CN113881799B - 用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的功能分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的功能分子标记及其应用，其中每个功能分子标记包含正反两个引物。所述功能分子标记所用成对引物选自组A或B，其中组A为选自以下引物对中的任意两个：第一引物对由SEQ ID NO:1和NO:2组成，第二引物对由SEQ ID NO:3和NO:4组成，第三引物对由SEQ ID NO:5和NO:6组成，第四引物对由SEQ ID NO:7和NO:8组成；另有组B为选自以下引物对中的任意两个：第五引物对由SEQ ID NO:9和NO:10组成，第六引物对由SEQ ID NO:11和NO:12组成；第七引物对由SEQ ID NO:13和NO:14组成。该功能分子标记在烟草辅助育种中具备便捷、高效且呈二元性的特点。遗传效应分析表明，分子标记辅助选择导入RBRR1位点能够极显著提高栽培烟草根黑腐抗性。
Description
技术领域
本发明涉及技术领域，特别是一种用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的功能分子标记及其应用。
背景技术
烟草根黑腐病(Black root rot,BRR)是由土壤真菌根串珠霉菌(Thielaviopsisbasicola)引起的一种常见土传病害。该真菌在世界主要烟叶产区广泛分布，在我国云南、贵州等主要烟叶主产区均发现有此病的发生。烟草根黑腐病的特征是根和幼茎基部等部位的黑色病变，进而导致营养缺乏，发育迟缓，晚熟，植株矮化且生长不均匀，叶片皱缩或萎蔫，严重时烟苗倒伏、死亡，从而严重影响烟草产量和质量。尽管通过轮作及化学药剂等手段，也能较好的防控根黑腐病对烟叶生产的危害，但上述手段不仅会造成环境污染且会增加烟叶的种植成本，而选育具有抗根黑腐病基因的品种是最经济有效且可持续的策略。
迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi，2n＝4x＝48)是源于澳大利亚的一种野生烟草，它不仅是研究杂交特性的理想材料，而且携带有烟草根黑腐病、霜霉病和白粉病等多种病害抗性基因，已成为烟草性状改良的有效遗传资源。通过种间杂交和回交，其根黑腐病的单显性抗病基因RBRR1已成功被转育到白肋烟与烤烟等栽培烟草中。
已知RBRR1对烟草根黑腐病菌株具有完全抗性，并在烟草各生育阶段均对根串珠霉菌具有较高的免疫能力。最新研究表明，烟草抗性位点RBRR1被定位在烟草17号染色体(K326参考基因组)上，SS219555和SS192650是与其共分离的显性CAPs标记。然而，CAPs标记必须使用限制性内切酶，需要较冗长的分析步骤，并受限于酶切效率不能适应高通量自动化的问题。另外，各种突变会引起酶切位点的增加或消失，极大限制了两个功能标记在分子标记辅助育种中的应用。
因此，重新开发一种方便检测且能适应高通量要求的根黑腐病抗性功能标记，是开展烟草根黑腐病品种选育的迫切需求。
发明内容
本发明提供了一种用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的功能分子标记及其应用，用于解决现有技术中存在的CAPs标记必须使用限制性内切酶，需要较冗长的分析步骤，并受限于酶切效率不能适应高通量自动化的技术问题。
本发明提供了一种用于抗烟草根黑腐病烟草植株选育的功能分子标记，扩增所述功能分子标记所用引物对选自引物对组A或B，第一引物对由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2组成；
第二引物对由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4组成；
第三引物对由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6组成；
第四引物对由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8组成；
引物对组B为选自以下引物对中的任意两个：
第五引物对由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10组成；
第六引物对由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12组成；
第七引物对由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14组成。
对应的引物对组A中：
第一引物对中SEQ ID NO:为InD192650-F、SEQ ID NO:2为InD192650-R；
第二引物对SEQ ID NO:3为InD219555-3F、SEQ ID NO:4为InD219555-3R；
第三引物对SEQ ID NO:5为BRR_LG2_InD-2-F、SEQ ID NO:6为BRR_LG2_InD-2-R；
第四引物对SEQ ID NO:7为BRR-LG2-InD-5-2F、SEQ ID NO:8王BRR-LG2-InD-5-4R；
引物对组B中：
第五引物对为SEQ ID NO:9为DM192650-2F、SEQ ID NO:10为DM192650-2R；
第六引物对SEQ ID NO:11为DM219555-2F、SEQ ID NO:12为DM219555-2R；
第七引物对为SEQ ID NO:13为DM5-1F、SEQ ID NO:14为DM5-2R。
本发明提供功能分子标记，仅需以烟草DNA为模块，采用高通量的扩增设备，以上述核苷酸序列为引物进行扩增后，即可得到所需的功能分子标记。采用该功能分子可有效指示含有对烟草根黑腐病明确抗性的RBRR1抗性位点，能有效辅助烟草植株育种后的筛选工作，同时检测结果不受突变后酶切准确率影响，能有效避免假阳性检测结果的出现，检测结果较准确，检测效率提高。
