CN105794631A - 硬粒小麦-长穗偃麦草7e抗赤霉病双体附加系的创建方法 - Google Patents

硬粒小麦-长穗偃麦草7e抗赤霉病双体附加系的创建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于作物遗传育种领域。涉及一种硬粒小麦‑长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法，该方法是从硬粒小麦Langdon和异源六倍体小麦8801杂交自然结实的F1代的自交后代中筛选得到硬粒小麦‑长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系。通过对筛选得到的硬粒小麦‑长穗偃麦草7E双体附加系进行赤霉病抗性鉴定，结果表明7E附加系发病率低于16％，远低于亲本Langdon的发病率的平均值60.22％。说明7E染色体上含有抗赤霉病基因，本研究获得的硬粒小麦‑长穗偃麦草7E附加系在硬粒小麦品质改良的过程中可以作为新的FHB抗性种质资源以及可以进一步选育出对硬粒小麦原基因组冲击力更小的置换系、甚至小片段易位系等。

Description

硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域。具体涉及一种硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法。
背景技术
1小麦育种目标和其野生近缘种
小麦是世界播种面积最大、总产量最多和分布最广的粮食作物，是世界性的粮食作物。在我国，小麦是仅次于玉米、水稻的第三大粮食作物。硬粒小麦(Triticumdurum)又称通心粉小麦，染色体数2n＝4x＝28，染色体组型为AABB，主要优点是耐旱、耐瘠薄、蛋白质含量高、营养价值高和工艺性能好。在抗病性上，硬粒小麦抗条锈病、叶锈病、腥黑穗病及散黑穗病的能力优于普通小麦。但是，硬粒小麦易感染赤霉病、根腐病、不抗麦秆蝇。适应性和越冬性不如普通小麦(翟军2012)。小麦的近缘物种类型繁多，变异多样，具有丰富的遗传多样性，并且含有在小麦育种中具有重要利用价值的优良基因源如抗病性(董玉琛2000；曹亚萍2008)。因此通过染色体工程、基因克隆以及多种技术相结合的方法将外源染色体或染色质导入硬粒小麦背景中可以改良其遗传组成，培育出新的抗性育种材料，最终还可以利用远缘杂交的方式应用到普通小麦中去。
小麦的近缘植物泛指小麦族(Triticeae)中除小麦属以外的其他属种，小麦族中包括小麦、大麦、黑麦等重要粮食作物，另外有些种则是优良牧草。根据物种的遗传关系远近可将小麦基因源分为三级(HarlananddeWet1971)。小麦的野生近缘植物因不含A、B、D任何一个基因组被称为小麦的三级基因源(Tertiarygenepool)，小麦的野生近缘种种类繁多、变异多样、遗传基础极为丰富，它们在长期自然选择中，保留或形成了大量栽培小麦所不具备的或在人工选择条件下已经丢失的抗逆、抗病虫、优质等优良基因，是小麦遗传改良的宝贵基因资源。将控制这些优良性状的基因通过染色体工程、基因克隆以及多种技术相结合的方法将外源物种的优良基因转移到小麦背景中，改良其遗传组成，提高其对各种生物或非生物胁迫的抗、耐性，提高小麦的产量并改善小麦品质，拓宽小麦的遗传基础。
为了拓宽并利用这些有益基因，在小麦族内已进行了大量的属间杂交工作，至今小麦已与偃麦草属(Elytrigia)、冰草属(Agropyron)、黑麦属(Secale)、簇毛麦属(Haynaldia)、鹅观草属(Roegneria)、山羊草属(Aegilops)、大麦属(Hordeum)、披碱草属(Elymus)、赖草属(Leymus)、新麦草属(Psathyrostachys)、旱麦草属(Eremopyrum)等杂交成功，成功地从偃麦草属、黑麦、山羊草等外源物种向栽培小麦品种中转移抗赤霉病、锈病、白粉病和条斑病等基因，并且建立了小麦单、缺体和端体系统、小麦异附加系、置换系、小黑麦异附加系、小簇麦异附加系等的全套或部分非整倍体材料以及一些代换系和易位系(曹亚萍2008；常乐etal.2015)。
2长穗偃麦草优良特性
偃麦草属(Elytrigia.sys.Thinopyrum,sys.Lophopyrum)是禾本科小麦族多年生根茎-疏丛型草本植物，小麦的近缘属，具有抗病、抗旱、耐寒、耐盐碱、大穗、多花等许多优异性状，是小麦遗传改良中具有重要利用价值的小麦近缘植物之一。在偃麦草属中主要有四个种，即二倍体长穗偃麦草(Thinopyrumelongatum,2n＝14,EeEe)，四倍体长穗偃麦草(Thinopyrumelongatum,2n＝28,Ee1Ee1Ee2Ee2)，六倍体中间偃麦草(Thinopyrumintermedium,2n＝42,EeEeEbEbStSt)和十倍体长穗偃麦草(Thinopyrumelongatum,2n＝70,EeEeEbEbExExStStStSt)(Ceolonietal.2014；陈士强etal.2015)。二倍体长穗偃麦草Ee组染色体是组成Thinopyrum多倍体物种的基本染色体组，携带有对小麦遗传育种有益的抗盐、抗旱及许多抗病基因如抗小麦锈病基因、抗大麦黄矮病基因等许多优良特性(英加etal.2000)，因而较早地开展了小麦与长穗偃麦草的远缘杂交和回交育种工作。
