CN114032323B - 一种与雪茄烟抗黑胫病基因紧密连锁的共显性ssr标记及其应用 - Google Patents

一种与雪茄烟抗黑胫病基因紧密连锁的共显性ssr标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与雪茄烟抗黑胫病基因紧密连锁的共显性SSR标记及其应用，所述的抗黑胫病基因qBS01为源自雪茄烟品种Beinhart1000‑1的数量性状基因位点，且具有黑胫病0、1号生理小种抗性。所述的与雪茄烟Beinhart1000‑1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMc14137和TMc14142，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。所述的应用为所述的与雪茄烟Beinhart1000‑1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在抗黑胫病基因qBS01中的应用。本发明所述的共显性SSR标记具有快捷、稳定、精准且低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草黑胫病0、1号生理小种抗病育种中qBS01基因分子标记辅助选择的应用。

Description

一种与雪茄烟抗黑胫病基因紧密连锁的共显性SSR标记及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。
背景技术
烟草黑胫病(tobacco black shank)最早由van Breda de Haan于1896年在印度尼西亚的爪哇发现，是世界烟草生产中危害最严重的病害之一(马国胜,高智谋,曹舜.烟草黑胫病菌的寄主范围.中国农业科学,2012,45(5):867-876.)，特别是在温带、亚热带和热带发生程度较重，也是中国烟叶生产的主要病害之一，造成的产值损失位列烟草病害前三位。烟草黑胫病的病原为烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae，习惯上称烟草黑胫病菌)，可在烟草生长任何时期侵染其根、茎和叶，导致根系坏死、叶片萎焉失绿、茎秆损伤甚至整株死亡(Sullivan, MJ,Melton,TA and Shew HD.Fitness of races 0and 1 of Phytophthora parasitica var.nicotianae. Plant Dis,2005,89:1220-1228.)。目前已报道的烟草黑胫病菌生理小种有4个：0号和1号生理小种于1962年在美国北卡罗来纳州发现(Apple JL.Physiological specialization within Phytophthoraparasitica var.nicotianae.Phytopathology,1962,52:351-354；Mclntyre J L,andHankin L.Lack of kestose(fructosylsucrose)production by race 3of phytophthoraparasitica var. nicotianae differentiates it from races 0and 1.Mycologia,1997,69(4):756-760.)；2号小种和3号小种分别在南非和美国发现(Sullivan,MJ,Melton,TA and Shew HD.Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasiticavar.nicotianae.Plant Dis,2005,89:1220-1228.)，但目前并未普遍发生。
目前，已知抗烟草黑胫病的抗源有两种类型：一类是单基因抗性，其属于质量性状，且抗性主要来自野生烟草N.plumbaginifolia(Php)和N.longiflora(Phl)。分别将抗性基因Php 和Phl转育到烟草同一条染色体上后，研究表明此两个基因位点非同一遗传位点(Johnson E S, Wolff M F,Wernsman E A,Atchley W R and Shew H D.Origin oftheblack shank resistance gene, Ph,in tobacco cultivar Coker 371-Gold.PlantDis.,2002a,86:1080-1084.)。Johnson等利用集团分离分析法(BSA)鉴定出了与Coker371-Gold抗黑胫病基因连锁的RAPD标记、并已用于分子标记辅助选择。Bao等(Johnson ES,Wolff M F,Wernsman E A and Rufty R C.Marker-assisted selection forresistance to black shank disease in tobacco.Plant Dis,2002b,86:1303-1309.)利用含 378个单株的F2群体将Php初步定位在烟草第20号连锁群(LG20)SCAR标记BS031403和SSR 标记PT51063之间，进一步开发标记、并将群体规模增加到1000个以上F2单株，得到了与Php 基因共分离的标记、但并未缩小定位区间。而源自于黄花烟草育种资源Wz对黑胫病菌0号和1 号小种的抗性由单基因Wz控制(Drake K E,Moore J M,Bertrand P,Fortnum B,Peterson P and Lewis R S.Black Shank Resistance and Agronomic PerformanceofFlue-Cured Tobacco Lines and Hybrids Carryingthe Introgressed Nicotianarustica Region,Wz.Crop Sci.,2015,55:79-86.)