从自然环境中筛选得到具有该抗性位点的烟草植株后，进行推广种植后，能有效降低烟叶主产区烟草根黑腐病的发病比例和程度。
优选的，采用引物对组A扩增后指示烟草RBRR1抗性位点共显性标记。采用该组引物对进行扩增后，能准确有效指示RBRR1抗性位点的共显性标记。
优选的，采用引物对组B扩增后指示烟草RBRR1抗性位点显性功能标记。采用该组引物对进行扩增后，能准确有效指示RBRR1抗性位点的显性功能标记。
优选的，功能分子标记是由所述引物对以烟草植株基因组DNA为模板经PCR扩增得到。根据已获得引物对，可采用高通量扩增设备进行扩增得到功能分子标记，操作效率高，准确性高。扩增后还需进行电泳检测，具体按现有制备分子标记常用方法进行，在此不累述。
优选的，所述引物对组A选自所述第一引物对、第二引物对中的至少一对。所述第一引物对、第二引物对在扩增中均显示较优良的多态性。
优选的，所述引物对组A中至少包括：第四引物对。通过采用第四引物对进行扩增后，扩增效率高，在检测流程不精细的情况下也能很好的指示检测结果，适合相对较简陋的检查环境中使用。
本发明的另一面还提供了一种功能分子标记在烟草辅助育种或者抗烟草根黑腐病烟草RBRR1抗性位点基因检测中的用途，所述功能分子标记为如上述。
采用上述功能分子标记点，能有效检测烟草植株中是否含有该抗病位点。所用检测方法中其他未详述步骤和操作按现有基因位点检测常规PCR扩增操作进行，在此不累述。
本发明的另一方面还提供了一种烟草RBRR1抗性位点基因的检测方法，包括以下步骤：
以待检测烟草植株基因组DNA为模板，采用如上述的引物对对所述模块进行扩增，扩增结果通过电泳显示指示待检测烟草植株是否含有烟草RBRR1抗性位点基因。
所用检测方法中其他未详述步骤和操作按现有基因位点检测常规PCR扩增操作进行，在此不累述。
本发明的另一方面还提供了一种烟草辅助育种方法，方法包括：使用上述的功能分子标记对待筛选烟草植株进行RBRR1抗性位点基因检测的步骤。上述功能分子标记可用于烟草辅助育种中，对烟草植株中是否含有该抗病位点进行准确、高效、有效的检测，从而便于从大量植株中快速筛选出具有抗病基因的植株。
本发明“功能分子标记”是指实现100％鉴定抗病基因，能有效指示共分离，并能有效消除假阳性检测结果。
本发明能产生的有益效果包括：
1)本发明所提供的用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的功能分子标记及其应用，利用实验室现有基因组和重测序数据，以云晒1号(G306)基因组为参考，通过对携带RBRR1抗病基因材料TN90和感病材料云烟87的重测序数据分析，开发出了方便检测的InDel功能标记。
2)本发明所提供的用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的功能分子标记及其应用，采用本发明提供的功能标记进行了分子标记辅助抗病选育，鉴定了RBRR1抗病位点导入的遗传效应，并分析了RBRR1位点在烟草核心种质资源中的分布，为下一步开展烤烟抗根黑腐病品种选育及RBRR1基因的克隆奠定基础。
附图说明
图1为抗感材料及G306的RBRR1抗性位点共分离标记SS192650和SS219555两翼序列对比示意图；其中(a)SS192650位点的序列对比；(b)SS219555位点的序列对比，图中红色框和箭头分别显示转化InDel功能标记(InD192650-F、InD219555-3F、InD219555-3R)所在位置。TKF2002和TKF7002分别是前人报道的抗性和感病材料；
图2为RBRR1抗病位点不同共显性功能标记的多态性检测结果示意图；其中各功能标记点中泳道1和2为云烟87；泳道5和6为TN90；泳道3和4为F1。InD-2，-5，和-6分别为BRR_LG2_InD-2，-5，和-6。InD192650和InD219555-3F/3R具有良好的多态性；
图3为RBRR1抗病位点BRR_LG2_InD-5标记优化检测结果示意图；泳道A、F1和B分别为云烟87、杂交基因型和TN90；泳道1～15为BC3F2单株；图中箭头指示云烟87扩增条带所在位置，检测结果显示
BRR_LG2_InD-5-2F/2R，-2F/4R和-2F/5R均具有良好的多态性，其中BRR_LG2_InD-5-2F/4R的条带比较清晰；
图4为云烟87和TN90以及BC3F2群体中RBRR1+和RBRR1-基因型根黑腐抗性对比；图中(a)RBRR1位点在染色体上的位置(以G306为参考基因组)；(b)RBRR1位点的遗传定位，数据参考(Qin et al.2018)；(c)RBRR1位点定位区间各分子标记的物理位置锚定；(d)BC3F2世代RBRR1位点的两种重组类型；(e)BC3F2世代RBRR1+和RBRR1-基因型单株接菌根串珠霉菌后表型(左)和根黑腐抗性对比(右)。比例尺＝2cm；**P<0.01，t测验；
图5为RBRR1抗病位点显性功能标记在不同材料中的扩增结果；其中，SoTa2、Burley21和Kentucky14为白肋烟，Hicks broad leaf、Virginia Gold和Yellow Special为国外烤烟。
具体实施方式
本发明公开的功能标记分子可通过采用上述引物对，以烟草植株DNA基因序列为模块采用PCR高通量扩增后，指示烟草植株中是否包含烟草RBRR1抗性位点。
本发明中引物对为选自引物对组A或B，引物对组A为选自以下引物对中的任意两个：
第一引物对由InD192650-F、InD192650-R组成；
第二引物对由InD219555-3F、InD219555-3R组成；
第三引物对由BRR_LG2_InD-2-F、BRR_LG2_InD-2-R组成；
第四引物对由BRR-LG2-InD-5-2F、BRR-LG2-InD-5-4R组成；
引物对组B为选自以下引物对中的任意两个：
第五引物对由DM192650-2F、DM192650-2R组成；
第六引物对由DM219555-2F、DM219555-2R组成；
第七引物对由DM5-1F、DM5-2R组成。