Colmer(2006)和Zeng等(2013)同样利用外源物种提高了小麦的生物胁迫和非生物胁迫抗性，如耐盐性。Li等(2008)通过导入外源基因则克服了籽粒灌浆期可能遇到的影响，如高温、强日照、干旱等，同时通过和十倍体长穗偃麦草远缘杂交可以提高小麦育种中的产量和加工品质(Liuetal.2008；etal.2013)。李玉京等(1999)以中国春-长穗偃麦草二体异附加系和二体异代换系为材料，对其耐低磷营养胁迫特性进行鉴定和遗传分析，表明长穗偃麦草4E与6E染色体携带有耐低磷营养胁迫基因，其效应远远超过背景亲本中国春；相反，5E染色体携带有强烈抑制低磷胁迫的基因；同时通过等电聚焦技术将酸性磷酸酶和碱性磷酸酶基因分别定位于3E和4E染色体。马渐新等(1999)对一套小麦-长穗偃麦草二体代换系进行了条锈病抗性鉴定、抗性遗传和生化分析，表明长穗偃麦草3E上携带有新的抗小麦条锈病基因，并在小麦背景中呈显性遗传。刘登才等(2001)对小麦-长穗偃麦草二体附加系接种小麦赤霉病菌后发现，在长穗偃麦草1E上携带控制赤霉病抗性的主效基因，同时在3E、4E及6E染色体上可能有微效抗性基因存在。而另外有研究认为7E染色体具有抗赤霉病基因(Shenetal.2004)，并将该基因初步定位于7E染色体长臂上(ShenandOhm2006)。陈士强等(2012)还发现二倍体长穗偃麦草的2E和4E染色体可能具有微效抗性基因，而3E、5E和6E则可能存在易感基因，Fu等(2012)也发现其5E及6E染色体上可能存在赤霉病易感基因。小麦的赤霉病抗性比较复杂，人工鉴定结果受环境的影响较大，因此利用分子标记进行辅助选择将是有效途径。
为了进一步提高小麦抗赤霉病育种的效率及扩大抗赤种质资源范围，人们开始积极从小麦近缘物种中开拓新的赤霉病抗源，并已经成功地进行了小麦和其近缘物种的杂交，如长穗偃麦草(Th.elongatum)、粗山羊草(T.tauschii)、鹅观草(Roegneriakamoji)、纤毛鹅观草(R.ciliaris.)、大赖草(Leymusracemosus)、脆轴偃麦草(Th.junceum)、中间偃麦草(Th.intermedium)、黑麦(Secalecereale)、燕麦(Avenasativa)、簇毛麦(Haynaldiavillosa)等近缘物种(Oliveretal.2006；刘易科etal.2016)，且长穗偃麦草中有较好的抗赤霉病基因(程顺和etal.2012)。经研究，小麦与长穗偃麦草的杂种后代，无论F1代还是选育出的生产上大面积推广的品种，抗赤霉病性能都比较好，说明长穗偃麦草的抗病基因能够传递给后代，转移到普通小麦品种上来。因此，长穗偃麦草已成为改良普通小麦遗传基础、提高赤霉病抗性的重要野生近缘物种之一(王黎明等，2005)。
3长穗偃麦草在小麦育种中的应用
小麦-偃麦草属异染色体系不仅是将偃麦草属的优良基因导入普通小麦的桥梁材料，也是探讨小麦与其近缘植物亲缘关系，进行基因定位等遗传研究的材料工具，在理论研究和育种实践中都具有很重要的运用价值。长穗偃麦草作为小麦的三级基因源，向小麦转移其外源基因可在染色体基组(异附加系)、染色体(异代换系)和染色体片段(易位系)三个层次上进行。
3.1选育双二倍体
在染色体基组水平上转移外源基因主要包括合成完全双二倍体和部分双二倍体两种途径。大多数小麦-近缘物种杂种不育或高度不育，诱导合成双倍体后可以恢复其育性，因而合成小麦-近缘物种双二倍体也是向小麦转移外源优良基因的重要手段，合成的双二倍体也是转移外源优良基因的宝贵资源。双二倍体可以自发产生，也可以利用化学药剂如秋水仙素处理诱导染色体的加倍获得。近年来一些促进远缘杂种自然加倍的特殊种质如硬粒小麦DR147的发现，为双倍体的合成开辟了新的途径。
我国已育成普通小麦与长穗偃麦草、中间偃麦草、滨麦等亲缘物种的多种部分双二倍体(HanandLi1993；穆素梅etal.1996；王洪刚etal.2006)。由长穗偃麦草和小麦杂交获得的双二倍体8801、部分双二倍体-八倍体小偃麦不仅保持了偃麦草的抗病、耐旱、穗大、多花等优良特点，主要目的可以利用它可作为进一步转移外源基因的桥梁亲本，在小麦的遗传改良中具有十分重要的利用价值(何方2014)。Dvorak等(1974a；1974b)将长穗偃麦草的7对染色体全部附加到普通小麦中国春背景中，育成了双二倍体(2n＝8x＝56,AABBDDEE)和一套中国春-二倍体长穗偃麦草二体异附加系(2n＝44)，在此基础上又选育出了一套二体异代换系。
3.2选育附加系
通过远缘杂交在小麦染色体组的基础上增加一条或一对及以上携有目标基因的外源染色体，形成异附加系，是向小麦导入外源优良基因的另一途径。根据所附加外源染色体的数目，可将其分为单体、双体和多重异附加系。