；Shi 等利用近等基因系进行分子标记分析，发现转育至烤烟的Wz渐渗片段位于19号染色体，片段大小约65Mb，并开发了可用于Wz基因标记辅助选择的KASP和SCAR标记(Shi R,Hubert H, Dexter-Boone A,Zeng J,Kernodle S P,Lewis R S.Identification and validation of SNP markersassociatedwith Wz-mediated Phytophthora nicotianae resistancein Nicotianatabacum L.Mol Breeding,2019,39:102；McCorkle K L,Drake-Stowe K,Lewis R S andShew D.Characterization of Phytophthora nicotianae Resistance Conferred bythe Introgressed Nicotiana rustica Region,Wz, in Flue-Cured Robacco.PlantDis.,2018.102:309-317.)。此外，针对上述属于质量性状的烟草黑胫病抗性单基因(Ph和Wz)开发的标记，也有相关的授权专利报道(一种用于烟草黑胫病抗性基因Ph辅助选择的分子标记及其应用,专利号:ZL201410250266.7；一种分子标记辅助选择定向改良烟草黑胫病抗性的育种方法,专利号:ZL201610979196.2；一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记及其应用,专利号:ZL 2016 1 0054257.4；一种与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因Bs_t连锁的SSR标记及其应用,专利号:ZL 2017 1 1124725.1)。
另一类是受微效多基因控制的数量性状抗性，抗源是两个雪茄烟品种Florida301和 Beinhart 1000-1，且对黑胫病菌0号和1号小种均有抗性，其中Beinhart 1000-1的黑胫病抗性强于Florida301。Vontimitta等进行了Beinhart 1000抗黑胫病QTL分析，检测到6个QTL与黑胫病抗性相关，贡献率最大的主效QTL位点位于8号连锁群(Vontimitta V,Lewis RS.Mapping of quantitative trait loci affecting resistanceto Phytophthoranicotianae in tobacco(Nicotiana tabacum L.)line Beinhart-1000.Mol Breeding,2012,29:89-98.)。Zhang等在Beinhart 1000-1中也定位到效应最大QTL(qBS7)，Ma等进一步分析了该QTL(定名为Phn7.1)的位置和效应，通过开发 SNP提高标记密度，利用一系列近等基因系(NIL)将定位区间缩小到约3cM的区间，可用于分子标记辅助选择育种和候选基因克隆(Zhang Y,Guo X,Yan X,Ren M,Jiang C,Cheng Y,Wen L,Liu D,Zhang Y,Sun M,FengQ,Yang A,Chenga L.Identification of stably expressed QTL forresistance toblack shank disease in tobacco(Nicotiana tabacum L.)line Beinhart 1000-1.TheCrop J.,2018,6:282-290；Ma J M,Heim C,Humphry M,Nifong J M,Lewis R S.Geneticanalysis of Phn7.1,a major QTL conferring partialresistance to Phytophthoranicotianae in Nicotiana tabacum.Mol Breeding,2019,39:11.)。Drake-Stowe等(2017)对K346抗黑胫病QTL进行了分析，检测到5个QTL与黑胫病抗性相关，其中效应最大的QTL也是位于LG7连锁群，与前述 Phn7.1应为同一个QTL(Drake-Stowe K,Bakaher N,GoepfertS,Philippon B,MarkR,Peterson PandLewisR S.Multiple Disease Resistance LociAffect Soilborne Disease Resistance in Tobacco (Nicotiana tabacum).Phytopathology,2017,107:1055-1061.)。
针对上述质量性状(单基因控制)和数量性状(微效多基因控制)两大类型抗源，研究较多的则是受单基因控制的质量性状抗性。因受单基因(Ph和Wz)控制的烟草黑胫病抗性很强、且易于通过育种手段转移到栽培烟草品种中进行应用。但此类黑胫病抗性主要是针对黑胫病0号生理小种的，随着大量具有黑胫病0号生理小种抗性烟草品种的推广应用，导致目前生产上烟草黑胫病优势生理小种呈现0号到1号的转换趋势。为了培育出同时具有黑胫病0、1 号生理小种抗性且无野生烟草种和黄花烟草种基因组连锁累赘的烟草新品种，受微效多基因控制且呈水平抗性的数量性状抗源受到烟草育种工作者的重视。
鉴于此，本发明以高抗黑胫病0、1号生理小种的雪茄烟品种Beinhart1000-1和易感黑胫病 0、1号生理小种的烤烟品种红花大金元为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341 份株系的烟草重组自交系(RILs_F7:8)为作图群体，利用数量性状连锁分析(QTL)法和单粒黑胫病菌谷创伤接种法，在烟草全基因组范围内筛选获得与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记，以加速分子标记辅助选择(MAS)在烟草抗黑胫病0、 1号生理小种新品系选育中的精准、高效利用。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因 qBS01紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。
