CN111635958B - 与水稻耐冷基因qSF12相连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

与水稻耐冷基因qSF12相连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与水稻耐冷基因qSF12相连锁的分子标记及其在水稻耐冷性鉴定中的应用。本发明利用吉冷1号/密阳23重组自交系群体(RIL)，在水稻第12号染色体上成功定位到与水稻孕穗期耐冷性相关的基因位点qSF12，其耐冷有利等位基因来自耐冷亲本吉冷1号，与分子标记STS12b连锁，并基于分子标记STS12b提供了鉴定或辅助鉴定水稻孕穗期耐冷性的方法，可用于孕穗期耐冷水稻品种的鉴定及分子育种。

Description

与水稻耐冷基因qSF12相连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术工程，具体涉及与水稻耐冷基因qSF12相连锁的分子标记及其应用。
背景技术
水稻是起源于热带、亚热带地区的冷敏感作物，低温冷害导致水稻减产是世界范围内普遍存在的问题。在我国，低温冷害是东北高纬度稻作区和云贵高海拔稻作区频发的自然灾害之一，我国每年因低温冷害导致水稻减产30亿kg～50亿kg，平均每3～4年就会遭遇一次较大规模的低温冷害，严重影响水稻生产，危及粮食安全。低温冷害在水稻各个生育时期均有发生，其中孕穗期是对低温最敏感的时期，孕穗期遭遇低温，会引起花粉败育，结实率降低，严重时颗粒无收。因此，孕穗期冷害所造成的产量损失通常最为严重。随着人们对稻米需求的日益增长，在高纬度、高海拔地区种植水稻日渐增多，而孕穗期低温冷害是其稻作生产中的主要限制因子之一，因此，筛选和培育出耐冷、高产的水稻新品种是克服水稻低温冷害最有效的途径，对高纬度、高海拔稻区水稻的育种与生产发展具有重要意义。
传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于耐冷性是复杂的数量性状，耐冷反应涉及多个基因，且基因与环境间存在明显的互作效应，耐冷基因聚合更为困难。随着分子生物学的发展，利用耐冷基因及与其紧密连锁的分子标记，开展分子标记辅助选择育种可以有效地解决这一问题。该技术可在早世代进行准确、稳定的选择，从而加速育种进程，提高育种效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何快速、准确的鉴定水稻耐冷性。为了解决该技术问题，本发明利用吉冷1号/密阳23重组自交系群体(RIL)，在水稻第12号染色体上成功定位到与水稻耐冷性相关的基因位点qSF12，其耐冷有利等位基因来自耐冷亲本吉冷1号，与分子标记STS12b连锁。本发明的基于PCR的实用经济型分子标记STS12b可用于耐冷水稻品种的鉴定及分子育种。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定水稻耐冷性的引物对。
本发明提供的引物对由引物甲和引物乙组成；
所述引物甲为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物乙为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
上述引物对中，所述引物甲和所述引物乙的摩尔比为1:1。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述引物对的新用途。
本发明提供了上述引物对在鉴定或辅助鉴定水稻耐冷性中的应用。
本发明还提供了上述引物对在制备鉴定或辅助鉴定水稻耐冷性的产品中的应用。
本发明还提供了上述引物对在选育耐冷性强的水稻品种中的应用。
本发明还提供了上述引物对在制备选育耐冷性强的水稻品种的产品中的应用。
本发明还提供了上述引物对在水稻育种中的应用。
本发明还提供了上述引物对在制备水稻育种的产品中的应用。
所述育种的目的为培育耐冷水稻品种。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定水稻耐冷性的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定水稻耐冷性的方法包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物大小鉴定待测水稻的耐冷性：
若PCR产物大小为163bp，则待测水稻为或候选为耐冷性强的水稻品种；
若PCR产物大小为187bp，则待测水稻为或候选为耐冷性中的水稻品种或耐冷性弱的水稻品种。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种选育耐冷性强的水稻品种的方法。
本发明提供的选育耐冷性强的水稻品种的方法包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；选择PCR产物大小为163bp的待测水稻进行育种。