异附加系可以作为利用细胞遗传学方法将外源遗传物质转移到普通小麦的基础，进一步获得外源染色体的代换系和易位系。异附加系的选育一般是将小麦-近缘物种杂种F1代，或以双倍体为母本与普通小麦回交，从回交后代中选择附加单体、双单体或多重单体，经自交或诱导单倍体选育成二体异附加系。目前己选育出附加黑麦、山羊草、类麦、簇毛麦、赖草、鹅冠草等属染色体的小麦异附加系200多个，但由于有些外源染色体如大麦的1H导入小麦后引起不育，山羊草有些种的染色体具有诱发染色体畸变的杀配子基因、有些物种的染色体能优先传递与消失等原因，成套的异附加系并不多见，只有黑麦和长穗偃麦草等六个种具有成套的异附加系。异附加系是研究物种起源与进化、染色体组亲缘关系、基因表达、基因互作、基因定位等的重要遗传材料，也是培育异代换系、易位系的基础材料。但由于双体异附加系在将外源有益基因转移进小麦的同时，也常常携带了许多不良基因，从而限制了异附加系的直接利用。因此，在小麦品种改良中，利用异附加系创造仅仅携带有目标性状的小片段染色体易位系具有重要应用价值，特别是中间插入易位，它们在遗传上比较稳定，容易通过遗传重组导入栽培品种并传递给后代。
小麦异附加系的选育途径有多种，归纳起来主要包括常规法、桥梁亲本法、双重或多重单体附加法、双二倍体回交法、单倍体法等。常规方法是选育小麦异附加系的经典方法，即在小麦与近缘植物的杂种后代中直接选择或者先选择单体异附加系，再自交选择双体异附加系(何方2014)。如果小麦与近缘物种杂交亲和性较差，可先用与双亲杂交均易成功的材料作桥梁亲本与近缘物种杂交，再按常规方法选育双体附加系，这称之为桥梁亲本法(Lupton1988；薛秀庄and吉万全1993)。Dvorak等(1980；1974)用远缘杂交的方式把长穗偃麦草和六倍体小麦杂交，得到了一系列的整条染色体附加系和端体附加系。
3.3选育异源代换系
小麦染色体被外源染色体替换后形成的品系叫异代换系。异代换系一般可以在远缘杂种的自交或回交后代中自发产生，也可采用缺体、单体与异附加系或双倍体杂交，再自交的方法有目的地产生。其中最常见和最具利用价值的是双体异代换系，即1对小麦染色体被1对外源染色体代换的类型。与异附加系相比，异代换系较为稳定，农艺性状有所改善。它不仅是转移外源优良基因的桥梁材料，也可以作为异源染色体在小麦背景中的遗传效应、异源染色体和小麦染色体间部分同源关系以及染色体组进化关系等研究的基础材料。目前己获得了涉及黑麦属、山羊草属、偃麦草属、簇毛麦属等的染色体异代换系220多个。但由于大多数异代换系中外源染色体补偿能力差或带有不利基因，只有极少数的异代换系在生产中作为品种加以利用。
小麦异代换系的选育途径可大致分为自发代换法、单体代换法、端体代换法、缺体回交法和组织培养法等。利用小麦异代换系可以进一步向小麦转移外源有益基因，培育异易位系；在进行小麦亲缘种的基因定位、外源染色体在小麦背景下的遗传特点、小麦及其亲缘种间的进化关系研究等方面，异代换系都具有十分重要的作用(冠昌etal.2002；李振声etal.1987)。但是，目前获得的绝大多数异代换系因外源染色体补偿能力差或带有不良基因，限制了其在小麦生产中的直接应用。把异代换系转育成易位系，是利用异代换系的重要方式。因此，选用遗传基础丰富、综合性状优良的小麦品种作为选育异代换系的受体材料，可以提高异代换系的利用价值。
3.4选育小片段易位系
在小麦的遗传改良中，将小麦近缘野生物种中携带优良基因的染色体片段转移到小麦染色体上，育成异源易位系，是拓宽小麦遗传基础，培育新品种或创造新种质的重要途径(王洪刚etal.2001)。
(1)通过着丝点断裂融合(自发的)创造易位系
当染色体在减数分裂过程中表现为单价体时，偶尔发生的错分裂可以导致着丝点的分裂，形成端着丝点染色体，产生的端着丝点染色体也可能重新接合成整条染色体。如果几条染色体同时发生错分裂，那么重新接合时，不同的染色体臂之间就有可能组合在一起，根据这一特性，可以通过使特定小麦染色体和异源染色体处于单价体状态而有意识的诱导易位，从而把小麦近缘物种的染色体臂导入到小麦中，获得易位系(Sears1981；张学勇1991)。
(2)利用辐射诱导产生易位系
利用辐射处理诱导易位，从小麦近缘植物中向小麦转移外源优良基因的方法应用较早。Sears(1956)首次利用X一射线照射的方法将伞穗山羊草的抗叶锈基因(L内)转移到小麦中，获得抗叶锈的易位系。此后这种方法一直是诱发染色体易位的有效方法之一，用来辐射的材料可以是小麦-近缘种杂种F1、异附加系或代换系的种子、减数分裂期或成株期花粉等。利用辐射诱导易位的优点是不论外源染色体与小麦有无同源性都可用此法。缺点是诱导的易位是随机的，所产生的易位系一般功能补偿性较差，因而必须经过大量实验评(3)控制Ph体系诱导产生易位系
减数分裂过程中染色体的配对是由遗传因素控制的，1957年日本的Okamota和1958年英国的RaephRiley和VictorChapman等首先发现在小麦5B染色体长臂上有一个抑制小麦部分同源染色体配对的显性主基因(Ph)，该基因不但能抑制A、B、D染色体组间的配对，还能抑制小麦染色体与近缘物种间的染色体配对，从而抑制遗传物质的交换和重组(梁学礼1979)。后来Mello-sapayo发现在3D染色体短臂上也存在一个配对抑制基因，其效应仅为5BL上抑制基因的一半。1979年Mcintosh将5BL和3DS上的抑制基因区分为Phl和Ph2(李淑梅etal.2007；吴兰佩1986；张晓科etal.1998)。如果Ph基因被除去或受到抑制，部分同源染色体之间就会发生配对，从而发生遗传物质的交换和重组，形成易位系。该遗传机制的发现为创造小麦异源易位提供了一条极为有效的途径。
(4)组织培养诱导产生易位系