本发明采用如下技术方案实现。
一种与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01，本发明所述的抗黑胫病基因qBS01 属于数量性状基因位点且具有烟草黑胫病0号和1号生理小种抗性，其黑胫病抗性的抗源是来自雪茄烟品种Beinhart1000-1。
一种与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记，本发明所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的编号为 TMc14137和TMc14142，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2、 SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
本发明所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
TMc14137序列为：
TMc14137F：5’-CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGG-3’(SEQ ID NO.5)，
TMc14137R：5’-ATCAACTTTTGCGGTCGAGA-3’(SEQ ID NO.6)；
TMc14142序列为：
TMc14142F：5’-GCAATACCAATGGGCAAAAC-3’(SEQ ID NO.7)，TMc14142R：5’-TGCAACGCGTGTACCTTAAA-3’(SEQ ID NO.8)。
上述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的应用在于检测烟草基因组DNA中是否存在抗黑胫病基因qBS01。
本发明上述的应用，该应用的方法为，以TMc14137序列的引物和TMc14142序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物。
本发明该应用的方法为，PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株含有源自雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病0、1号生理小种的纯合等位基因，基因型记为BSBS。
本发明该应用的方法为，PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列则为待测烟草植株不含源自雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病0、1号生理小种的纯合等位基因，基因型记为bsbs。
本发明该应用的方法为，PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有源自雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病0、1号生理小种的杂合等位基因，基因型记为BSbs。
本发明的有益效果为，本发明提供了一种用于检测具有雪茄烟Beinhart1000-1抗源的黑胫病抗性基因qBS01的分子标记，与已授权专利和文献报道的黑胫病抗性基因标记相比，本发明所提供的标记更具有显著优势：(1)抗源类型不同，已授权专利的抗源均是受单基因控制的质量性状，来源于非栽培烟草－野生烟草种(N.plumbaginifolia和N.longiflora)和黄花烟草种(N.rustica)；而本发明中所涉及的黑胫病抗源则是受微效多基因控制的数量性状，来源于栽培烟草种－雪茄烟Beinhart1000-1。(2)抗性水平不同，已授权专利中所涉及的黑胫病抗病性是垂直抗性，抗性虽强但随着长时间大面积推广应用后，极易失去抗性或促使其他生理小种转变为优势小种，而导致具有含基因Ph或Wz失去对其他优势生理小种的黑胫病抗性；而本发明中所涉及的黑胫病抗病性则是水平抗性，其对黑胫病0号和1号生理小种均具有抗性且抗性持久。(3)连锁累赘存在与否，已授权专利中的黑胫病抗性基因均与非栽培烟草(野生烟草种和黄花烟草种)基因组片段紧密连锁，导致连锁累赘，且这些连锁累赘通常都是烟叶生产中不利性状，故此，在将已授权专利中的黑胫病抗性基因转移到栽培烟草中时，也因存在无法打破的连锁累赘而使育成的烟草黑胫病抗性品种无法在生产中推广应用；而本发明中所涉及的黑胫病抗性基因qBS01则来源于栽培烟草Beinhart1000-1，因此，不存在影响其大面积推广应用的连锁累赘存在。(4)更精细的QTL定位结果，相较于文献报道的雪茄烟 Beinhart1000-1黑胫病抗性QTL定位结果，本发明提供的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01两侧紧密连锁标记间的遗传距离更小、定位结果更精确，因此，用作烟草黑胫病抗性选育的分子标记进行辅助选择的结果也更精准。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1是基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的黑胫病抗性 QTL分析曲线图。
其中，上图为烟草全基因范围内的黑胫病抗性QTL定位图；下图为烟草第7号连锁群上黑胫病抗性主效QTL定位图。QTL定位软件为：WinQTLCart v2.5；参数设置：定位方法为CIM： Composite Interval MappingQTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01 (Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。上图中横坐标为烟草基因组中的染色体或连锁群编号；纵坐标为LOD值。下图中横坐标为遗传距离(单位：厘摩cM)；纵坐标为LOD值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的LOD值＝7.86；LOD曲线最高点为黑胫病抗性主效基因(qBS01_7)。
