瓜中期库编号：ZXG00144)，该材料由中国农科院郑州果树研究所提供，经过长期的大田观察，该材料在植株生长过程中产生的侧枝较少；

母本：正常普通侧枝材料WT2，该材料在植株生长过程中侧枝分化正常，以上材料均可以通过商业的途径或者河南农业大学瓜类作物遗传育种课题组提供。

1、遗传分离群体的构建

以WM203作为父本，其特性表现为：植株下部的每个节间生长正常侧枝，到第六节间以上不再生长侧枝；以正常西瓜侧枝品种WT2为母本，杂交获得 F₁，F₁自交后获得F₂代种子，从F₂代中选出1406粒种子播种，鉴定每个F₂单株的表型，最终鉴定出正常侧枝植株1048株，少侧枝植株358株，卡方分析显示其符合3∶1的分离比例，说明西瓜植株少侧枝为单基因隐性遗传。

2、候选基因定位

(1)混池构建

从F₂代分离群体中挑选出正常侧枝和少侧枝西瓜植株各20株，分别采用CTAB法提取叶片的DNA，去除RNA，DNA样品体积不低于50μL。用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的0D值，计算DNA含量以及 0D260/280的比值。DNA样品纯度0D260/280值应在1.8-2.0，浓度稀释至 100ng/μL。之后分别将20株正常侧枝西瓜DNA和20株少侧枝西瓜DNA混合在一起，制备成正常侧枝池和少侧枝池。

(2)基因的初步定位和分子标记的开发

利用本实验室从西瓜全基因组开发的SSR标记引物对两个混池的DNA进行多态性筛选，共筛选出202对具有多态性的SSR标记，之后用这些具有多态性的标记对204株F2群体进行PCR扩增，之后再用1406株F2群体进行多态性分析，根据扩增出的带型进行基因型分析。利用SSR标记的分型结果，结合群体的表型数据，采用JoinMap4.0软件对西瓜少侧枝性状进行连锁图谱作图，最终获得了西瓜少侧枝的初定位区间。如图1所示。

(3)基因的精细定位

在初定位区间内没有更多的多态性SSR标记，所以在初定位区间内继续开发dCAPS标记和Indel标记，并且对所有1406株F2群体进行多态性分析，最终将候选基因定位到西瓜4号染色体。如图1所示。精细定位显示分子标记dCAPS10和dCAPS13与少侧枝基因Clbl表现为共分离。这两对标记均可以被限制性内切酶Bcll(酶切位点T/GATCA)切割，分子标记dCAPS10的引物对为：

上游引物：CTTGCAGCAGTTTCTCTTTGA(如SEQ.ID.NO.1所示)；

下游引物：TGGGTGATGAGACAGGAAAAG(如SEQ.ID.NO.2所示)；

利用该引物对待测西瓜样本(亲本和F₂群体)进行PCR扩增，结果发现，少侧枝西瓜样品的酶切产物有204bp条带，经测序其序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，而正常侧枝品种分为两种情况，当该样品为纯合正常侧枝品种，酶切扩增产物有223bp的特征条带，经测序其序列如序列表中SEQ ID NO.5 所示，当该样品为杂合正常侧枝品种时，其酶切产物为两条长度分别为 223bp、204bp的特征条带(如图2)。

分子标记dCAPS13的引物对为：

上游引物：GTAAACATCTCGAATTTGTTGATC(如SEQ.ID.NO.3所示)；

下游引物：TTCTCGATGAAAACCCATGAC(如SEQ.ID.N0.4所示)；

利用该引物对待测西瓜样本(亲本和F₂群体)进行PCR扩增，结果发现，少侧枝西瓜样品的酶切产物有105bp条带，经测序其序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，而正常侧枝品种分为两种情况，当该样品为纯合正常侧枝品种，酶切扩增产物有125bp的特征条带，经测序其序列如序列表中SEQ ID NO.7 所示，当该样品为杂合正常侧枝品种时，其酶切产物为两条长度分别为 125bp、105bp的特征条带(如图3)。

实施例2利用上述分子标记鉴定西瓜是否为少侧枝品种

1、提取西瓜组织的DNA

采用常规CTAB法提取西瓜样品组织的DNA，去除RNA，DNA样品体积不低于50μL。用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量以及OD260/280的比值。DNA样品纯度OD260/280值应在 1.8-2.0，浓度稀释至100ng/μL。

2、引物选择

dCAPS10采用如下引物序列：

上游引物：CTTGCAGCAGTTTCTCTTTGA(如SEQ.ID.NO.1所示)；

下游引物：TGGGTGATGAGACAGGAAAAG(如SEQ.ID.NO.2所示)；

dCAPS13采用如下引物序列：

上游引物：GTAAACATCTCGAATTTGTTGATC(如SEQ.ID.NO.3所示)；

下游引物：TTCTCGATGAAAACCCATGAC(如SEQ.ID.NO.4所示)；

引物由生物技术公司合成后，稀释至10μM后备用。

3、PCR反应体系

按照标准流程进行PCR反应程序，PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR扩增程序为：95℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、50s，共 35个循环；72℃、10min；4℃保存。