本领域技术人员熟知，在上述引物对所示核苷酸序列中,可在其5'端或3'端分别增加1～10个碱基,所增加的碱基类型可根据烟草基因组DNA上与上述引物对相匹配区域的碱基类型，并依据碱基配对原则来确定。
1.1材料
所用材料为携带有RBRR1抗性位点的普通烟草TN90与烤烟主栽品种云烟87。
前期研究中，以TN90为供体亲本、以云烟87为受体亲本，通过连续回交已经获得74个BC3F2家系。
TN90/云烟87的BC3F2群体用于新开发/转化标记的验证，并结合分子标记辅助选育(Molecular Marker Assisted Selection，MAS)方法筛选BC3F2群体中纯合抗性位点基因型和非抗性纯合基因型单株用于抗性表型鉴定。
以337份不同烟草类型种质资源为研究材料，分析抗性位点的等位基因频率分布。
本实施例中所用两份亲本材料和337份种质资源来源于云南省烟草农业科学研究院种质库。
病原菌根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)由西南大学植物保护学院窦彦霞老师提供。
1.2引物设计及优化
SS219555和SS192650标记是RBRR1抗性位点的两个共分离CAPS标记。根据前人的研究结果(Qin et al.2018)，下载根黑腐病抗病和感病材料中SS219555和SS192650标记所在位点的扩增序列。
利用软件DNAMan(Version 9.0.1.116)分别对每个标记所在位点抗、感材料中的等位序列进行序列对比分析，根据序列的插入缺失(InDel)差异设计开发标记，将两个共分离CAPS标记转化成免酶切的InDel类型标记。
根据实验要求，可按现有技术中常用基因序列测定方法对所用云晒1号(G306)、普通烟草TN90和云烟87进行的基因测序。本发明采用已获取的云晒1号(G306)的基因组序列、普通烟草TN90和云烟87的重测序序列。
以云晒1号为参考序列，通过BLAST方法锚定SS219555和SS192650标记之间的物理区段，分析TN90和云烟87重测序数据以获取两者之间的序列差异信息。随后根据两个CAPs标记所在物理区间内的InDel差异位点设计开发标记。
参照[1]吴迷,汪念,沈超,等.基于重测序的陆地棉InDel标记开发与评价[J].作物学报,2019,045(002):196-203.中公开的方法进行InDel分子标记开发，并结合此部分内容进行操作：即：筛选出插入/缺失大于等于5bp的InDel位点，提取InDel位点上下游125bp序列并生成fasta文件，使用BatchPrimer3(v1.0,https://wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/)批量设计引物，引物长度范围为18～27bp、最适长度21bp，GC含量范围在40～60％之间，扩增片段150-200bp、最优扩增片段180bp。之后，检查返回的设计结果，并对需要的地方进行手动调整。
为了提高特异性，本发明通过对BRR_LG2_InD-5标记进行PCR扩增测序和引物设计优化。
1.3DNA提取、PCR扩增和电泳检测
本试验选用天根公司植物基因组提取试剂盒(目录号：DPYC3-50，TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.，LTD)提取供试材料基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。
PCR反应体系：DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)(dNTP浓度为0.4mmol/L,Mg2+浓度为4mmol/L)5μL，正、反引物(2μmoL/L)各1μL，DNA模板2μL(浓度50～100ng/μL)，补充ddH2O到10μL。PCR程序设置：95℃变性30s，退火温度是55℃持续30s，72℃延伸30s，设置35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶或1％的琼脂糖电泳检测。
1.4烟草根黑腐抗性鉴定
本论文按照Chen等描述的根部扩散法(Root irradiation)进行烟草根黑腐病抗性鉴定(Chen et al.2020)。在人工气候室内采用灭菌土培养烟草供试材料，设定30±1℃/28±1℃的日/夜温度、85-90％的相对湿度以及14h的光照时间，直至第四片真叶出现。
同时，将单孢分离得到的串珠霉(T.basicola)病原菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)平板上，在25℃下暗箱培养10～15天，收获分生孢子后，用无菌水配成孢子浓度为107孢子/mL的悬浮液。
利用无菌剪刀对四叶期烟苗的茎基两侧根系进行轻微伤害，立即灌根接种20mL的孢子悬浮液于烟株茎基部，并随后将供试烟苗放置于人工气候室进行培养；在接种后第15天(Days post-inoculation,dpi)，此时第一片枯萎叶片出现，用清水洗净烟株根系，进行病害等级鉴定。
所有对照处理用灭菌水进行。
参照国家烟草行业标准GB/T 23222-2008对烟草根黑腐分级标准中根部症状的描述，主要针对根系表型观察，将病害分为0、1、3、5、7、9共六级；其中，
0级：无病，主、侧根系均无明显坏死；
1级：少数主根和个别侧根坏死呈特异黑色；
3级：半数主根及少数侧根坏死呈黑色；
5级：大部分根系坏死呈黑色；
7级：根系全部坏死呈黑色，茎基部受害明显；
9级：病株基本枯死。
根据评级结果计算病情指数(disease severity index,DSI)，代表根黑腐病的发病程度。计算公式如下：
DSI＝[∑(各级代表值×各级病株数)]/(最高级值×调查总株数)×100
试验设计采取随机区组设计，共设置三个生物学重复，每个重复每个基因型包含15个单株。每个重复独立计算病情指数。
2结果与分析
2.1RBRR1抗性位点共显性功能标记的转化、开发及优化
RBRR1是一个单显性广谱性根黑腐抗病基因，前人已完成其两个共分离CAPS标记SS219555和SS192650的两翼序列测序(Qin et al.2018)。