具体实施方式
本发明的第一目的在于提供一种既具有黑胫病0、1号生理小种抗性，又属于数量性状基因位点(QTL)的烟草黑胫病新抗源，其抗源来自与雪茄烟品种Beinhart1000-1；第二目的在于提供一种与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记；第三目的在于提供所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草抗黑胫病基因qBS01是来源于雪茄烟品种 Beinhart1000-1，以其为抗病亲本与感黑胫病的其余优良烟草品种进行杂交，使雪茄烟品种 Beinhart1000-1中的抗黑胫病0、1号生理小种基因qBS01转移到待改良的烟草品种中，进而培育具有基因qBS01而抗黑胫病0、1号生理小种的烟草新品种(系)。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMc14137和TMc14142，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为 SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在来源于雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01中的应用。
为简捷、精准、高效的选择具有同时抗烟草黑胫病0、1号生理小种的品种，有针对性的选择含抗黑胫病基因qBS01的后代材料，本发明提供一种用于检测抗黑胫病基因qBS01的分子标记TMc14137和TMc14142，该分子标记采用数量性状连锁分析(QTL)法和单粒黑胫病菌谷创伤接种法，在烟草全基因组范围内筛选获得与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01 基因连锁的共显性SSR标记，可用于抗黑胫病基因qBS01的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及抗黑胫病0、1号生理小种烟草品种选育的效率。
本发明以高抗黑胫病0、1号生理小种的雪茄烟品种Beinhart1000-1和易感黑胫病0、1号生理小种的烤烟品种红花大金元为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341份株系的烟草重组自交系(RILs_F7:8)为作图群体，利用数量性状连锁分析(QTL)法和单粒黑胫病菌谷创伤接种法，在烟草全基因组范围内筛选获得与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因 qBS01紧密连锁的共显性SSR标记，以加速分子标记辅助选择(MAS)在烟草抗黑胫病0、1 号生理小种新品系选育中的精准、高效利用。
本发明所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMc14137和TMc14142，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
TMc14137序列为
TMc14137F：5’-CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGG-3’，
TMc14137R：5’-ATCAACTTTTGCGGTCGAGA-3’；
TMc14142序列为
TMc14142F：5’-GCAATACCAATGGGCAAAAC-3’，
TMc14142R：5’-TGCAACGCGTGTACCTTAAA-3’。
本发明所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在抗黑胫病基因qBS01中的应用。
所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TMc14137序列的引物和TMc14142序列的引物扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列即为该烟草植株具有黑胫病抗性的纯合等位基因BSBS；如果PCR扩增产物中同时含有如SEQID No.2和SEQ ID No.4所示序列则为待测烟草植株不存在黑胫病抗性的纯合等位基因bsbs；如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、 SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为待测烟草植株中含有黑胫病抗性的杂合基因BSbs。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
采用数量性状连锁分析(QTL)法并结合单粒黑胫病菌谷创伤接种法，在烟草全基因组范围内筛选与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01连锁的共显性SSR标记
一、实验材料以综合性状优良但易感黑胫病0、1号生理小种的烤烟品种红花大金元为母本，以高抗黑胫病0、 1号生理小种的雪茄烟品种Beinhart1000-1为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(RILs_F7:8)作为遗传作图群体。
二、亲本及RILs_F7:8群体黑胫病0、1号生理小种抗性表型数据获得
采用单粒黑胫病菌谷创伤接种法，具体如下：
(a)烟苗的准备：取HD、Beinhart1000-1、F1及341份RILs_F7:8种子，按常规漂浮育苗方式育苗，50～60天后移栽至装有育苗基质的花盆中，1株/盆，8株/处理，4次重复/生理小种，置温室煅苗7天，烟苗成活后，剪叶、整苗，待接种黑胫病菌。