4、酶切

酶切反应体系如表2所示：

表2酶切反应体系

样品混匀后，在为55℃酶切4h。

5、琼脂糖凝胶电泳检测

配制1％的琼脂糖凝胶电泳进行条带分别对F2代群体以及其他西瓜品种进行检测，可以快速的鉴定西瓜品种是否属于少侧枝，具体地：

对于分子标记dCAPS10，若酶切产物长度为204bp(序列如SEQ.ID.NO.6 所示)的特征条带，则待测品种为少侧枝的西瓜品种；如果酶切扩增产物为 223bp(序列如SEQ.ID.NO.5所示)的特征条带，该品种为纯合正常侧枝品种，如果酶切产物为两条长度分别为223bp、204bp的特征条带，该品种为杂合正常侧枝品种。对于分子标记dCAPS13，若酶切产物长度为105bp(序列如SEQ.ID.NO.8所示)的特征条带，则待测品种为少侧枝的西瓜品种；如果酶切扩增产物为125bp(序列如SEQ.ID.NO.7所示)的特征条带，该品种为纯合正常侧枝品种，如果酶切产物为两条长度分别为125bp、105bp的特征条带，该品种为杂合正常侧枝品种。通过对扩增的特征条带进行分析，就可以判断出西瓜是否属于少侧枝品种。

综上所述，本发明的衍生型酶切扩增序列多态性标记能够对西瓜植株少侧枝性状进行大规模鉴定，不仅快速有效，而且在苗期就可以进行过鉴定，大大缩短了育种的周期，可以在生产中大规模应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记及应用

<130> 2021

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

cttgcagcag tttctctttg a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 2

tgggtgatga gacaggaaaa g 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 3

gtaaacatct cgaatttgtt gatc 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 4

ttctcgatga aaacccatga c 21

<210> 5

<211> 223

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 5

cttgcagcag tttctctttg agcattgaaa tagacagcag caacaggaag acccaaatca 60

ttctcacccg aaaatcttcg agtgttgaaa cgatcccttg atgaaggagg gttcactgaa 120

cgacgccgtt tttgtttgaa cagaacaaac acaaacctgt gaattcctat tgttggcttt 180

ggaatttcat agctcatttc ttcttttcct gtctcatcac cca 223

<210> 6

<211> 204

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 6

gagcattgaa atagacagca gcaacaggaa gacccaaatc attctcaccc gaaaatcttc 60

gagtgttgaa acgatccctt gatgaaggag ggttcactga acgacgccgt ttttgtttga 120

acagaacaaa cacaaacctg tgaattccta ttgttggctt tggaatttca tagctcattt 180

cttcttttcc tgtctcatca ccca 204

<210> 7

<211> 125

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 7

gtaaacatct cgaatttgtt gatagaaatt ccttttttaa caaattcttt tctttttcct 60

aaacctaaat aaatttaaca ctagataaac aaattattgt tttggtcatg ggttttcatc 120

gagaa 125

<210> 8

<211> 105

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 8

gatagaaatt ccttttttaa caaattcttt tctttttcct aaacctaaat aaatttaaca 60

ctagataaac aaattattgt tttggtcatg ggttttcatc gagaa 105

Claims

1.与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记命名为dCAPS10和/或dCAPS13，扩增dCAPS10分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示；扩增dCAPS13分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记为dCAPS标记。

3.权利要求1所述与西瓜植株少侧枝基因Clbl共分离的分子标记在鉴定或辅助鉴定西瓜植株少侧枝性状中的应用。

4.一种鉴定西瓜少侧枝品种的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1) 提取西瓜植株组织的DNA；

(2) PCR扩增：利用权利要求1所述的引物对，对步骤（1）所提取样品进行PCR扩增；

(3) 对步骤（2）中的扩增产物进行酶切处理，之后进行电泳检测；

(4) 根据步骤（3）的电泳条带结果进行判定，具体标准为：

对于分子标记dCAPS10，如果酶切产物为长度204bp的特征条带，则待测植株为少侧枝的西瓜品种,如果酶切扩增产物为223bp的特征条带，该待测植株为纯合正常侧枝品种，如果酶切产物为两条长度分别为223bp、204bp的特征条带，该待测植株为杂合正常侧枝品种；对于分子标记dCAPS13，如果酶切产物为长度105bp的特征条带，则待测植株为少侧枝的西瓜品种,如果酶切扩增产物为125bp的特征条带，该待测植株为纯合正常侧枝品种，如果酶切产物为两条长度分别为125bp、105bp的特征条带，该待测植株为杂合正常侧枝品种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，用CTAB法提取供试材料的DNA。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL、2×PCR Mix 5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、灭菌蒸馏水3μL，总体积10μL；PCR扩增条件为：95℃、5min；94℃、30s, 57℃、30s, 72℃、50s, 共35个循环；72℃、10min；4℃保存。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的酶切反应体系为： PCR产物10μL，10 X buffer1.5μL，BclI限制性内切酶0.3μL，灭菌蒸馏水3.2μL，总体积15μL，酶切条件为55℃、4h。

8.一种用于鉴定西瓜少侧枝性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的一对或者两对引物对。

9.用于检测dCAPS标记是否存在的试剂在少侧枝基因Clbl定位中的应用，其特征在于，扩增dCAPS10标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.2所示；扩增dCAPS13标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.3所示，下游引物序列如SEQ.ID.NO.4所示。