KR102144263B1

KR102144263B1 - 풋마름병 저항성 토마토 선발을 위한 프라이머 세트 및 풋마름병 저항성 토마토 선발 방법

Info

Publication number: KR102144263B1
Application number: KR1020190072870A
Authority: KR
Inventors: 이제민; 아레벨 메쿠리아우 아베베
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2020-08-14

Abstract

본 발명은 풋마름병 저항성 토마토 선발을 위한 프라이머 세트 및 풋마름병 저항성 토마토 선발 방법에 관한 것으로, 본 발명의 토마토 풋마름병 저항성 토마토 선발을 위한 프라이머 세트를 이용하여 육안으로 구별되지 않는 토마토 풋마름병 저항성 토마토를 객관적으로 평가할 수 있으므로 토마토 품종개량 및 개량된 품종에 대한 토마토 풋마름병 저항성을 평가하는데 유용하게 이용할 것이다.

Description

풋마름병 저항성 토마토 선발을 위한 프라이머 세트 및 풋마름병 저항성 토마토 선발 방법{Primer set for screening tomato resitant to Bacterial wilt, method for screening tomato resitant to Bacterial wilt}

본 발명은 풋마름병 저항성 토마토 선발을 위한 프라이머 세트 및 풋마름병 저항성 토마토 선발 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 식물군 분류 그룹 54개에 포함된 많은 식물종들에 영향을 미치는 풋마름병은 Ralstonia pseudoso lanacearum에 의해 발생하며 가장 해로운 병 중의 하나이다. Ralstoniaso lanacearum species complex (RSSC)는 숙주의 종류, 탄소의 활용 그리고 16S-23S rRNA 염기서열의 상대적 위치에 따라 5개의 레이스(race), 4개의 생물형(biovar) 그리고 4개의 계통형(phylotype)으로 분류된다. 최근에는 RSSC를 유전자분석과 다른 균주(strain)의 단백질체 형태를 이용하여 3개의 종류(species)로 분류하였다.

풋마름병원균의 주요 숙주는 가지과 작물이며 열대 및 아열대 지방의 작물 생산량에 악영향을 미친다. 풋마름병원균은 토양 전염성으로 식물 뿌리의 자연 개구 또는 상처를 통해 침입하여 물관 조직에 피해를 입히고 뿌리에서 줄기로 가는 물의 흐름을 막아서 감수성 식물체의 경우 죽게 된다. 병원균의 물관 감염 돌연변이가 시듦 증상을 유발하지 못하는 것으로 보아 물관 감염과 확산이 풋마름병 발생에 중요한 것임을 알 수 있었다.

다양한 풋마름병 균주에 대해 저항성을 가지는 토마토, 가지 및 고추의 생식질(germplasm)을 평가하였을 때 가지나 고추와 비교해서 토마토가 상대적으로 낮은 풋마름병 저항성을 나타냈다. 풋마름병은 넓은 기주범위와 유전적 다양성을 가지며 조직 내에 발생하기 때문에 더욱 방제가 어렵다.

비록 화학적, 생물학적 및 재배방법과 같은 다양한 방제 방법이 있지만 풋마름병에는 효과적이지 못하다. 저항성 계통을 개발하는 것이 풋마름병을 방제하는데 가장 효과적인 방법이다. 전세계적으로 풋마름병 저항성 소재라고 여겨지는 Hawaii7996(Solanumlycopersicum)은 지리적 위치나 세균의 종류와 관계없이 안정적이기 때문에 많은 풋마름병 저항성 연구에 유용한 소재로 여겨진다.

이전 연구에서 Hawaii 7996과 풋마름병에 가장 감수성이 높은 West Virginia 700(Solanum pimpinellifolium)의 F₂와 F₃를이용해 풋마름병 저항성과 관련된 QTL들이 3, 4 ,6 ,8 및 12번 염색체에 있다고 밝혀내었지만 다양한 토마토 품종에서 토마토의 풋마름병 저항성을 분석하기 위한 분자마커는 개발 되어 있지 않다.