植物种属间杂种经离体培养后能够引起染色体不稳定，使染色体产生断裂、缺失及易位等染色体结构变异，因此组织培养可以作为一种诱导手段用于诱发染色体易位，进行异源染色体片段的转移。将双倍体、异附加系或异代换系与农艺亲本杂交，F1经离体培养后再生植株就有可能从后代中选到异源易位系(Jiangetal.1993)。利用组培法诱导易位具有方法简便，效率高，易位片段小等优点，是一种很有效的异源基因转移途径。
(5)利用杀配子染色体诱导产生易位系
近年来，人们在将山羊草某些物种的基因转移到普通小麦与硬粒小麦过程中发现，有些山羊草如农林26背景中的离果山羊草的3C染色体、普通小麦中国春背景中的柱穗山羊草的2C染色体带有杀配子基因，当该基因处于半合状态或杂合状态时，不含杀配子基因的雌雄配子中的染色体会发生随机断裂，产生包括易位、缺失等染色体结构变异而导致不育(陈静2010；李政宏etal.2015)。将携带杀配子基因的异源染色体异附加系与小麦的近缘物种杂种、异附加系或异代换系杂交，利用杀配子基因诱发染色体随机断裂的特点，可以诱发小麦与近缘物种的染色体间产生易位(ENDOetal.1994)。
4小麦背景中外源物质的检测
目前人们虽然已成功地进行了小麦与许多野生近缘种属的远缘杂交，创造了一大批的异源附加系、异源代换系及易位系，但将外源遗传物质导入小麦后，除了从外部性状的变化来判断外源遗传物质进入小麦外，人们还希望早期了解外源遗传物质的进入多少、有利遗传物质的存在情况，因此非常有必要对转移到受体小麦中的外源遗传物质(目的基因或外源染色体片段)进行跟踪鉴定，避免不良性状的产生，从而在最大程度上避免远缘杂交和基因转化等基因转移方法的盲目性，提高育种效率。
4.1形态学鉴定
形态学检测是建立在特定表型性状基础上的形态标记，是检测外源遗传物质最简便、最基础的方法。主要利用植物的外部形态特征，如株高、叶色及形状、穗型和育性的变化等后代的表型特点确定是否存在外源基因。但存在数目少，多态性差，受环境影响较大，容易导致矛盾的实验结果而无法作出准确判断，因而应该结合其他方法进一步鉴定。
4.2分子标记检测
(1)基于PCR技术的分子标记
PCR技术是一种利用酶促反应对特定DNA片段进行体外扩增的技术，该技术只需非常少量(通常在ng级范围内)的DNA样品，在短时间内以样品DNA为模板合成上亿个拷贝。经过电泳分离、染色或放射自显影，即可显示出所扩增的特定DNA区段。PCR技术以短核苷酸序列作为引物，并使用一种耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)。PCR技术具有快捷、简易、灵敏等优点，在DNA标记技术的发展上起到了巨大的作用。主要有RAPD、RFLP、SCAR、SSR、RGAP、AFLP、STS等。
(2)基于反转座子的分子标记
反转录转座子是散布于基因组中的中度重复序列。根据其结构特征，反转座子又可分为带有长末端重复序列(longterminalrepeat，LTR)和非长末端重复序列(non-longterminalrepeat，non-LTR)的两个类型。LTR反转座子两端各有一正向排列的重复序列，LTR间的内部序列由1-3个开放阅读框(ORF)构成，分别编码转座所需的酶，根据它们序列相似程度和基因编码产物排列次序又可分为Ty1-copia和Ty3-gypsy两个亚族。非LTR型的反转座子根据元件长度和成分可分为长散布重复序列元件(longinterspersedrepetitiveelements，LINE)和短散布重复序列元件(shortinterspersedrepetitiveelements，SINE)。
(3)基于高通量测序的分子标记SLAF
SLAF-seq(Specific-LocusAmplifiedFragmentSequencing)是基于高通量测序技术发展起来的新技术，利用边合成边测序，具有测序成本低、通量高、速度快等优点，其测序结果可直接开发大量特异分子标记。该技术可用于单体型图谱、遗传图谱、关联性图谱、多态性图谱的构建，为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供了重要的技术保障(陈士强2013)。刘赢等(2015)通过高通量测序获得长穗偃麦草的基因序列信息，明确了小麦以及其它小麦族植物间遗传进化关系，发掘了长穗偃麦草与小麦间的突变位点，并对SNP靶向基因进行功能注释，这为长穗偃麦草基因资源在小麦遗传改良中的应用提供了理论支持。
4.3细胞学鉴定
细胞学方法是利用核型分析、组型分析和染色体分带等方法来检测外源遗传物质。染色体显带是一项借助于某些特殊的染色程序使染色体在一定部位内显现出深浅不一带纹的细胞学技术。由于特定染色体有其特定的带纹，因此显带可作为鉴别染色体组和单个染色体的手段，从而可以深入地认识染色体结构成分遗传的关系。而染色体分带是检测易于显带且特征带纹清晰可辨的外源染色体(片段)的有效手段(徐国辉2009)。但并非所有外源物种的染色质都能显示出易于区别的特征带纹，且带型会因小麦基因型不同而呈现多态性。另外，分带技术无法对不具特异性带型的染色体或染色本片段进行鉴别，尤其是小片段易位，单靠C-分带技术是无法得到满意的鉴定结果的。