在此基础上，本发明首先利用SS219555和SS192650标记所在位点在抗病和感病材料中的DNA扩增序列以及云晒1号参考基因组对应序列进行序列对比分析。
结果显示，在SS192650标记位点817bp的序列区间内共检测到50个SNP和5个InDel差异位点，其中有两个InDel位点序列差异大于5bp；在SS219555标记位点629bp的序列区间内共检测到9个SNP和4个InDel差异位点，其中有两个InDel位点序列差异大于5bp(图1)。
根据SS192650位点和SS219555位点的InDel差异信息分别设计1和3对引物(图1；表1)。利用含有RBRR1抗病基因的材料TN90和不含该抗病位点的材料云烟87对引物进行差异分析，其中InD192650和InD219555-3F/3R具有良好的多态性(图2)。
以云晒1号为参考序列，通过BLAST方法将SS219555和SS192650标记锚定到其Chr2染色体上，并将两者之间的物理区段(191,732,059-193,313,373)作为目标区间。
利用TN90和云烟87重测序数据以及云晒1号参考基因组序列对目标区间开发InDel分子标记，在目标区间内共获得6个InDel标记，分别命名为BBR-LG2-InDel-1～6(表1)。
对这些标记进行筛选，共有3个标记具有多态性，分别是BRR_LG2_InD-2，-5，和-6，其中BRR_LG2_InD-2和-5呈现较好的多态性(图2)。
在后续的标记使用过程中，BRR_LG2_InD-5在分离群体中表现出三种以上带型，不利于准确读取基因型。因此，进一步对BRR_LG2_InD-5标记进行优化，在多态性位点两侧分别增设1条正引物和4条反引物(表1)。
表1转化与开发的RBRR1抗性位点共显性标记
通过BRR_LG2_InD-5标记多条正反引物的组合及筛选，检测结果显示BRR_LG2_InD-5-2F/2R，-2F/4R和-2F/5R均具有良好的多态性，其中BRR_LG2_InD-5-2F/4R的条带比较清晰(参见图3)。然而，在TN90/云烟87的分离群体中进行检测时，虽然三个标记能够检测出RBRR1抗性位点，但是三个标记均表现为显性标记特征，即所有单株基因型均具有云烟87的带型(图3)。
综上所述，将InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R作为RBRR1抗性位点共显性功能标记用于后续分析。
2.2分子标记辅助选择选育
本研究院前期研究已获得以TN90为供体亲本、云烟87位轮回亲本的74个BC3F2家系。选取每个家系27个单株混合取样用于基因型检测，并利用上述转化或开发的标记进行分子标记辅助选择，共发现14个BC3F1世代单株含有抗病位点(杂合基因型)。同样，通过前景选择，从这14个衍生的BC3F2家系中获得含有纯合RBRR1抗病位点的单株，这些高世代改良株系可用作后续的抗病育种。
2.3抗性位点的遗传效应分析
为了分析RBRR1抗病位点在导入云烟87后的遗传效应，选取云烟87和TN90衍生的一个含有抗病位点的BC3F2群体进行研究。选用上述4个功能标记进行基因型分析，在285个BC3F2单株中，目标区间基因型为纯合RBRR1抗病位点基因型(记作RBRR1+)、纯合感病基因型的材料(记作RBRR1-)及杂合基因型的个体数目分别为60、76和149个，且没有检测到遗传交换单株。
选取RBRR1+和RBRR1-基因型单株在温室条件下进行根黑腐抗病性鉴定。同时，在同样条件下考察TN90和云烟87的根黑腐病抗性。
结果表明，云烟87平均病情指数为59.26％，TN90所有测试单株均未发病，其病情指数为0。对应的RBRR1+和RBRR1-在根黑腐病的抗性上表现出极显著差异；RBRR1+材料的根黑腐抗病平均病情指数为20.39％，RBRR1-材料的根黑腐抗病平均病情指数为72.35％(图4)。
2.4根黑腐抗性位点的单倍型分析
为了进一步探究RBRR1抗病位点在自然群体中的分布，利用4个InDel标记对包含不同调制类型的普通烟草(SSTT)材料进行基因分型，以检测RBRR1抗病位点的等位变异频率。
结果表明，在337份普通烟草核心种质资源中，共检测到1个烟草材料(Sota2)的基因型同TN90基因型一致(图5)，基因型频率为0.59％(表2)。
表2不同材料中RBRR1抗病位点的等位变异频率
表性鉴定结果显示，Sota2与TN90具有相似的根黑腐抗性表型。由此推测，该抗病位点尚未在我国烟草生产中普及应用。
由于上述4个InDel共显性标记在自然群体中均表现为只有两种基因型，因此，将其中3个InDel标记转化为检测RBRR1抗病位点的特异显性标记，分别为DM192650-2F/2R、DM219555-2F/2R和DM5-1F/2R，为KASP转化及高通量应用奠定基础(表3；图5)检测RBRR1抗病位点的特异显性标记，分别为DM192650-2F/2R、DM219555-2F/2R和DM5-1F/2R。
表3 RBRR1抗性位点显性功能标记
3讨论
3.1RBRR1位点功能标记转化、开发与利用
分子标记辅助选择回交育种已经在农作物抗病育种、品质育种中得到广泛应用(Singh et al.2015；Vida et al.2009；Zhao et al.2012；Zhou et al.2003)。在分子标记辅助选择过程中，分子标记的可靠性、检测时所需DNA的质和量、分子标记的检测流程、其多态性水平和成本被认为是限制分子标记广泛应用的五个因素(Collard and Mackill2008)。
然而，酶切步骤使得CAPS标记使用流程更加冗长，增加了CAPS标记的使用成本和试验难度，并限制其在高通量基因型检测领域里面的应用(An et al.2021；Shavrukov2016)。CAPS标记的这些特点使其特别适合于相对较小的实验室来定位克隆基因组目标区段或目标基因或多态性分析研究(Shavrukov 2016)。