(001) 대한민국 등록 특허 KR 10-1883117

이에 본 발명자는 토마토 6번 염색체에 존재하는 유전자들 중에서 토마토 풋마름병 저항성 토마토를 판별할 수 있는 SNP를 발견하고 이를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 다양한 토마토 재배품종에서 토마토 풋마름병 저항성 토마토를 판별할 수 있음을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 2563번째 염기가 T 또는 C, 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 128번째 염기가 T 또는 G인 것인 토마토 풋마름병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 2563번째 염기가 C 또는 상기 서열번호 2의 128번째 염기가 G인 경우 토마토 풋마름병 저항성 토마토인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 조성물로서,

상기 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 2563번째 염기가 C 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 128번째 염기가 G인 것인, 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 조성물을 포함하는, 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 토마토 시료로부터 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계; 2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 3) 상기 PCR 증폭 산물에 Mse I 또는 Hinf I인 제한효소를 처리하고, 처리된 결과물을 분석하는 단계를 포함하는 것인 토마토 풋마름병 저항성 토마토의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 토마토 풋마름병 저항성 토마토 선발을 위한 프라이머 세트를 이용하여 육안으로 구별되지 않는 토마토 풋마름병 저항성 토마토를 객관적으로 평가할 수 있으므로 토마토 품종개량 및 개량된 품종에 대한 토마토 풋마름병 저항성을 평가하는데 유용하게 이용할 것이다.

도 1은 토마토에 풋마름병원균을 접종하여 4주후 토마토 재배품종에서 저항성을 확인한 그래프이다:
Hawaii 7996, B-blocking, Shincheonggang, BWR-20, Spider, High power, 10-BA-3-33, Hawaii 7998, 10-BA-4-24, SVTX6258, Fighting, VF36, IL12-2, M82, E6203, Moneymaker.
도 2는 본 발명의 토마토 풋마름병 저항성 마커를 이용하여 PCR 산물을 증폭하고 각각의 효소로 절단한 결과를 나타낸 사진이다:
감수성 품종: 1. M82, 2, E6203, 3. Moneymaker, 4. IL12-2, 5. VF36, 6. Heinz1706,
저항성 품종: 7. Hawaii 7996, 8. Hawaii 7998, 9. 10-BA-3-33, 10. 10-BA-4-24, 11. BWR-20, 12. Shincheonggang, 13. B-blocking, 14. High power, 15. Super high power.
도 3은 유전자 Solyc06g053210.2의 염기서열 및 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 유전자 Solyc06g054230.2의 염기서열 및 SNP 위치를 나타낸 것이다.

본 발명은 “토마토 세균 및 바이러스병 저항성 분자표지 개발” 과제 결과물로서, 본 연구를 진행할 수 있게 지원해준 토마토 세균 및 바이러스병 저항성 분자표지 개발 과제를 진행 중인 GSP 사업단에 큰 감사를 표한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