在染色体数目鉴定的基础上，将普通小麦与被测系杂交，观察根尖细胞(RTC)染色体和F1花粉母细胞减数分裂中期I(PMCMI)染色体构型，可对被测系的细胞学特点作出初步判断。细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择，有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料，某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难，对实验技术的要求比较高，往往重复性不强，而且分析样本的数量有限，所揭示的外源遗传物质还是在染色体片段水平，因而在实际应用分析时具有一定的局限性，从而限制了细胞学标记的应用，必须同时结合其他的技术来鉴定小麦中的外源物质，如原位杂交技术，才能使鉴定异染色质数量、易位断点和易位点成为可能。
4.4原位杂交鉴定
原位杂交(insituhybridization,ISH)是一项利用标记的DNA或RNA探针和细胞学制片上的染色体DNA在变性和复性过程中进行杂交，通过特定检测系统，将特定序列探针的杂交位点在染色体上显示出来，从而在细胞内对外源染色体或片段或特定序列的位置进行定位(Jiangetal.1993)，是传统的细胞学与现代分子生物学相结合的产物。在小麦遗传育种研究中，可用于检测异源染色质，识别染色体和分析染色体同源性等方面的分析研究(Hanetal.2003；何方2014)。
目前用于检测小麦外源染色体的原位杂交方法按所用探针的不同可分为三类：第一类是以物种专化的重复DNA序列为探针，第二类是以单拷贝或寡拷贝的ONA序列包括用含某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPO标记为探针的原位杂交，第三类是以基因组DNA为探针的原位杂交。第一类和第二类由于探针的获得比较困难或检测的精度达不到，应用较少，目前在远缘杂交中应用最多的是以基因组总DNA为探针的原位杂交。杂交信号的检测也由原先的放射性同位素检测逐步变为生物素、地高辛或者荧光素，现在普遍应用的荧光原位杂交系统，与以上检测系统相比，其灵敏度和专一性都较好，甚至可以一次同时检测多个探针的杂交信号(Jiangetal.1993)。
发明内容
本发明的目的是提供一种硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法，是从硬粒小麦Langdon和异源六倍体小麦8801杂交自然结实的F1代的自交后代中筛选得到硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系。
本发明所述方法具体步骤如下：
(1)硬粒小麦Langdon和异源六倍体小麦8801杂交自然结实的F1代自交；(2)在F2群体中通过染色体数目检查、E基因组特异分子标记和1E-7E染色体特异分子标记，选择2n＝29且具有7E染色体的硬粒小麦-长穗偃麦草单体附加系，单株编号为F1-1-23；
(3)从F1-1-23的自交后代中选育出稳定的、2n＝30的具有7E染色体的硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系。
其中，步骤(3)的选育过程采用形态学观察、分子标记检测、染色体数目检查和基因组原位杂交方法。
在一个具体的实施例，已对F1自交后代F2-F5代采用结合形态学观察，分子标记检测，染色体数目检查和基因组原位杂交技术进行检测，得到7E双体附加系F1-1-23-2-7-21-X。目前加代到F6代，已经稳定。
所述的形态学观察具体是：在得到稳定的双体附加系材料后，在后代中进行形态学观察，我们对其进行连续两代的农艺学性状的考量，包括株型、分蘖数、成熟期、株高、穗长、每穗粒数、百粒重等。
所述的分子标记检测具体是：用如表3的13对特异分子标记对F2-F5世代的植株进行PCR检测，首先对其进行E基因组分子标记(CSMGe-1,CSMGe-2,CSMGe-3,CSMGe-4)检测，结果为阳性的单株再分别进行1E-7E染色体特异分子标记(CSM1E–CSM7E-3)检测，以确定获得的附加系附加染色体的具体来源。步骤(3)中所述的分子标记检测，只进行E基因组分子标记检测即可。
所述染色体数目检查是：对于分子标记检测为阳性的单株进行染色体数目的检查，选择染色体数目为29条的单株进行自交，从其自交后代中筛选出2n＝30的目标单株。
所述的基因组原位杂交是：对已经确定的PCR检测结果为阳性的单体附加系或者双体附加系进行细胞学检查，用地高辛标记的长穗偃麦草2X做探针，与制玻片上的外源染色体杂交，然后与荧光抗体结合，和来自于亲本Langdon的A、B组染色体在荧光显微镜下分别呈现黄绿色和红色。由此更加直观的说明外源染色体的存在及形态。
通过本发明方法选育出的7E双体附加系F1-1-23-2-7-21-X的不同株系的后代均可作为亲本与硬粒小麦D组置换系进行杂交并加以选择，获得硬粒小麦-长穗偃麦草7E(7A)、7E(7B)置换系，进一步对得到的置换系进行辐射或者和ph1b突变体进行杂交得到硬粒小麦-长穗偃麦草7E小片段易位系。
通过本发明方法选育出的所述7E双体附加系F1-1-23-2-7-21-X的不同株系的后代均可作为亲本参与抗赤霉病小麦的育种，也可作为普通小麦遗传育种的新种质。