本论文在前人研究基础上，锚定RBRR1抗性位点的两个共分离CAPS标记SS219555和SS192650的基因组所在物理区间，并随后根据SS219555和SS192650标记的两翼序列以及为云烟87和TN90的重测序数据，基于抗、感材料序列的InDel多态性转化、开发获得多个共显性、免酶切的分子标记。
进而，利用InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R进行分子标记辅助选择，筛选出根黑腐抗性显著提高的BC3F2世代RBRR1位点纯合单株，这些材料可用于后续的抗根黑腐品种选育。
这些结果说明，本发明通过转化或开发的4个InDel标记可用于根黑腐抗性育种的分子标记辅助选择和后续的抗病基因定位。
易位系，尤其是小片段易位系，是目前将野生资源优异基因导入生产作物最为理想的方式。一般来说，具有较小的外来片段的易位系在遗传上更稳定，产生有害影响的可能性更小。
例如，在主粮作物小麦的研究中发现，冰草6P染色体小片段的插入易位系Pubing3035具有显著提高的粒重和穗长，并根据连锁图谱将易位断点定位在小麦1A染色体短臂的着丝粒附近(Zhang et al.2015)。与此类似，前人同样通过遗传连锁图谱将RBRR1基因定位在17号染色体(K326基因组)的SS127301和SS166247标记之间(Qin et al.2018)；同时，本研究将RBRR1基因共分离标记SS219555和SS192650锚定到Chr2染色体(G306基因组，Chr2长＝201,712,017)长臂末端，表明RBRR1基因是以片段易位而非整臂易位的形式被导入到普通烟草中。通常情况下，位于外源染色体片段的标记表现为显性标记。
然而，在本研究的标记开发鉴定过程中，所转化和开发的标记几乎均为共显性标记。前人测序还发现携带RBRR1基因的抗性材料中SS219555和SS192650标记两翼序列与N.debneyi一致(Qin et al.2018)。同时，在对BRR_LG2_InD-5标记的改良过程中，BRR_LG2_InD-5-2F/2R，-2F/4R和-2F/5R在分离群体的所有单株中均能够扩增云烟87的带型。综上，推测RBRR1基因是以一个外源片段插入易位的形式导入到普通烟草，才能使得这些标记既能够在扩增出外源片段条带的同时也能够扩增出普通烟草的条带。然而，关于携带RBRR1基因的抗性材料的基因组组成鉴定尚需要进一步研究。
3.2RBRR1位点在烟草育种中的利用价值
由于早期栽培所用普通烟草品种对根黑腐病没有免疫能力，烟草根黑腐的影响给全世界烟草种植者造成了巨大的损失。RBRR1抗病位点在白肋烟上的首先应用使得根黑腐病情得到了很大的控制(朱贤朝2002)。本研究发现，在我国主栽烤烟品种、国内烤烟、国内晒烟和香料烟中均未携带RBRR1抗病位点，仅在引进的白肋烟中发现两个材料携带有该抗病位点，表明RBRR1抗病位点在我国尚未进行广泛利用。
有报道称RBRR1抗病位点和烤烟的不良农艺性状及化学特质相关(Legg etal.1981)，而紧密连锁标记将有助于识别重组事件，打破RBRR1和N.debneyi邻近基因之间潜在的不利连锁。理论上，位于N.debneyi易位/插入片段的标记在纯合抗病材料中的扩增带型应该一致，而在普通烟草中可能具有扩增多态性。
本研究结果表明，InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R标记在自然群体中扩增具有二元性，只有两种PCR扩增表现。
因此，又将其中三个标记转化为检测RBRR1抗病位点的显性标记，为后续的KASP标记转化及高通量基因型鉴定奠定基础。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例
以下实施例中所用物料及仪器如无特殊说明，均通过商业渠道购得。
1.1材料
所用材料为携带有RBRR1抗性位点的普通烟草TN90与烤烟主栽品种云烟87。
前期研究中，以TN90为供体亲本、以云烟87为受体亲本，通过连续回交已经获得74个BC3F2家系。
TN90/云烟87的BC3F2群体用于新开发/转化标记的验证，并结合分子标记辅助选育(Molecular Marker Assisted Selection，MAS)方法筛选BC3F2群体中纯合抗性位点基因型和非抗性纯合基因型单株用于抗性表型鉴定。
以337份不同烟草类型种质资源为研究材料，分析抗性位点的等位基因频率分布。
本实施例中所用两份亲本材料和337份种质资源来源于云南省烟草农业科学研究院种质库。
病原菌根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)由西南大学植物保护学院窦彦霞老师提供。
1.2引物设计及优化
SS219555和SS192650标记是RBRR1抗性位点的两个共分离CAPS标记。根据前人的研究结果(Qin et al.2018)，下载根黑腐病抗病和感病材料中SS219555和SS192650标记所在位点的扩增序列。
利用软件DNAMan(Version 9.0.1.116)分别对每个标记所在位点抗、感材料中的等位序列进行序列对比分析，根据序列的插入缺失(InDel)差异设计开发标记，将两个共分离CAPS标记转化成免酶切的InDel类型标记。
根据实验要求，可按现有技术中常用基因序列测定方法对所用云晒1号(G306)、普通烟草TN90和云烟87进行的基因测序。本发明采用已获取的云晒1号(G306)的基因组序列、普通烟草TN90和云烟87的重测序序列。
以云晒1号为参考序列，通过BLAST方法锚定SS219555和SS192650标记之间的物理区段，分析TN90和云烟87重测序数据以获取两者之间的序列差异信息。随后根据两个CAPs标记所在物理区间内的InDel差异位点设计开发标记。
参照[1]吴迷,汪念,沈超,等.基于重测序的陆地棉InDel标记开发与评价[J].作物学报,2019,045(002):196-203.中公开的方法进行InDel分子标记开发，并结合此部分内容进行操作：即：筛选出插入/缺失大于等于5bp的InDel位点，提取InDel位点上下游125bp序列并生成fasta文件，使用BatchPrimer3(v1.0,https://wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/)批量设计引物，引物长度范围为18～27bp、最适长度21bp，GC含量范围在40～60％之间，扩增片段150-200bp、最优扩增片段180bp。之后，检查返回的设计结果，并对需要的地方进行手动调整。