토마토 풋마름병은 다양한 조건과 조절 환경에서 나타나며 토마토 재배품종인 Hawaii 7996에서 토마토 풋마름병 저항성에 관여하는 2개의 주요 QTL인 Bwr-6(chromosome 6) 및 Bwr-12(chromosome 12)를 재조합 준계통(Recombinant inbred line) 집단을 통해 밝혀졌다. Bwr-12는 Pss4 (race 1, biovar 4)에 특이적 활성 QTL이고, 몇몇 실험에서 밝혀진 표현형 변이가 50% 이상인 SSR 마커 SLM12-12과 SLM12-2사이에 있으며 2.8 cM이고, Bwr-6 또한 이전 연구를 통해 알려진 마커 SLM6-124와 SLM6-110 사이에 위치하고 있으며 15.5 cM로 알려져 있다. 비록 2개의 QTL이 Hawaii 7996의 풋마름병 저항성에 주요 기능을 하는것으로 확인되었으나 이 중요한 QTL의 유전적 발생에 대해서는 알려지지 않았다. 2개의 QTL의 유전적 기반을 찾기 위해 2개의 감수성 토마토 변이(varieties)와 7개의 저항성 토마토 변이(varieties)를 홀 지놈 리시퀀싱(whole-genome resequencing) 한 결과, 저항성과 감수성, 두 그룹 사이에서 coding polymorphic SNP가 12번 염색체에서 168개로 가장 많이 발견되었고 6번 염색체에서는 53개로 두번째로 많이 발견되었다. 이 SNP들은 토마토 풋마름병 저항성과 관련이 있다고 추측하여 Bwr-12 주변에 위치한 SNP들을 분석하였고 풋마름병 저항성과 강하게 연결되는 분자마커를 개발하여 저항성과 감수성 토마토 품종을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인하였다. 반면에 Bwr-6 주변에 위치한 다형성(polymorphic) SNP는 12.7 Mbp 이상의 넓은 구역에 분포되어있고 QTL을 추적하기 위한 풋마름병 저항성 연관분자마커가 없으므로 본 발명에서는 Bwr-6의 유전적 분석을 통하여 풋마름병 저항성 관련 분자마커를 개발하였고, 새로개발된 마커인 Ch6-4와 Ch6-5는 풋마름병 저항성을 위한 육종에 필요한 QTL을 밝혀냈으며, 큰 QTL 구역을 Ch6-4와 Ch6-5 사이 1.1Mbp 크기 이하로 줄일 수 있는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 2563번째 염기가 T 또는 C, 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 128번째 염기가 T 또는 G인 것인 토마토 풋마름병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서 서열번호 1은 Solyc06g053210.2의 유전자를 나타낸 것으로 총 2823개의 염기서열로 이루어져 있고(도 3 참조), 서열번호 2는 Solyc06g054230.2의 유전자를 나타낸 것으로 1341개의 염기서열로 이루어져 있다(도 4 참조).

본 발명의 용어, “풋마름병(Bacterial wilt)”은 막대 모양의 토양 매개 그람음성세균인 Ralstonia pseudoso lanacearum에 의해 유발되는 질병이며, 풋마름병이라고도 알려져있다. 풋마름병을 유발하는 병원균은 상처 또는 뿌리의 자연적 개방을 통해 토마토에 침입하고, 뿌리가 자루에서 수평으로 자라면 도관부 조직을 감염시켜 감수성식물의 혈관 시스템에서 물의 흐름을 막아 식물이 빠르게 시들어간다. 주로 고온일 경우 쉽게 발생하는 질병이다.

본 발명의 용어, “저항성”은 외부의 스트레스에 대해 견디는 성질을 의미하며, 구체적으로 질병 등의 감염에 내성을 가지거나, 해충 등의 피해를 견디는 성질을 의미한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수 도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 토마토 풋마름병 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "개체"란, 토마토 풋마름병 저항성을 확인하고자 하는 대상인 토마토를 의미하며, 상기 토마토로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 토마토 풋마름병 저항성이 있는 토마토를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 토마토 풋마름병이 드러나지 않는 병저항성 분자 마커를 개발하기 위하여 토마토 6번 염색체의 6개의 SNP를 발견하였고, Solyc06g035630.1, Solyc06g051190.1, Solyc06g051210.2, Solyc06g053210.2, Solyc06g054230.2, Solyc06g054400.2 및 Solyc12g009690.1를 타켓 유전자로 하여 제작한 프라이머를 제작하였다. 표 2에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 토마토 풋마름병 저항성과 감수성 분석을 한 결과 서열번호 9 및 10의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트가 서열번호 1(Solyc06g053210.2) 또는 서열번호 2(Solyc06g054230.2)의 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있으므로 토마토 풋마름병의 저항성 또는 감수성의 판별을 정확하게 할 수 있었다(도 2).

<실시예 1> 실험 재료

<1-1> 식물 재료

마커분석을 하기 위해 F₁시판 교배종을 포함한 토마토 재배품종을 확보하였으며 표 3에 표시하였다. 토마토 재배풉종들은 풋마름 병저항성과 강하게 연관된 더 나은 마커를 선발하기위해 Bwr-6와 Bwr-12 주변에 마커를 새로 개발하여 유전자형을 확인하는데 이용하였다.