(b)接种方法：采用单粒菌谷创伤根茎部接种法。烟草疫霉由本实验室分离鉴定，其中Pn 119 为0号生理小种、Pn 68为1号生理小种，病菌活化2～3次后，在燕麦培养基(OA)平板上28℃恒温培养箱培养7～10天，待培养基表面长满黑胫病菌菌丝后，接种到燕麦固体培养基上28℃恒温培养箱培养14～18天，待菌丝长满燕麦粒后，掏出、分散成单粒，作为接种体。将烟苗根茎部一侧的基质掏开，用一次性注射器针头创伤，将1粒长满菌丝的燕麦粒贴于烟苗根茎部的创伤口处，再用基质填平，然后浇灌少量的蒸馏水使基质表面完全湿润，小花盆置于盛自来水的托盘中维持湿度。每批次接种黑胫病0、1号生理小种均以抗病亲本Beinhart1000-1、感病品种红花大金元及其子一代(F1)同样处理作对照。接种后的烟苗放置在28℃、相对湿度75％以上、12小时光照12小时黑暗的人工气候室培养。
(c)病情调查及数据处理：接种后3天观察发病情况，按国家标准GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法分别在接种后第7、14和21天进行3次调查，统计病情指数(DI：Disease Index)。利用每次调查的平均病情指数和调查时间间隔计算每个株系的病害流行曲线下面积 (AUDPC：Area Under Disease Progress Curve)。最后，针对每个生理小种，3次调查的每个株系平均DI值和AUDPC值作为4个处理条件(即接种后第7天、14天、21天的平均DI值和 AUDPC值)。上述获得的341份RILs_F7:8黑胫病0、1号生理小种抗性DI值及AUDPC值作为表型数据，用于下一步的QTL连锁分析。
三、SSR标记分析
烟草基因组DNA提取：采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
PCR扩增及电泳检测：PCR扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献，其中，本发明所提供的标记退火温度均为60℃；PCR扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。
利用本实验室分别基于烤烟红花大金元和雪茄烟Beinhart1000-1基因组信息开发的约50000个 SSR标记，对RILs_F7:8群体的双亲(红花大金元和Beinhart1000-1)和子一代(F1)进行多态性筛选，最终，筛选获得2001个多态性SSR标记。再利用筛选获得2001个多态SSR标记，对341 份RILs_F7:8样品进行基因型分析。其次，利用遗传连锁作图软件JoinMap4.0对341份RILs_F7:8样品的基因型数据进行连锁分析，绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个SSR标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cM的高质量雪茄烟遗传连锁图谱，作为RILs_F7:8群体的基因型值，用于下一步的QTL连锁分析。
四、雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因(qBS01)的全基因组QTL分析利用QTL定位分析软件WinQTLCart v2.5对RILs_F7:8群体的基因型数据和表型数据，对抗黑胫病基因qBS01进行全基因组QTL扫描。其中，相关参数设置为：定位方法选CIM：Composite IntervalMapping QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。最后，在全基因组范围内的LOD＝7.86条件下，位于第7号连锁群的146.50cM处定位获得烟草黑胫病0、1号生理小种抗性的1个主效QTL(暂命名为qBS01_7)。该主效QTL可解释约20.6～43.70％的表型变异率，且此时的LOD值约为16.14～42.71，详见图1和表1。
表1源于Beinhart1000-1抗黑胫病QTL(qBS01_7)信息统计
注：BS_DI0_7d、BS_DI0_14d、BS_DI0_21d和BS_AUDPC_0分别表示烟草RILs群体在接种烟草黑胫病0号生理小种第7天、14天、21天后的平均病情指数(DI)和基于上述3个病情指数计算获得的病害流行曲线下面积(AUDPC)；同理，BS_DI1_7d、BS_DI1_14d、BS_DI1_21d和BS_AUDPC_1分别表示烟草黑胫病1号生理小种的3个时期DI值和AUDPC值。
实施例2
共显性连锁标记在RILs_F8:9群体单株中的验证
利用获得的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01两侧紧密连锁的共显性SSR标记 TMc14137和TMc14142，对苗期的RILs_F8:9群体(红花大金元×Beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得RILs_F8:9群体各单株的基因型数据；另一方面，采用单粒黑胫病菌谷创伤接种法对各株系的黑胫病0、1号生理小种进行接种鉴定并获得各株系的黑胫病0、1号生理小种抗性表型值。最后，分析341份RILs_F8:9群体的基因型数据与黑胫病0、1号生理小种抗性表型值，发现本发明公布的两个共显性SSR标记TMc14137和TMc14142的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。具体的分析方法为：通过单粒黑胫病菌谷创伤接种法鉴定获得的各株系黑胫病0、1号生理小种DI值和AUDPC值低于或等于抗病亲本Beinhart1000-1时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1(339bp)和SEQ IDNO.3(277bp)所示序列即为抗病纯合基因型BSBS；鉴定获得的各株系黑胫病0、1号生理小种DI值和AUDPC值等于或高于感病亲本红花大金元时，该株系的基因型中也是同时呈现如IDNO.2(317bp)和SEQ ID NO.4(229bp)所示序列即为感病纯合基因型bsbs；而当鉴定获得的各株系黑胫病0、1号生理小种DI值和AUDPC值介于感病亲本红花大金元与抗病亲本Beinhart1000-1之间，也即与子一代(F1)相近时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列，或含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列，或含有SEQID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列，或含有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示序列即为抗病杂合基因型BSbs。