本发明采用常规遗传育种的方法通过异源六倍体小麦8801和硬粒小麦Langdon杂交产生F1代，在F2-F5代的自交后代材料中，筛选得到了硬粒小麦-长穗偃麦草7E双体附加系(2n＝30)，并对其进行连续2年田间和温室相结合的赤霉病抗性鉴定。赤霉病抗性鉴定结果表明，7E附加系发病率低于16％，远低于亲本Langdon的发病率的平均值60.22％。说明7E染色体上含有抗赤霉病基因，本研究获得的硬粒小麦-长穗偃麦草7E附加系在硬粒小麦品质改良的过程中可以作为新的FHB抗性种质资源以及可以进一步选育出对硬粒小麦原基因组冲击力更小的置换系、甚至小片段易位系等。
附图说明
图1Langdon和8801杂交F2代的7E染色体特异分子标记(CSM7E-1)扩增结果
M:标记DL2501；1–40:Langdon和8801杂交得到的F2代群体；41:Langdon；42:长穗偃麦草(2X)；箭头所指单株为附加了一条7E染色体的单体附加系F1-1-23
图2植株F1-1-23自交后代产生的F4(a和b)和F5(c和d)代群体的分子标记扩增结果
M:标记DL2501；a&c:GSMGe-2；b&d:CSM7E-1；
1–10:含有7E染色体的F4和F5代群体；11:CS-DA7E；12:CS-DS7E/7A；13:CS-DS7E/7B；14:CS-DS7E/7D；15:Langdon；16:8801；17:长穗偃麦草(2X)
图3双体附加系的体细胞有丝分裂和花粉母细胞减数分裂传统数目检查和GISH结果
a:双体附加系根尖细胞有丝分裂中期染色体GISH检查结果，28条来自于亲本Langdon的染色体为红色，两条用箭头标注的外源染色体为黄绿色；b:双体附加系根尖细胞有丝分裂中期染色体；c:双体附加系花粉母细胞减数分裂中期I染色体GISH检查结果，共15对二价体出现，其中14对来自于亲本Langdon的染色体为红色，一对用箭头标注的外源染色体为黄绿色；标尺＝10μm
图4硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系及其亲本对赤霉病不同抗性的表现
a:硬粒小麦Langdon，箭头所指处以上全部表现为感染赤霉病；b:DU-DA7E，箭头所指处为赤霉病感染的小穗，其余小穗无明显感病表型；c:8801，箭头所指处为赤霉病感染的小穗，其余小穗无明显感病表型
具体实施方式
实施例1实验材料
本研究所用材料包括：二倍体长穗偃麦草(Thinopyrumelongatum,2n＝14,EeEe)，硬粒小麦Langdon(TriticumturgidumL.ssp.durum,2n＝4x＝28；AABB)，硬粒小麦和四倍体长穗偃麦草(Thinopyrumelongatum,2n＝28,Ee1Ee1Ee2Ee2)杂交得到的部分双二倍体小麦8801，其中Ee1Ee2被认为是同源的(Guoetal.2015；Dvovrak1981)。普通小麦中国春(ChineseSpring)，中国春7E附加系及置换系。以上材料均由加拿大农业部的Dr.Fedak惠赠；抗赤霉病对照苏麦3号，以及易感赤霉病对照安农8455，由江苏省里下河地区农业科学研究所程顺和院士提供。本实验保存。
本研究与加拿大农业部渥太华研究发展中心Dr.Fedak进行合作，F1代杂交种的获得过程是在加拿大农业部渥太华研究发展中心Dr.Fedak实验室完成，得到F1材料的过程中没有进行胚拯救和任何激素添加。F2-F5代材料均种植在扬州大学小麦试验田中，为自交产生。我们进行细胞学检查、分子标记鉴定和培育更高世代的材料，同时进行代换系的选育。
实施例2基因组DNA的提取
供试材料生长至两叶一心期，应用Sharp等(1989)提出，经Devos等(1992)改进的SDS酚-氯仿法提取叶片DNA。具体步骤如下：
(1)将大约0.2g叶片剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用筷子快速捣碎至粉末状；
(2)向离心管中加入700μl的缓冲液A，轻轻充分混匀后，65℃水浴锅中水浴30min(每5min上下颠倒混匀一次)；
(3)将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿(各350μl)，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；
(4)12000rpm离心10min，将上清液吸取到一新的离心管中；
(5)加入相同体积的氯仿(约700μl)，充分混匀，抽提5min；
(6)12000rpm离心10min，吸取上清液到一新的1.5ml离心管中；
(7)加约0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置30min，可见白色絮状沉淀；
(8)12000rpm离心10min，弃去上清液；
(9)加500μl的70％乙醇洗涤两次，每次2～3min，最后弃去乙醇在室温下晾干；
(10)加20μl的TER溶解，37℃温浴1h，-20℃保存备用。
实施例3长穗偃麦草E染色体特异分子标记检测