<1-2> 균재료, 접종 준비 및 병 검정

병 검정에 사용된 병원균은 Ralstonia pseudosolanacearum strain인 SL882로 국내에 있는 토마토 식물체로부터 분리하였으며 race 1, biovar 4 및 phylotype I으로 분류된다. 병원균은 Casamino acid-Peptone Glucose (CPG) 배지(멸균수 1리터당 Casamino acid 1g, peptone 10 g, glucose 5 g, agar 15 g)에 배양하였으며 28℃의 생장실에서 배양하였다. 48시간 배양한 병원균을 멸균수에 현탁하여 접종액을 만들었고 NanoDrop 2000/UV-Vis spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 농도를 10⁸CFU/ml (OD₆₀₀=0.1)로 조절하였다.

토마토 종자를 페트리디쉬에서 발아시킨 후 원예용 상토(biomix,JM Bio사)를채운 128구 트레이에 이식하였다. 온실환경에서 1개월된 토마토 묘는 트레이에서 꺼내 접종액에 침지하여 풋마름병균을 접종하였다. 접종한 묘는 50구 트레이에 이식한 후 식물생장상(온도 =28℃; 습도 =70%; 광조건 16시간/암조건 8시간)에서 두고 병징을 관찰하였다. 병징의 정도는 0단계에서 4단계(0=증상없음; 1= 마른잎 비율이 50% 이하; 2= 마른잎 비율이 50-75%; 3= 마른잎 비율이 75% 이상; 4= 식물체 고사)로 평가하였다.

본 실험에서 표현형을 확인하지 않은 품종들은 이전 연구나 회사를 통해 얻은 정보를 통해 표현형을 확인하였다(표 3).

<실시예 2> 실험 방법

<2-1> DNA 추출

DNA 추출을 위해 접종 전 어린 잎을 따서 샙플을 수집하였다. DNA는 CTAB 방법을 변형한 방법으로 추출하였다. 어린 잎을 2ml 원심분리 튜브에 6mm 유리구슬 2개와 함께 넣고 600 μl CTAB buffer (2% CTAB, 1.42 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mMTris-Cl (pH=8.0), ddH₂O), 3μl of 0.5 % β-mercaptoethanol, and 100mg/ml of 10 μl ascorbic acid를 넣은 후 FastPrep-24^TM (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)를 이용하여 잎을 파쇄하였다. 파쇄한 후 65℃에 15분간 둔 다음 600μl chloroform: isoamyl alcohol (24:1 v/v)을 첨가한 후 highspeed centrifuge 1580R (LABOGENE Co., Ltd)를 이용하여 13,000rpm으로 15분간 원심분리켰다. 상층액을 새 1.5ml 원심분리 튜브에 옮겨 담은 후 isopropanol 500μl를 첨가하고 13,000rpm에 15분간 원심분리를 시켰다. 원심분리 튜브 안에 있는 펠렛을 제외한 상층액을 제거했다. 펠렛을 살균 하기 위해 70% 알코올 750μl를 넣고 13,000rpm에 5분간 돌린 다음 알코올을 제거한 후 ddH₂O가 30-40 μl포함된 1% RNase를 펠렛에 첨가했다. 모든 원심분리는 4℃에서 진행하고 DNA 농도를 확인하기위해 NanoDrop 2000/UV-Vis spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하였다.