以上结果表明，共显性标记TMc14137和TMc14142分别与源自雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁，且该两个标记位于目的基因/QTL(qBS01_7)两侧。利用上述两个共显性紧密连锁SSR标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的黑胫病0、 1号生理小种抗性鉴定，而且也可清晰鉴别待测植株中的黑胫病抗性基因型状态，此既提高了具有黑胫病0、1号生理小种抗性烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
序列表
SEQ ID NO.1：
CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGGATTTGATGAATAGCAATAAAAAGAGTAATAATGACA AAAGTTTTTTTTGACAGAAAATAAGAAAAAAGTTCAAAAATTTGAGGAAAAAGATAAA CTATCATACTGAATCATGTCACATCATCTTTTATATTCCCAACTTTATATTTATATATAGATAT ATATATATATATATATATAGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGA TCCTTATCTAGATATATTTATCTTACATATTTTGTCTATTTAAAGCTCCACATTTATACATTAT TTTTCTCTCGACCGCAAAAGTTGAT
SEQ ID NO.2：
CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGGATTTGATGAATAGCAATAAAAAGAGTAATAATGACA AAAGTTTTTTTTGACAGAAAATAAGAAAAAAGTTCAAAAATTTGAGGAAAAAGATAAA CTATCATACTGAATCATGTCACATCATCTTTTATATTCCCAACTTTATATTTATATATAGATAT ATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGATCCTTATCTAGATATATTTAT CTTACATATTTTGTCTATTTAAAGCTCCACATTTATACATTATTTTTCTCTCGACCGCAAAA GTTGAT
SEQ ID NO.3：
GCAATACCAATGGGCAAAACTTACATCTATACTTAAAATATGTATCTTTACATATATTGTCA CTTGGATTTACTCTTTAGTTTTCTTAGTTGGTATACATAAATTATACACGAGTTATGGATGA TTATACATTATTTTATATGAAGTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT ATATATATATATATATATTTATATATACATATACATAATAGTTTTAATTTTTTTAAATACTAGTC TTTAAGGTACACGCGTTGCA
SEQ ID NO.4：
GCAATACCAATGGGCAAAACTTACATCTATACTTAAAATATGTATCTTTACATATATTGTCA CTTGGATTTACTCTTTAGTTTTCTTAGTTGGTATACATAAATTATACACGAGTTATGGATGA TTATACATTATTTTATATGAAGTTATATATATATATATATATATATACATATACATAATAGTTTTA ATTTTTTTAAATACTAGTCTTTAAGGTACACGCGTTGCA
SEQ ID NO.5：
CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGG
SEQ ID NO.6：
ATCAACTTTTGCGGTCGAGA
SEQ ID NO.7：
GCAATACCAATGGGCAAAAC
SEQ ID NO.8：
TGCAACGCGTGTACCTTAAA
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例,方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种与雪茄烟抗黑胫病基因紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
<160>8
<210>1
<211>339
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGGATTTGATGAATAGCAATAAAAAGAGTAATAATGACAAAAGTTTTTTTTGACAGAAAATAAGAAAAAAGTTCAAAAATTTGAGGAAAAAGATAAACTATCATACTGAATCATGTCACATCATCTTTTATATTCCCAACTTTATATTTATATATAGATATATATATATATATATATATAGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGATCCTTATCTAGATATATTTATCTTACATATTTTGTCTATTTAAAGCTCCACATTTATACATTATTTTTCTCTCGACCGCAAAAGTTGAT