为了提高特异性，本发明通过对BRR_LG2_InD-5标记进行PCR扩增测序和引物设计优化。
1.3DNA提取、PCR扩增和电泳检测
本试验选用天根公司植物基因组提取试剂盒(目录号：DPYC3-50，TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.，LTD)提取供试材料基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。
PCR反应体系：DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)(dNTP浓度为0.4mmol/L,Mg2+浓度为4mmol/L)5μL，正、反引物(2μmoL/L)各1μL，DNA模板2μL(浓度50～100ng/μL)，补充ddH2O到10μL。PCR程序设置：95℃变性30s，退火温度是55℃持续30s，72℃延伸30s，设置35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶或1％的琼脂糖电泳检测。
1.4烟草根黑腐抗性鉴定
本论文按照Chen等描述的根部扩散法(Root irradiation)进行烟草根黑腐病抗性鉴定(Chen et al.2020)。在人工气候室内采用灭菌土培养烟草供试材料，设定30±1℃/28±1℃的日/夜温度、85-90％的相对湿度以及14h的光照时间，直至第四片真叶出现。
同时，将单孢分离得到的串珠霉(T.basicola)病原菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)平板上，在25℃下暗箱培养10～15天，收获分生孢子后，用无菌水配成孢子浓度为107孢子/mL的悬浮液。
利用无菌剪刀对四叶期烟苗的茎基两侧根系进行轻微伤害，立即灌根接种20mL的孢子悬浮液于烟株茎基部，并随后将供试烟苗放置于人工气候室进行培养；在接种后第15天(Days post-inoculation,dpi)，此时第一片枯萎叶片出现，用清水洗净烟株根系，进行病害等级鉴定。
所有对照处理用灭菌水进行。
参照国家烟草行业标准GB/T 23222-2008对烟草根黑腐分级标准中根部症状的描述，主要针对根系表型观察，将病害分为0、1、3、5、7、9共六级；其中，
0级：无病，主、侧根系均无明显坏死；
1级：少数主根和个别侧根坏死呈特异黑色；
3级：半数主根及少数侧根坏死呈黑色；
5级：大部分根系坏死呈黑色；
7级：根系全部坏死呈黑色，茎基部受害明显；
9级：病株基本枯死。
根据评级结果计算病情指数(disease severity index,DSI)，代表根黑腐病的发病程度。计算公式如下：
DSI＝[∑(各级代表值×各级病株数)]/(最高级值×调查总株数)×100
试验设计采取随机区组设计，共设置三个生物学重复，每个重复每个基因型包含15个单株。每个重复独立计算病情指数。
2结果与分析
2.1RBRR1抗性位点共显性功能标记的转化、开发及优化
RBRR1是一个单显性广谱性根黑腐抗病基因，前人已完成其两个共分离CAPS标记SS219555和SS192650的两翼序列测序(Qin et al.2018)。
在此基础上，本发明首先利用SS219555和SS192650标记所在位点在抗病和感病材料中的DNA扩增序列以及云晒1号参考基因组对应序列进行序列对比分析。
结果显示，在SS192650标记位点817bp的序列区间内共检测到50个SNP和5个InDel差异位点，其中有两个InDel位点序列差异大于5bp；在SS219555标记位点629bp的序列区间内共检测到9个SNP和4个InDel差异位点，其中有两个InDel位点序列差异大于5bp(图1)。
根据SS192650位点和SS219555位点的InDel差异信息分别设计1和3对引物(图1；表1)。利用含有RBRR1抗病基因的材料TN90和不含该抗病位点的材料云烟87对引物进行差异分析，其中InD192650和InD219555-3F/3R具有良好的多态性(图2)。
以云晒1号为参考序列，通过BLAST方法将SS219555和SS192650标记锚定到其Chr2染色体上，并将两者之间的物理区段(191,732,059-193,313,373)作为目标区间。
利用TN90和云烟87重测序数据以及云晒1号参考基因组序列对目标区间开发InDel分子标记，在目标区间内共获得6个InDel标记，分别命名为BBR-LG2-InDel-1～6(表1)。
对这些标记进行筛选，共有3个标记具有多态性，分别是BRR_LG2_InD-2，-5，和-6，其中BRR_LG2_InD-2和-5呈现较好的多态性(图2)。
在后续的标记使用过程中，BRR_LG2_InD-5在分离群体中表现出三种以上带型，不利于准确读取基因型。因此，进一步对BRR_LG2_InD-5标记进行优化，在多态性位点两侧分别增设1条正引物和4条反引物(表1)。
表1转化与开发的RBRR1抗性位点共显性标记
通过BRR_LG2_InD-5标记多条正反引物的组合及筛选，检测结果显示BRR_LG2_InD-5-2F/2R，-2F/4R和-2F/5R均具有良好的多态性，其中BRR_LG2_InD-5-2F/4R的条带比较清晰(参见图3)。然而，在TN90/云烟87的分离群体中进行检测时，虽然三个标记能够检测出RBRR1抗性位点，但是三个标记均表现为显性标记特征，即所有单株基因型均具有云烟87的带型(图3)。
综上所述，将InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R作为RBRR1抗性位点共显性功能标记用于后续分析。