本发明一共用到13对长穗偃麦草基因组或染色体特异分子标记，均由本实验室人员发展(陈士强etal.2013；Chenetal.2013；秦树文etal.2014)。用这些特异分子标记对F2-F5世代的植株进行PCR(Polymerasechainreaction)检测，PCR扩增体系为25μl。PCR扩增结果条带的有无即表明是否含有本分子标记所在的染色体。图1为长穗偃麦草7E染色体特异分子标记扩增结果，箭头所指单株为我们选择继续进行自交并期望从其自交后代中得到双体7E附加系的F2植株F1-1-23，图1中其他有扩增条带的单株则表示最少附加了一条7E染色体。
我们从F2代群体中筛选出的7E单体附加系F1-1-23连续自交产生F3-F5代，在每一世代中结合分子标记和细胞学检测技术选择一株单株进行自交加代，以期得到表型一致和减数分裂稳定的双体附加系。我们从F4代中筛选获得7E双体附加系(2n＝30,AABB7E7E)群体。图2分别为F3代植株F1-1-23-2自交得到的F4代群体的分子标记检测结果和F4代植株F1-1-23-2-7自交得到的F5代群体的分子标记检测结果。
PCR检测的体系和程序见表1和表2，用于筛选的分子标记见表3。
表1.PCR反应体系
表2.PCR反应程序
表3.13对长穗偃麦草E染色体特异引物序列
实施例4染色体数目检查
对于分子标记检测为阳性的单株进行染色体数目的检查，步骤如下：
(1)将种子发芽，待根尖长至0.5cm左右时放入4℃冰箱黑暗处理1-2天后，拿出放于室温下长至根尖长2～3cm左右时(1天左右)切下长约0.5mm的根尖。
(2)将根尖放入1.5ml指形管中，加满水置于冰中24h。使细胞分裂同步化，染色体固缩，便于染色体数目检查。
(3)把根尖放到另一加入1ml卡诺固定液(无水乙醇3:1醋酸)的指形管中。
(4)制片前，用清水在培养皿中将根尖冲洗2次。
(5)把根尖放入加有INHcl的指形管中60℃分解10min。
(6)将根尖取出，用清水冲洗2次，取根尖1mm处的分生区，加入到含有50ul纤维素酶(2％)和50ul果胶酶(6％)的指形管中37℃酶解15～20min。
注：此处处理的时间不宜过长，否则染色体边缘会变的模糊不清。
(7)取根尖放于清水中，冲洗后放到载玻片上，加适量45％冰醋酸，用镊子压碎，然后加盖玻片，然后用显微镜观察。
(8)将染色体形态正常，分散较好的制片放进液氮中冷冻，取出并用解剖针迅速揭掉盖玻片，然后将片子在75％、85％、100％的乙醇中分别放置5分钟脱水，放入-20℃冰箱备用(超低温冰箱可长期保存)。
花粉母细胞数目检查则取处在减数分裂时期的幼穗，将其固定在卡诺固定液中24h后转移至70％酒精中保存，压片前用45％醋酸浸泡1-2min，用2％醋酸洋红染色压片，镜检，拍照。
在F2代中获得目标单体附加系之后，将其自交获得的F3代群体中，理论上染色体数目有三种可能，2n＝28，外源染色体丢失；2n＝29，外源染色体仍呈单体保留，但其后代不稳定；2n＝30，外源染色体加倍呈双体状态出现，在细胞学上稳定。
实施例5基因组原位杂交鉴定
(一)探针的标记
将经过纯化的供试材料的长穗偃麦草2X总基因组DNA，通过缺刻平移法进行标记。本研究采用地高辛标记方法标记探针。
1.将1ug模板DNA(长穗偃麦草2X)溶解于16ul灭菌去离子水中，或者汲取一定量(ul)的已知浓度DNA，使DNA质量相当于1ug。
2.按总体积20ul，加4ulDig-NicktranslationMix，混匀，简单离心一下。
3.15℃反应90min。
4.加1ul0.5MEDTA(pH8.0)，终止反应，65℃，反应10min。
5.-20℃冰箱保存。
(二)利用试剂盒进行标记探针的检测
1.取1ul对照Dig-DNA(已经标记上探针的DNA，即为阳性对照)和标记DNA(长穗偃麦草2X)点在杂交膜(10X3cm，依探针的数量决定杂交膜大小)，室温干燥后80℃半小时以上进行固定。
2.将杂交膜放在培养皿中，加入10ml洗涤液(Washingbuffer)，室温洗涤10分钟，可慢速摇。
3.加50ml封阻工作液(Blockingsolution)洗涤，2次，各15分钟。
4.10ml抗体反应液(Anti-bodysolution)中洗涤30分钟。
5.10-20mlWashingbuffer中洗涤2次，每次15分钟。
6.20mlDetectionbuffer中和平衡5分钟。
7.10ml新鲜配置的变色基质液(colorsubstratesolution)中进行染色反应(黑暗，不要摇晃)，几分钟至16小时，中途进行观察颜色，以出现颜色即结束。将杂交膜放入50Ml的双蒸水中5分钟，取出晾干。
(三)荧光原位杂交步骤
1.将在低温冰箱的玻片拿出，室温下无水乙醇浸泡30min-2h，晾干。
2.配制杂交液组分(40ul)，冰上操作(表4)。
表4杂交液配方
3.将晾干的玻片置于70％的甲酰胺中，70℃水浴锅中变性70S，立即拿到70％、90％、100％酒精中，-20℃依次脱水5min。
4.气干，滴加杂交液，盖上盖玻片，37℃温浴过夜杂交。
5.按表5进行洗涤。
表5：玻片洗脱方法
6.玻片上加50ulAnti-Dig-Rhodamine-Fab工作液(浓度1ug/ml，取2ul母液加入198ul1％blockingsolution，blockingsolution用马来酸缓冲液配制)，盖上盖玻片，置37℃湿盒中，温浴60min。(此步以后要求在暗处操作)
7.取出玻片室温1×TNT洗脱3次，每次5min，置于暗处晾干。