上述方法中，所述PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)1.0μl、10mM dNTPMixture 0.25μl、10pM/μl引物甲0.25μl、10pM/μl引物乙0.25μl、0.5U/μl Taq polymerase0.25μl、40ng/μl基因组DNA 1.0μl，ddH2O补足至10μl；
所述PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，36个循环；72℃延伸10min。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种产品。
本发明提供的产品为如下(b1)-(b3)任一所述的产品：
(b1)上述引物对；
(b2)含有(b1)所述的引物对的PCR试剂；
(b3)含有(b1)所述的引物对或(b2)所述的PCR试剂的试剂盒。
上述产品中，所述PCR试剂还包括10×PCR buffer(含Mg2+)、dNTP Mixture和Taqpolymerase。
上述产品在如下(c1)-(c3)任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
(c1)鉴定或辅助鉴定水稻耐冷性；
(c2)选育耐冷性强的水稻品种；
(c3)水稻育种。
上述任一应用或方法或产品中，所述耐冷性强的水稻品种为耐冷级别小于5的水稻品种；所述耐冷性中的水稻品种为耐冷级别等于5的水稻品种；所述耐冷性弱的水稻品种为耐冷级别大于5的水稻品种。水稻耐冷级别的判定标准如下：若水稻品种的结实率大于等于80％，则该水稻的耐冷级别为1；若水稻品种的结实率大于等于60％且小于80％，则该水稻的耐冷级别为3；若水稻品种的结实率大于等于40％且小于60％，则该水稻的耐冷级别为5；若水稻品种的结实率大于等于10％且小于40％，则该水稻的耐冷级别为7；若水稻品种的结实率大于等于0％且小于10％，则该水稻的耐冷级别为9。
上述任一应用或方法或产品中，所述耐冷性为孕穗期耐冷性。
本发明与现有技术相比具有以下优点及效果：1、本发明获得的水稻孕穗期耐冷基因在不同的遗传背景下能够稳定表达，可靠性强。2、通过与孕穗期耐冷基因紧密连锁的分子标记的筛选，能够鉴定获得孕穗期耐冷性强的水稻品种。3、本发明的分子标记可用于水稻苗期基因型的鉴定和选择，获得携带孕穗期耐冷优异等位变异的个体，可克服常规育种方法所需时间周期长、表型鉴定困难等缺点，培育出强耐冷性水稻新品种。
本发明以吉冷1号/密阳23重组自交系为研究群体，挖掘稳定表达的孕穗期耐冷基因位点及与其紧密连锁的分子标记，最终在水稻基因组第12号染色体17.97cM的位置上发现一个与孕穗期耐冷相关的基因位点qSF12以及与之紧密连锁的分子标记STS12b，为水稻分子标记辅助选择育种提供理论基础。
附图说明
图1为吉冷1号/密阳23群体亲本和后代部分单株在STS12b位点的电泳谱带图。P1和P2分别表示吉冷1号和密阳23；1-30表示从群体中随机选择的30个单株。
图2为分子标记STS12b鉴定水稻品种孕穗期耐冷性的电泳谱带图。P1和P2分别表示吉冷1号和密阳23；1-15表示进行耐冷性鉴定的15个水稻品种。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的吉冷1号和密阳23均记载于文献“韩龙植,乔永利,张媛媛,曹桂兰,芮钟斗,高熙宗.水稻孕穗期耐冷性QTLs分析.作物学报,2005,31(5):653-657.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的黑谷、意大利糯、花膀谷、祖鲁谷、白鹤簸蒗谷、曼皮香红糯米、麦车、白鹤小麻谷、台北8号、大黄糯、背籽糯、云川白、吊谷、俄过和鲁祖白谷均记载于文献“Cui D,Li JM,Tang CF,A XX,Yu TQ,Ma XD,Zhang EL,Cao GL,Xu FR,Qiao YL,Dai LY,Han LZ.Diachronic analysis of genetic diversity in rice landraces under on-farm conservation in Yunnan,China.Theoretical and Applied Genetics,2016,129:155-168.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、水稻孕穗期耐冷基因qSF12及与其紧密连锁的分子标记STS12b的获得一、水稻孕穗期耐冷QTL的定位及孕穗期耐冷基因qSF12的获得
1、供试材料
将来自吉林省农业科学院水稻研究所的强耐冷性粳稻品种吉冷1号与来自韩国农村振兴厅作物科学院的冷敏感籼稻品种密阳23杂交，经单粒传法获得包含253个株系的F10重组自交系群体(RIL)，并将该群体作为定位群体。