<210>2
<211>317
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGGATTTGATGAATAGCAATAAAAAGAGTAATAATGACAAAAGTTTTTTTTGACAGAAAATAAGAAAAAAGTTCAAAAATTTGAGGAAAAAGATAAACTATCATACTGAATCATGTCACATCATCTTTTATATTCCCAACTTTATATTTATATATAGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGATCCTTATCTAGATATATTTATCTTACATATTTTGTCTATTTAAAGCTCCACATTTATACATTATTTTTCTCTCGACCGCAAAAGTTGAT
<210>3
<211>277
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GCAATACCAATGGGCAAAACTTACATCTATACTTAAAATATGTATCTTTACATATATTGTCACTTGGATTTACTCTTTAGTTTTCTTAGTTGGTATACATAAATTATACACGAGTTATGGATGATTATACATTATTTTATATGAAGTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTATATATACATATACATAATAGTTTTAATTTTTTTAAATACTAGTCTTTAAGGTACACGCGTTGCA
<210>4
<211>229
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GCAATACCAATGGGCAAAACTTACATCTATACTTAAAATATGTATCTTTACATATATTGTCACTTGGATTTACTCTTTAGTTTTCTTAGTTGGTATACATAAATTATACACGAGTTATGGATGATTATACATTATTTTATATGAAGTTATATATATATATATATATATATACATATACATAATAGTTTTAATTTTTTTAAATACTAGTCTTTAAGGTACACGCGTTGCA
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGG
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ATCAACTTTTGCGGTCGAGA
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
GCAATACCAATGGGCAAAAC
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
TGCAACGCGTGTACCTTAAA

Claims (2)

1.一种与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的应用，其特征在于，所述的与雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病基因qBS01紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TMc14137和TMc14142，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
TMc14137序列为：
TMc14137F：5’- CGGAAGAAAGAGAGATGAAGTGG -3’，
TMc14137R：5’- ATCAACTTTTGCGGTCGAGA -3’；
TMc14142序列为：
TMc14142F：5’- GCAATACCAATGGGCAAAAC -3’，
TMc14142R：5’- TGCAACGCGTGTACCTTAAA -3’；
应用在于检测烟草基因组DNA中是否存在抗黑胫病基因qBS01；
该应用的方法为，PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株含有源自雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病0、1号生理小种的纯合等位基因，基因型记为BSBS；
PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示序列则为待测烟草植株不含源自雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病0、1号生理小种的纯合等位基因，基因型记为bsbs；
PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，或含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，或含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即为含有源自雪茄烟Beinhart1000-1抗黑胫病0、1号生理小种的杂合等位基因，基因型记为BSbs。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该应用的方法为，以TMc14137序列的引物和TMc14142序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物。
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