8.滴加10ulDAPI，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。
在F3代中稳定的双体附加系被选择继续自交以便在F4、F5代中产生稳定的双体附加系群体。基因组原位杂交结果显示本研究得到的硬粒小麦-长穗偃麦草7E双体附加系在根尖细胞有丝分裂中期染色体数目为30条，2条外源附加(图3a,3b)；在花粉母细胞减数分裂中期则呈现为15对交叉的二价体，其中14对来自于硬粒小麦Langdon，1对来自于二倍体长穗偃麦草(图3c)。结合染色体特异分子标记检测和基因组原位杂交鉴定，我们得到了可以稳定遗传的硬粒小麦-长穗偃麦草7E双体附加系(DU-DA7E)。
实施例6抗赤霉病鉴定
本研究采用单花滴注法接种鉴定含有7E染色体的双体附加系及两个亲本Langdon和部分双二倍体8801(Hanetal.2003)，还有两个应用较广的对照材料：安农8455作为易感病对照，苏麦3号作为抗性对照。
在开花期，每个材料取3个穗子，3组重复。取自上而下第5小穗的左基部小花作为接种单元，进行接种10μl(50,000孢子.ml-1)赤霉菌分生孢子悬浮液，然后套袋高强度保湿48h后将袋子取下(Cainongetal.2015；Guoetal.2015)，接种后21d后统计发病情况(TypeII)，病小穗率作为抗赤霉病评价依据(Zengetal.2013)。
利用SPSS11.5软件对所获得的数据进行统计分析。对连续两年得到的数据进行T测验，运用单因素方差分析(One-wayANOVA)法分析病小穗率，即赤霉病感染严重度，最小显著差异来对比分析不同材料之间的抗赤霉病差异显著性(Fuetal.2012)。选择具有赤霉病抗性的单株，单株收获后种植，通过自交以获取硬粒小麦-长穗偃麦草抗赤霉病附加系稳定材料。
在得到稳定可育的硬粒小麦-长穗偃麦草7E双体附加系之后，我们在连续的两年时间里对其进行了抗赤霉病鉴定。在抗性植株中，菌种浸染被严格控制在接种的小穗中，不沿穗子向上方下方蔓延(图4c)。而在易感植株中，接种21天后调查实验结果显示，菌种浸染会沿着穗茎从接种小穗蔓延至大半个甚至整个穗部。
统计各接种穗的病小穗率作为评价抗赤霉病的依据。结果显示，7E双体附加系连续两年两地的病小穗率平均值分别为8.73％和11.59％(范围在0-16％之间)，而亲本Langdon的病小穗率的平均值则达到了47.07％和86.54％(范围在25％-100％之间)，另一抗性亲本8801的病小穗率的平均值仅为3.07％和6.15％。同期的易感对照安农8455表现出平均值为43.92％的感病率，易感对照Roblin表现出高达96.74％的感病率，而抗性对照苏麦3号则很好地维持了平均4.99％和6.15％的感染率(表6)。单因素方差分析显示，7E双体附加系在连续的两年里分别与亲本对照表现出了显著性差异和极显著性差异，表明赤霉病抗性基因来自二倍体长穗偃麦草。
表6.7E双体附加系的赤霉病抗性鉴定(2014和2015)
*表示P<0.05，有显著性差异；**表示P<0.01，有极显著性差异；Langdon作为对照
实施例7农艺学形状分析
从F4代中得到稳定可育的硬粒小麦-长穗偃麦草7E双体附加系群体之后，我们对其进行连续两代的农艺学性状的考量，包括株型、分蘖数、成熟期、株高、穗长、每穗粒数、百粒重等。其中穗部(接种后的穗部)和籽粒形态见图4。其他农艺学性状见表7。在大田种植的条件下，双体附加系的株型介于两亲本之间，叶窄，叶色浅，籽粒形态和芒长状况接近于亲本Langdon，小穗数Langdon基本一致，但是穗长稍长，即小穗之间排列没有那么紧致。7E附加系的抽穗期比Langdon晚10天左右，但早于8801一周左右，也是介于两亲本之间。而该附加系的百粒重约为4.05g，不及亲本Langdon(百粒重＝5.32g)饱满，但优于8801。
表7硬粒小麦-长穗偃麦草7E双体附加系和其亲本的农艺学性状

Claims (3)

1.一种硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法，其特征在于，是从硬粒小麦Langdon和异源六倍体小麦8801杂交自然结实的F1代的自交后代中筛选得到硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系。
2.根据权利要求1所述的硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)硬粒小麦Langdon和异源六倍体小麦8801杂交自然结实的F1代自交；(2)在F2群体中通过染色体数目检查、E基因组特异分子标记和1E-7E染色体特异分子标记，选择2n＝29且具有7E染色体的硬粒小麦-长穗偃麦草单体附加系，单株编号为F1-1-23；
(3)从F1-1-23的自交后代中选育出稳定的、2n＝30的具有7E染色体的硬粒小麦-长穗偃麦草双体附加系。
3.根据权利要求2所述的硬粒小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病双体附加系的创建方法，其特征在于，步骤(3)的选育过程采用形态学观察、分子标记检测、染色体数目检查和基因组原位杂交相结合的方法。
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