<2-2> 마커 개발 및 유전자형 확인

Bwr-6 주변에 위치하며 CDS에 존재하는 풋마름병 저항성과 감수성 사이의 SNP들을 whole-genome resequencing를 이용하여 풋마름병 저항성 토마토 7개와 감수성인 토마토 2개 그룹의 염기서열 사이에 존재하는 Bwr-6 근처 SNP를 통해 18개의 SNP를 포함하는 15개의 후보 유전자를 찾아냈다. 각각의 유전자들은 1개의 SNP를 가지고 있었으며 Solyc06g051110.1는 2개, Solyc06g051140.2의 경우 3개의 SNP를 가지고 있었다. 토마토 참고 유전자 염기서열 (Tomato Genome 2012)을 이용하였고 SNP의 물리적 위치는 위에 언급된 것 처럼 이미 정해져있다. 풋마름병 저항성과 감수성 그룹 사이에 SNP의 변이를 통해 바뀐 염기서열은 하기 표 1에 나타냈다. 6개의 SNP를 바탕으로 프라이머 세트를 제작하여 QTL 부위를 밝혀냈으며 그 구간을 좁혀 나갔다. dCAPS finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)를 이용하여 SNP로 예상되는 위치에 적절한 제한 효소를 찾았다. 프라이머는 PCR을 통해 감수성과 저항성 토마토 재배품종에서 모두 증폭된 싱글 밴드로 나타난 것을 확인했고, PCR 생성물을 각각의 효소로 절단시켰다. 본 발명에서 사용된 프라이머와 각각의 제한효소들은 하기 표 2에 나타내었다.

<실시예 3> 실험 결과

<3-1> 토마토 풋마름병 저항성 표현형 검정 분석 결과

본 발명에서는 이전 연구에서 보고된 토마토 풋마름병 평가 실험을 기반으로하거나 종자의 출처/기원으로 토마토 풋마름병 저항성 표현형 검정을 하였다. 풋마름병 저항성 소재로 알려진 Hawaii 7996을 대조군으로 사용하였다. 병징 검정은 접종 후 4일간 진행하였으며 Hawaii 7996, B-blocking, 신청강(Shincheonggang)은 병징이 없는 저항성으로 나타났으며 IL12-1, M82, VF36, E6203는 높은 감수성으로나타났다(도 1). 구체적으로, 토마토 재배품종의 표현형 정보나 출처는 표 3에 나타냈다.

<3-2> 풋마름병 저항성과 관련된 6번 염색체의 분자마커 개발

드러나지 않은 토마토 풋마름병 저항성 분자마커를 찾기 위해 Bwr-6 주변에 존재하는 SNP들을 분석하였다. 본 발명의 표 2에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 15개의 토마토 재배품종(6개 감수성과 9개 저항성)에서 추출한 gDNA를 이용하여 풋마름병 저항성을 판별하였다.

구체적으로, 6개 프라이머 각각 227 bp (Ch6-1), 203 bp (Ch6-2), 214 bp (Ch6-3), 213 bp (Ch6-4), 204 bp (Ch6-5) 및 234 bp (Ch6-6)의 싱글 밴드(single band)로 증폭시켰다. PCR 증폭산물을 각각의 제한 효소들로 절단시켜 저항성과 감수성 그룹으로 나누어 생식질(germplasm)을 확인하였다.

그 결과, 모든 프라이머 세트들은 저항성과 감수성 그룹이 다형성 밴드(polymorphic band)를 보였다. 동일하게 Ch12-1 프라이머 세트는 PCR을 통해 싱글 밴드(single band)를 만들었고 제한효소를 통해 다형성 밴드(polymorphic band)를 나타냈다(도 2).

<3-3> 풋마름병 저항성 토마토 선발 마커를 이용한 토마토 재배품종의 유전자형 분석

토마토의 6번 염색체와 12번 염색체의 CAPS/dCAPS 마커를 이용하여 토마토 재배품종의 유전자형을 검증하였다.

구체적으로, Bwr-6 QTL과 강하게 연관된 마커 중 좋고 신뢰할 만한 마커를 선발하기 위해 서열번호 3 내지 14의 풋마름병 저항성 토마토 선발 마커를 이용하여 83개의 토마토 재배품종에서 유전자형을 확인하였다. Ch6-1, Ch6-2 및 Ch6-3의 경우 풋마름병 저항성을 가지는 두개의시판 대목(하이파워(High power), 슈퍼하이파워(Super high power))에서 헤테로나 감수성 유전자형을 보였다. 특히 하이파워의 경우 풋마름병에 강한 저항성을 가지고 있지만 세개의 마커 Ch6-1, Ch6-2 및 Ch6-3에서는 감수성을 나타냈다.