2.2分子标记辅助选择选育
本研究院前期研究已获得以TN90为供体亲本、云烟87位轮回亲本的74个BC3F2家系。选取每个家系27个单株混合取样用于基因型检测，并利用上述转化或开发的标记进行分子标记辅助选择，共发现14个BC3F1世代单株含有抗病位点(杂合基因型)。同样，通过前景选择，从这14个衍生的BC3F2家系中获得含有纯合RBRR1抗病位点的单株，这些高世代改良株系可用作后续的抗病育种。
2.3抗性位点的遗传效应分析
为了分析RBRR1抗病位点在导入云烟87后的遗传效应，选取云烟87和TN90衍生的一个含有抗病位点的BC3F2群体进行研究。选用上述4个功能标记进行基因型分析，在285个BC3F2单株中，目标区间基因型为纯合RBRR1抗病位点基因型(记作RBRR1+)、纯合感病基因型的材料(记作RBRR1-)及杂合基因型的个体数目分别为60、76和149个，且没有检测到遗传交换单株。
选取RBRR1+和RBRR1-基因型单株在温室条件下进行根黑腐抗病性鉴定。同时，在同样条件下考察TN90和云烟87的根黑腐病抗性。
结果表明，云烟87平均病情指数为59.26％，TN90所有测试单株均未发病，其病情指数为0。对应的RBRR1+和RBRR1-在根黑腐病的抗性上表现出极显著差异；RBRR1+材料的根黑腐抗病平均病情指数为20.39％，RBRR1-材料的根黑腐抗病平均病情指数为72.35％(图4)。
2.4根黑腐抗性位点的单倍型分析
为了进一步探究RBRR1抗病位点在自然群体中的分布，利用4个InDel标记对包含不同调制类型的普通烟草(SSTT)材料进行基因分型，以检测RBRR1抗病位点的等位变异频率。
结果表明，在337份普通烟草核心种质资源中，共检测到1个烟草材料(Sota2)的基因型同TN90基因型一致(图5)，基因型频率为0.59％(表2)。
表2不同材料中RBRR1抗病位点的等位变异频率
表性鉴定结果显示，Sota2与TN90具有相似的根黑腐抗性表型。由此推测，该抗病位点尚未在我国烟草生产中普及应用。
由于上述4个InDel共显性标记在自然群体中均表现为只有两种基因型，因此，将其中3个InDel标记转化为检测RBRR1抗病位点的特异显性标记，分别为DM192650-2F/2R、DM219555-2F/2R和DM5-1F/2R，为KASP转化及高通量应用奠定基础(表3；图5)检测RBRR1抗病位点的特异显性标记，分别为DM192650-2F/2R、DM219555-2F/2R和DM5-1F/2R。
表3 RBRR1抗性位点显性功能标记
3讨论
3.1RBRR1位点功能标记转化、开发与利用
分子标记辅助选择回交育种已经在农作物抗病育种、品质育种中得到广泛应用(Singh et al.2015；Vida et al.2009；Zhao et al.2012；Zhou et al.2003)。在分子标记辅助选择过程中，分子标记的可靠性、检测时所需DNA的质和量、分子标记的检测流程、其多态性水平和成本被认为是限制分子标记广泛应用的五个因素(Collard and Mackill2008)。
然而，酶切步骤使得CAPS标记使用流程更加冗长，增加了CAPS标记的使用成本和试验难度，并限制其在高通量基因型检测领域里面的应用(An et al.2021；Shavrukov2016)。CAPS标记的这些特点使其特别适合于相对较小的实验室来定位克隆基因组目标区段或目标基因或多态性分析研究(Shavrukov 2016)。
本论文在前人研究基础上，锚定RBRR1抗性位点的两个共分离CAPS标记SS219555和SS192650的基因组所在物理区间，并随后根据SS219555和SS192650标记的两翼序列以及为云烟87和TN90的重测序数据，基于抗、感材料序列的InDel多态性转化、开发获得多个共显性、免酶切的分子标记。
进而，利用InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R进行分子标记辅助选择，筛选出根黑腐抗性显著提高的BC3F2世代RBRR1位点纯合单株，这些材料可用于后续的抗根黑腐品种选育。
这些结果说明，本发明通过转化或开发的4个InDel标记可用于根黑腐抗性育种的分子标记辅助选择和后续的抗病基因定位。
易位系，尤其是小片段易位系，是目前将野生资源优异基因导入生产作物最为理想的方式。一般来说，具有较小的外来片段的易位系在遗传上更稳定，产生有害影响的可能性更小。
例如，在主粮作物小麦的研究中发现，冰草6P染色体小片段的插入易位系Pubing3035具有显著提高的粒重和穗长，并根据连锁图谱将易位断点定位在小麦1A染色体短臂的着丝粒附近(Zhang et al.2015)。与此类似，前人同样通过遗传连锁图谱将RBRR1基因定位在17号染色体(K326基因组)的SS127301和SS166247标记之间(Qin et al.2018)；同时，本研究将RBRR1基因共分离标记SS219555和SS192650锚定到Chr2染色体(G306基因组，Chr2长＝201,712,017)长臂末端，表明RBRR1基因是以片段易位而非整臂易位的形式被导入到普通烟草中。通常情况下，位于外源染色体片段的标记表现为显性标记。
然而，在本研究的标记开发鉴定过程中，所转化和开发的标记几乎均为共显性标记。前人测序还发现携带RBRR1基因的抗性材料中SS219555和SS192650标记两翼序列与N.debneyi一致(Qin et al.2018)。同时，在对BRR_LG2_InD-5标记的改良过程中，BRR_LG2_InD-5-2F/2R，-2F/4R和-2F/5R在分离群体的所有单株中均能够扩增云烟87的带型。综上，推测RBRR1基因是以一个外源片段插入易位的形式导入到普通烟草，才能使得这些标记既能够在扩增出外源片段条带的同时也能够扩增出普通烟草的条带。然而，关于携带RBRR1基因的抗性材料的基因组组成鉴定尚需要进一步研究。
3.2RBRR1位点在烟草育种中的利用价值