2、基因型鉴定
在北京昌平试验基地种植供试材料，剪取水稻幼嫩叶片，按照Doyle和Dickson(1987)并略有改进的十六烷基三乙基溴化铵法(CTAB)进行全基因组的DNA提取。筛选出扩增效果好、亲本间具有多态性且均匀分布于12个连锁群的295个分子标记用于定位群体的基因型鉴定。
PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)1.0μl、10mM dNTP Mixture 0.25μl、10pM/μl引物0.25μl、0.5U/μl Taq polymerase 0.25μl、40ng/μl基因组DNA 1.0μl，ddH2O补足至10μl。
PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，36个循环；72℃延伸10min。
扩增产物用8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离，采用260V恒压电泳，检测各分子标记的扩增带型，将RIL群体单株的扩增带型与吉冷1号、密阳23的扩增带型进行比较。其中带型与亲本吉冷1号相同的记为A，与亲本密阳23相同的记为B，缺失记为“-”。
3、孕穗期耐冷性鉴定
试验于2016和2017年在位于昆明市嵩明县的云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所试验基地进行。试验材料的孕穗期处于6月初至8月末，而嵩明每年6月至8月份的温度较低，一般最低温度变异在15～19℃，具备了鉴定孕穗期耐冷性的良好自然低温环境。2017年4月24日播种，6月9日移栽，2次重复，顺序排列，1行区，每行20穴，单本插秧，插秧规格为25cm×15cm。N、P2O5施用量分别为120kg/hm2、80kg/hm2。在抽穗期调查记载每个品种的抽穗日期，并计算从播种至抽穗所需的抽穗天数。成熟期调查记载秆长(茎基部至穗颈节之间距离)、穗长、穗颈长(也称穗抽出度，指剑叶节至穗颈节之间的距离，距离为负值时指穗颈全部被包在剑叶鞘之中)、有效穗数、穗粒数，并计算结实率(在每穗平均总颖花数中，平均实粒数所占的比例，以％表示)。每个材料调查10株，以10株平均值作为统计单元。以自然低温下的结实率作为孕穗期耐冷性评价指标(表1)。
表1、耐冷鉴定标准
耐冷级别 结实率(X) 耐冷性
1 X≥80％ 极强
3 80％＞X≥60％ 强
5 60％＞X≥40％ 中
7 40％＞X≥10％ 弱
9 10％＞X≥0％ 极弱
4、连锁图谱的构建及QTL定位
利用IciMapping 4.0软件进行重组自交系群体遗传连锁图谱的构建，标记间的遗传距离采用Kosambi函数进行估算(Kosambi et al，1944)。QTL检测选用IciMapping 4.0软件，以LOD值2.5作为QTL检测的阈值。
吉冷1号/密阳23重组自交系群体定位到位于第12号染色体17.97cM的位置上与孕穗期耐冷性相关的稳定表达的基因位点qSF12(表2)，该位点与分子标记STS12b连锁。SF吉冷1号表示与亲本吉冷1号基因型一致的纯合植株的平均结实率；SF密阳23表示与亲本密阳23基因型一致的纯合植株的平均结实率，qSF12能够有效地提高水稻孕穗期自然低温下的结实率，且耐冷有利等位基因来源于强耐冷性品种吉冷1号，分子标记STS12b与qSF12紧密连锁，可应用于水稻耐冷分子标记辅助选择育种。
表2、耐冷QTL qSF12的定位
QTL 连锁标记 遗传距离 LOD值 群体 SF<sub>吉冷1号</sub> SF<sub>密阳23</sub>
qSF12 STS12b 17.97cM 3.40 吉冷1号/密阳23 60.30％ 23.64％
二、与水稻孕穗期耐冷基因qSF12紧密连锁的分子标记STS12b
本发明的与水稻孕穗期耐冷基因qSF12紧密连锁的分子标记是位于水稻第12号染色体上的STS12b分子标记，其核苷酸序列(5′→3′)如下：
正向引物：TGGGGGAGTTCTGAAATCTG(序列1)；
反向引物：TTAAGTTCGGTGCCCCATAA(序列2)。
实施例2、水稻孕穗期耐冷性的鉴定方法
本发明提供的鉴定待测水稻孕穗期耐冷性的方法具体如下：
1、提取待测水稻的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用STS12b分子标记进行PCR扩增，得到PCR产物；
PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)1.0μl、10mM dNTP Mixture 0.25μl、10pM/μl引物0.25μl、0.5U/μl Taq polymerase 0.25μl、40ng/μl基因组DNA 1.0μl，ddH2O补足至10μl。
PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，36个循环；72℃延伸10min。
2、根据PCR产物大小鉴定待测水稻的孕穗期耐冷性：
若PCR产物大小为163bp，则待测水稻为或候选为耐冷性强的水稻品种；
若PCR产物大小为187bp，则待测水稻为或候选为耐冷性中的水稻品种或耐冷性弱的水稻品种；
耐冷性强的水稻品种为耐冷级别小于5的水稻品种；
耐冷性中的水稻品种为耐冷级别等于5的水稻品种；
耐冷性弱的水稻品种为耐冷级别大于5的水稻品种。
实施例3、STS12b分子标记在水稻品种孕穗期耐冷性鉴定中的应用
一、供试材料
供试材料为黑谷、意大利糯、花膀谷、祖鲁谷、白鹤簸蒗谷、曼皮香红糯米、麦车、白鹤小麻谷、台北8号、大黄糯、背籽糯、云川白、吊谷、俄过和鲁祖白谷。
二、孕穗期耐冷性鉴定
按照实施例1步骤一的3中的方法对步骤一中的供试材料的孕穗期耐冷性进行鉴定。
结果如表3所示。从表中可以看出：15个水稻品种中，意大利糯、曼皮香红糯米和吊谷的耐冷级别均为7，均为耐冷性弱的水稻品种；祖鲁谷、麦车、云川白和鲁祖白谷的耐冷级别均为5，均为耐冷性中的水稻品种；其余8个水稻品种黑谷、花膀谷、白鹤簸蒗谷、白鹤小麻谷、台北8号、大黄糯、背籽糯和俄过的耐冷级别均小于5，均为耐冷性强的水稻品种。
表3、供试水稻品种的基因型和孕穗期耐冷性鉴定结果
水稻品种 PCR产物大小 耐冷级别 耐冷性
1 黑谷 163bp 3 强
2 意大利糯 187bp 7 弱
3 花膀谷 163bp 1 极强
4 祖鲁谷 187bp 5 中
5 白鹤簸蒗谷 163bp 3 强
6 曼皮香红糯米 187bp 7 弱
7 麦车 187bp 5 中
8 白鹤小麻谷 163bp 1 极强
9 台北8号 163bp 3 强
10 大黄糯 163bp 3 强
11 背籽糯 163bp 3 强
12 云川白 187bp 5 中
13 吊谷 187bp 7 弱
14 俄过 163bp 3 强
15 鲁祖白谷 187bp 5 中
三、基因型鉴定
提取步骤一中的供试材料的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，利用STS12b分子标记进行PCR扩增。PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2的步骤1。扩增产物用8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离，采用260V恒压电泳。
电泳结果如图2所示。意大利糯、曼皮香红糯米和吊谷(泳道2、泳道6和泳道13)均扩增得到大小为187bp的DNA条带，按照实施例2中水稻孕穗期耐冷性的鉴定方法进行鉴定，意大利糯、曼皮香红糯米和吊谷均为耐冷性弱的水稻品种；祖鲁谷、麦车、云川白和鲁祖白谷(泳道4、泳道7、泳道12和泳道15)均扩增得到大小为187bp的DNA条带，按照实施例2中水稻孕穗期耐冷性的鉴定方法进行鉴定，祖鲁谷、麦车、云川白和鲁祖白谷均为耐冷性中的水稻品种；其余8个水稻品种黑谷、花膀谷、白鹤簸蒗谷、白鹤小麻谷、台北8号、大黄糯、背籽糯和俄过(泳道1、泳道3、泳道5、泳道8、泳道9、泳道10、泳道11和泳道14)均扩增得到大小为163bp的DNA条带，按照实施例2中水稻孕穗期耐冷性的鉴定方法进行鉴定，均为耐冷性强的水稻品种。
由此可以看出：本发明的水稻孕穗期耐冷性的鉴定方法与步骤二中的耐冷性鉴定结果完全一致。说明本发明的水稻孕穗期耐冷性的鉴定方法准确、可靠。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120>与水稻耐冷基因qSF12相连锁的分子标记及其应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
tgggggagtt ctgaaatctg 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
ttaagttcgg tgccccataa 20

Claims (2)

1.一种鉴定或辅助鉴定水稻耐冷性的方法，包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物大小鉴定待测水稻的耐冷性：
若PCR产物大小为163 bp，则待测水稻为或候选为耐冷性强的水稻品种；
若PCR产物大小为187 bp，则待测水稻为或候选为耐冷性中的水稻品种或耐冷性弱的水稻品种；
所述耐冷性为孕穗期耐冷性。
2.一种选育耐冷性强的水稻品种的方法，包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
选择PCR产物大小为163 bp的待测水稻进行育种；
所述耐冷性为孕穗期耐冷性。
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