또한, Ch6-4와 Ch6-5의 경우 저항성 대목인 하이파워에서 헤테로 유전자형을 나타냈으며 감수성 재배품종인 SV 7160 TC에서 저항성 유전자형을 나타냈다. 그리고 Ch6-4는 추가로 감수성 재배품종인 율원(Yulwon)에서 저항성 유전자형을 나타냈다. Ch6-6는 모든 저항성 재배품종에서 저항성 유전자형을 나타냈으나 대부분의 감수성 토마토들에서도 저항성이나 헤테로 유전자형을 나타냈다.

또한, Ch12-1는 풋마름병 감수성 재배품종인 SV02444 TG, SV4224 TH, SV0339TG, Dafnis, Komodo, Tory, Mamirio, Doterang Solar, Super sun road, Super top, Hoyong, Taiyau, Taihu, Chalstone TY, TY Marathon, Trio plus F1, TY Carnival, Black Eagle, Bntoskna, Yureka, Black Ace, Black Change에서 헤테로 유전자형을나타냈으며 감수성 재배품종인 Rafito의 경우 저항성 유전자형을 나타냈다.

따라서, 본 발명에서는 하기 표 4 및 도 2에서 나타난 바와 같이 유전자형에 차이를 보인수가 Ch12-1이 Ch6-4와 Ch6-5보다 많았고, 토마토 풋마름변 균주에 대한 저항성이 Bwr-6가 Bwr-12보다 다양하며, 특히 본 발명의 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12의 마커가 토마토 풋마름변 균주를 가장 효율적인 마커임을 확인하였다.

^z 유전자형이 결정되지 않았음.