由于早期栽培所用普通烟草品种对根黑腐病没有免疫能力，烟草根黑腐的影响给全世界烟草种植者造成了巨大的损失。RBRR1抗病位点在白肋烟上的首先应用使得根黑腐病情得到了很大的控制(朱贤朝2002)。本研究发现，在我国主栽烤烟品种、国内烤烟、国内晒烟和香料烟中均未携带RBRR1抗病位点，仅在引进的白肋烟中发现两个材料携带有该抗病位点，表明RBRR1抗病位点在我国尚未进行广泛利用。
有报道称RBRR1抗病位点和烤烟的不良农艺性状及化学特质相关(Legg etal.1981)，而紧密连锁标记将有助于识别重组事件，打破RBRR1和N.debneyi邻近基因之间潜在的不利连锁。理论上，位于N.debneyi易位/插入片段的标记在纯合抗病材料中的扩增带型应该一致，而在普通烟草中可能具有扩增多态性。
本研究结果表明，InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R标记在自然群体中扩增具有二元性，只有两种PCR扩增表现。
因此，又将其中三个标记转化为检测RBRR1抗病位点的显性标记，为后续的KASP标记转化及高通量基因型鉴定奠定基础。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的功能分子标记及其应用
<210>1
<211>20
<212> DNA
<213>人工合成
<130> InD192650-F
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<210>2
<211>20
<212> DNA
<213>人工合成
<130> InD192650-R
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<212> DNA
<213>人工合成
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<212> DNA
<213>人工合成
<130> InD219555-3R
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<130> BRR_LG2_InD-2-R
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tgtcttgcattgcattactt 20
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taaacgcttttcttccatgc 20
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<212> DNA
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<130> DM219555-2R
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<212> DNA
<213>人工合成
<130> DM5-1F
gcattacttagatgcactacaac 23
<210>14
<211>23
<212> DNA
<213>人工合成
<130> DM5-2R
aatcctcaaattcatgcccaag 23
Claims (8)
1.一种用于烟草根黑腐病主效抗性位点筛选/检测的引物对，其特征在于，所述引物对选自引物对组A或B，
引物对组A为选自以下引物对中的任意两个：
第一引物对由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2组成；
第二引物对由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 组成；
第三引物对由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6组成；
第四引物对由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8组成；
引物对组B为选自以下引物对中的任意两个：
第五引物对由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10组成；
第六引物对由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12组成；
第七引物对由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14组成。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，采用引物对组A扩增后指示烟草RBRR1抗性位点共显性标记。
3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，采用引物对组B扩增后指示烟草RBRR1抗性位点显性功能标记。
4.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述功能分子标记是由所述引物对以烟草植株基因组DNA为模板经PCR扩增得到。
5.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对组A中至少包括：第四引物对。
6.一种引物对在烟草辅助育种或者抗烟草根黑腐病烟草RBRR1抗性位点基因检测中的用途，其特征在于，所述引物对为如权利要求1~5中任一项所述。
7.一种烟草RBRR1抗性位点基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待检测烟草植株基因组DNA为模板，采用如权利要求1~5中任一项中所述的引物对对所述模块进行扩增，扩增结果通过电泳显示指示待检测烟草植株是否含有烟草RBRR1抗性位点基因。
8.一种烟草辅助育种方法，其特征在于：所述方法包括：使用权利要求1~5中任一项所述的引物对对待筛选烟草植株进行RBRR1抗性位点基因检测的步骤。
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