CN105821135B - 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用。通过苗期对资源霜霉病的抗性鉴定筛选的原则和现有技术基础，通过选用高抗霜霉病的甜瓜资源PI438685为高抗资源，以高抗资源PI438685与感病农家品种“卡拉克赛”构建甜瓜霜霉病抗感F2代群体，利用公知的遗传软件，找到与PI438685抗霜霉病基因连锁的分子标记SSR‑666230，该标记与抗病基因的遗传距离为2.66cM。通过提取甜瓜单个植株基因组DNA，用SSR‑666230这个标记进行PCR扩增，检测是否只有唯一特定230bp特异性条带出现，如只有这条特异性条带出现，则预测此甜瓜单株抗霜霉病，达到选育抗霜霉病品系过程缩短育种周期、提高选择准确率良好的技术效果，具有广泛的实用价值。
Description
发明领域
本发明涉及农业生物技术领域。具体的说，本发明涉及与甜瓜抗霜霉病新基因紧密连锁的分子标记及应用的技术领域。
背景技术
甜瓜是一种重要的经济作物，我国甜瓜的种植面积和产量均居世界第一。甜瓜霜霉病[Pseudoperonospora cubensis(Berk.etCurt.)Rostov.]在高温高湿的条件下，流行迅速、危害严重、防治困难，对甜瓜的产量、果实含糖量和商品率都造成了直接的影响，是一种毁灭性的病害。化学防治霜霉病不仅效率低，还易引起环境污染，而培育抗病品种是防治甜瓜霜霉病危害的最安全、有效而且节约成本的措施之一。
通常利用常规育种的方法也能得到一些抗性好的优良品种，常规方法选育抗病育种材料时是采用苗期人工接种鉴定，根据植株的表型抗感特征进行筛选，有时会因为接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率，难以准确、快速地筛选出具有抗病基因的个体植株。为了准确、快速地筛选出具有抗病基因的个体植株，近几年发展起来的分子标记辅助育种技术，通过分子标记辅助选择可以将传统的表型选择转变为直接选择基因型，在早代就可以对抗病植株进行选择，从降低成本、提高选择等方面都具有重要的意义。迄今为止，已知的甜瓜抗霜霉病基因有5个Pc-1、Pc-2、Pc-3、Pc-4、Pc-5，且在抗源抗性遗传上存在一定的歧义，Thomas等认为自交系MR-1的抗性是由2个不完全显性基因控制，并将其命名为Pc-1和Pc-2；Cohen等通过抗病品种PI124111与感病品种WI998的杂交后代抗性研究，认为PI124111的抗性是由2个部分显性基因控制，而且这一结论在PI124111×Ananas-Yokneam中重新得到了证实；Epinat等用3个抗病品种PI414723、MR-1和PI124112与感病品种Vedrantais杂交研究显示，PI414723的抗性是由1个单显性基因控制，而MR-1和PIl241l2的抗性则是由寡基因控制，并认为这些基因具有不完全显性，国内杨柳燕等通过高抗材料DM3和高感霜霉病材料DF4构建F2分离群体与BC1回交群体，对抗源DM3进行遗传规律分析，认为DM3的抗性由一对隐性基因控制。有关抗源的分子标记研究仅仅中国农业科学院郑州果树所分别对抗亲DM3和PI414723进行了报道，并找到了与之连锁的1个SRAP标记和3个SSR标记，但是遗传距离太远，在分子标记辅助育种上难以应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中抗性基因遗传存在歧义、现有分子标记研究的不足的情况下，发现了并利用新抗源PI438685，并找到了与甜瓜抗霜霉病基因连锁的分子标记。克服了现有技术在选育稳定甜瓜霜霉病抗病品系难度较大、周期较长的缺陷，为甜瓜的霜霉病抗病育种提供分子标记辅助选择的技术，从而降低成本、提高选择效率，为快速培育优良抗霜霉病甜瓜品种奠定了基础。
本发明通过以下技术方案实现的：
通过苗期对资源霜霉病的抗性鉴定筛选的原则和现有技术基础，选用高抗霜霉病的甜瓜资源PI438685为高抗资源，以高抗资源PI438685与感病农家品种“卡拉克赛”构建甜瓜霜霉病抗感F2代群体，利用公知的遗传软件，找到与PI438685抗霜霉病基因连锁的分子标记SSR-666230，通过提取甜瓜单个植株基因组DNA，用SSR-666230这个标记进行PCR扩增，检测是否有唯一的230bp特异性条带出现，如只有这条特异性条带出现，则预测此甜瓜单株抗霜霉病，达到选育抗霜霉病品系过程缩短育种周期、提高选择准确率良好的技术效果。
本发明具体提供了一种与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记，包括以下步骤：
(1)以感病农家品种“卡拉克赛”为母本，抗病资源PI438685为父本进行杂交，得到杂种F1。