표 내부가 진하게 표시된 것은 표현형과 일치하지 않는 품종을 나타냄.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for screening tomato resitant to Bacterial wilt, method for screening tomato resitant to Bacterial wilt <130> PN1905-265 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2823 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solyc06g053210.2(Ch6-4) <400> 1 atgtgctttt ttggaatgac taactaaatt taacatttct attataatat ccttctttat 60 ttgtgttact gtctctttcg tatgtacatg cttcccttcg aaccttctcc aatttcttat 120 tataaataaa ctgagtgtta tagagtgaaa cttggagaaa gtttctaaaa cttatcctaa 180 atatttctaa aaatatttca gaatttataa cacttgctaa gtatagtaat tatgcgaact 240 agaggggagg tgaatgtttc gttccattaa tgtactccat tgaagaagac gcagatcttc 300 gtgaaaaccc taacagggaa gactataacc cttgaggttg aatccatcga tacaatcgac 360 aatgtcaagg ctaagattca ggataaggaa ggtactcaat tgttaaatcc taagtcgttt 420 ttccccgcat atctttactg tgaaacataa aattggtggc tactttctag gcatccctcc 480 ggaccagcag cgtttgatat ttgctggtaa gcagcttgaa gatggacgta cgctagcaga 540 ttataatatc caaaaaaggt ctgtgtgtaa tgaaattgga taatttagat tggtttattt 600 gatagtttgt tttgcttgat attttcttca aacagagtcc actctgcacc ttgttctgag 660 gcttcgcagt gggattattg aaccttctct tatggctttg gcccggaaat acaaccagga 720 aaagatgatt tgccgcaagt aagttcgata tccacgcgtg tagtattgga atgaagtgta 780 catgttgaat ggattataga atatttatgt agtcgatcca aattattcct gatttgatat 840 tgtaaagttg aagctattgg tattttgcaa agttttgata gttcgggtag gttctatctg 900 ctgttctcct aggtcttgat cttggatgca taatgcattg ctaatatgtc agtagagtaa 960 gccaggagaa tgactgtgta gcgaaatgtc atttttttcg gtgaggtcaa ccttgtaaat 1020 ggcaattcct gttcttgttc tcacttgtaa tgcacggtga ttatctttca cctctgtatt 1080 ctgcattggt acaagagtaa tttatgtcaa ggtgatgaca tggaaaagta acctggaagg 1140 ctgtcctggt ggtcattctt agatatatga tgaccttggg tgaagttgta ttgcaggcga 1200 aaattaattt ctattagctg ctgctatcga tttgtatgta tgggagcatt gtacttagct 1260 atggaattat gatcctttac caacatatgc acatgttagc caaagaaaaa actacaaagt 1320 tacactttga ggacatggag ggacagaaac ctgctaaata ttttccttcc ccttaaacta 1380 ttaacgggct ataggtttgc tagtatagtt cttctaatat tgttttcttt ttgagctact 1440 tttgtaccat ttggtagaca tgatatggaa gctatcctgt gcaaggtagt ggctaggata 1500 tggtatgcat gatatttttc tatttgctca agtgactgtc gaacagatca gtttttaccg 1560 tccctatctc ctgaggggtt gcatgatcat tgcacaacta ttaaactttt ggtgctaaaa 1620 tgaaatcaat tcctctacat ttgcctaggc tccatcactg gtctacgcac tatgatatca 1680 tgttatattg gtttaagttg catgcctaat gagttatggt ctttatatcc tttctgattg 1740 ggtgtattta tgcattttct tttttgctgc agatgctatg cgcgtttgca cccttgtgct 1800 gtcaattgca ggaaaaagaa gtgtggccat agcaaccagg tatcgtcttg gtcaattttg 1860 ttgactgttg tgcattactg gactccatac ttaatgattc ttctgtttcc tacttttatt 1920 tcagttgagg ccaaagaaga agatcaagta aacaggtgtt tgcatttttg cagtcaagac 1980 acttcataat ttggcactct tttgtatttt atttgtttgt ttaacttcgt tctgtccatc 2040 aatgtttatt tcactatata acataagttc taaaacgtta gtacgtttgc tctactaagc 2100 tgagttttgt caagtgcaca aaaagttagg atcaagccct atgctttaaa gttcgtcatt 2160 agcggttgca atatgcatga aactacctgt taagggtaaa cattcacact tttatatgct 2220 aacctactag gagtttttct attcacataa ctcaaaatta agacctgact tttgattatg 2280 ccacatccat tttattttat tgtgattacg caaagaagct ctatatacac tgttttcttt 2340 cttgtgaact aaattacaag ctatatatcc attatcaaaa gaaagaacat cactgtgaca 2400 ttttggtaga aaggctagtg tatctctttc tcatgttatg ctaatagttt tccttgcaaa 2460 tcattttggc aagctacttc caggttctca gcacaatgga agggagaaag atcaactgtg 2520 aataaagttc ctcctattct ctgcacacaa ccttggctcc atcaatgtga gtaagaaaac 2580 atagactttt ttgttgatcg aagttctacc tgtttactcc tttgaaagta ttgatgtata 2640 tgttgagttc acaattccca ccacttagaa ttttcacatg acagatcgaa ggaatcacct 2700 gggcctacag cataccagtg ttcaggtgat cctaaggaac tgtctcctaa ttcctccatg 2760 ttccaaaact cttcttcttc cttccacctc aagtgttcaa ataatgttcc ttctcggtca 2820 cta 2823 <210> 2 <211> 1341 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solyc06g054230.2 (Ch6-5) <400> 2 ccaaaaatgg ctggctgctt tctcctatga actttcttca tctgacgttt cattattttt 60 ctgtagtttc agacttccat tgatatcaac agagttagag aatgtcagcc aaggaggagg 120 ttgaggagag tcatgcattt gttgaatgta atgggagtgc atctgtaatc aatgaaacac 180 ggcttcgagt ttatccagtt tctgagtatg actcaggcga aggtttacca tatgctcctg 240 tagattggcc aaatgtgggt gataagtggg gctggcgggc agggaaaaaa gctacaggtt 300 taggcacctt taaagataga tatctgtatc ttccgaagcg ttttcaggct ctgaaagatg 360 gaaagaaaaa tgtttttcgg agtaagattt cagttaaaaa gtatctccag tctgagtatc 420 ctgatatgga tataaaccaa ttctttgcct cattcagttg gatgattcct tcgaggcagt 480 cgtcaagctc aaaaggtttg cttcgacaag gctctttggt atatagaatg tagagattta 540 ctcggttgtt tgcatcaatc aaaaaaagaa agcattacca catcttttta ttgacctgat 600 gccaaattta ttttcttttt atttagatgt tgattttgac tcagatatga aagagaggac 660 ttcatcttca gggacgaaaa tgcagccttt actggctgac cttctcctat tagagtcatt 720 acttgtaagg ctggtaacaa aatttgtagc agtttaacag cagaaagtcc ttttctggag 780 acaatgcttt gtaatatatg ttgcagtgag cctggttttt gccaagactg ttgttgtatc 840 ctttgcttta aacctattag tttggactat gatgggtaca gtagcattcg gtgtgaagca 900 acaacaaatg gctacatatg tggacatgtt tcccatgtag agtgtgctct acgagcttac 960 atggctggga cagtcggagg aagcatcaat ttggatgcag agtatttatg tcgatgctgt 1020 gattcaagga cggatttggt tgcacatgct ctgaagcttt taaacatttg cacatccatt 1080 gcttcttacg ctgacatcga aaagattttg aatgttggca tttgtgtttt gcgtggttca 1140 cagaaaagga gtggaaaaga gttgttgcat cgtattgaat caattaaggc aaaggtatag 1200 ctaattgatg aattgtacta aatttcctta tgatgctata ttttttctat ttgaggtgta 1260 cagttatcag aatgaccaat ttgataatca tatcagctta caaaaggagt ccgcattcaa 1320 gatgcattcg tgtgtggata g 1341 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g035630.1(Ch6-1) forward primer <400> 3 ggaaatattg gttacaatcc agtg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g035630.1(Ch6-1) reverse primer <400> 4 gaccggtagt gatttgttgt attc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g051190.1(Ch6-2) forward primer <400> 5 cttcttgata ggacgacgtg atat 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g051190.1(Ch6-2) reverse primer <400> 6 gaaaaatggg tgatccgttg attg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g051210.2(Ch6-3) forward primer <400> 7 ctctttttgc cagatcttga atag 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g051210.2(Ch6-3) reverse primer <400> 8 ttgaaatttg atgctgacct atgg 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g053210.2(Ch6-4) forward primer <400> 9 gttttccttg caaatcattt tggc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g053210.2(Ch6-4) reverse primer <400> 10 gggaattgtg aactcaacat atac 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g054230.2(Ch6-5) forward primer <400> 11 ctcagaaact ggataaactc gaag 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g054230.2(Ch6-5) reverse primer <400> 12 aaaaatggct ggctgctttc tcc 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g054400.2(Ch6-6) forward primer <400> 13 cggtgatgag caggattgat aaaa 24 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc06g054400.2(Ch6-6) reverse primer <400> 14 cttcttgtgt cactttcacg tcaaaggcca agact 35 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc12g009690.1(Ch12-1) forward primer <400> 15 gttacacgaa caagcttaaa tttctagatt tatccc 36 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc12g009690.1(Ch12-1) reverse primer <400> 16 gacaggtcct tcgaattgat tac 23

Claims

서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 2563번째 염기가 T 또는 C, 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 128번째 염기가 T 또는 G인 것인 토마토 풋마름병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 2563번째 염기가 C 및 상기 서열번호 2의 128번째 염기가 G인 경우 토마토 풋마름병 저항성 토마토인 것으로 판별하는 것인, 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커 조성물.
토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10의 염기서열로 구성되는 프라이머 및 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 조성물로서,
상기 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 2563번째 염기가 C 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 128번째 염기가 G인 것인, 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는, 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 키트.
1) 토마토 시료로부터 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
3) 상기 PCR 증폭 산물에 Mse I 또는 Hinf I인 제한효소를 처리하는 단계;
4) 상기 Mse I 제한효소가 처리된 결과물의 사이즈가 116bp 및 97bp 이거나 상기 Hinf I 제한효소가 처리된 결과물의 사이즈가 204bp 일 때 토마토 풋마름병에 저항성이 있다고 판단하는 단계를 포함하는 것인 토마토 풋마름병 저항성 토마토의 판별 방법.