(2)由杂种F1自花授粉获得F2代群体，F1与“卡拉克赛”杂交获得回交群体BCS，F1与PI438685杂交获得回交群体BCr。
(3)分别在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F1、BCS、BCr和F2进行霜霉病抗病性鉴定。
霜霉病菌接种液的配备：从田间采集自然发病的早期病叶，用软毛刷刷取叶背面的孢子囊，置于盛有无菌水的烧杯中，用常见的点接法接种于感病品种的子叶上，之后放入光照培养箱进行扩繁，待子叶背面长出大片黑色霉层后，再用软毛刷刷取叶背面的孢子囊，置于盛有无菌水的烧杯中，搅拌均匀后用血球计数板计数分生孢子数，最终浓度为5×103个/ml孢子。
接种：分别选用PI438685、“卡拉克赛”和F1各40粒，BCr和BCs各60粒，200粒F2播种于常见的大棚内的消毒营养钵中，待第2片真叶完全展开时，采用喷雾法进行接种，接种浓度为5×103个/mL，将配制好的霜霉病菌接种液均匀喷于整株叶面，接种后黑暗保湿48小时，控制温度夜间20℃白天25℃，相对湿度90％以上。
根据在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F1、BCS、BCr和F2进行抗病性鉴定结果：甜瓜抗霜霉病资源PI438685携带霜霉病抗性基因，抗性基因表现为隐性遗传，PI438685全部抗病，“卡拉克赛”全部感病，F1、BCS全部感病，BCr抗感比接近1：1，F2中抗感比接近1：3，表明抗源PI438685抗性基因为单基因隐性。
(4)抗感基因池的构建：F2代选取抗病和感病的单株各5株，等量基因组DNA分别混合构建抗感基因池；具体先选取表现型为0级抗病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建抗病基因混合池，再选取表现型感病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建感病基因混合池，抗感池最终浓度100ng/mL。
(5)利用公知引物公布的信息，分别以抗感基因池为模板进行PCR扩增，经过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，初步筛选出在抗、感基因池间存在多态性的SSR引物18对，经过几次重复实验，只有3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699在抗感基因池之间能稳定扩增出多态性条带。
(6)通过对已获得3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699做进一步验证；以抗病资源PI438685、感病自交系“卡拉克赛”、F1以及用于构建抗感基因池的5个抗病F2单株和5个感病F2单株为模板进行PCR验证，最终引物SSR-666扩增稳定，重复性好，在抗亲、抗病基因池和抗病单株上均能扩增出230bp的片段，在感亲、感病基因池和感病单株上没有出现这条特异性条带，由此推断引物SSR-666可能与抗源PI438685的抗霜霉病基因存在连锁关系，命名SSR-666230。
(7)根据已获得的分子标记SSR-666230，对F2代群体单株扩增检测，并进行遗传连锁分析；用遗传软件进行遗传连锁性分析，以3.0为最小LOD阈值，确定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因与分子标记SSR-666230紧密连锁，遗传连锁距离为2.66cM。
本发明获得3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699其引物序列为：
进一步，本发明提供与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记SSR-666230的应用，通过将分子标记SSR-666230用于甜瓜品种或品系的基因型检测，用于判断该品种或品系是否抗甜瓜霜霉病，包括以下步骤：
(1)以抗病资源PI438685与其他甜瓜杂交并繁衍至F2代以上。
(2)对通过步骤(1)获得的甜瓜单株提取基因组DNA，用SSR-666230这个标记进行PCR扩增，检测是否只有一条唯一230bp特异性条带出现，如只有这条特异性条带出现，则预测甜瓜植株抗霜霉病。
本发明采用的病情调查，即采用常见的调查病害情况，分级鉴定标准方法参照常见的翁祖信等(1989)的抗性分级标准并做适当调整，以叶片背面霉层的覆盖面积为统计标准，将病害0级、1级和2级定为抗病，病害3级、4级和5级定为感病，具体情况如下：
病情调查：经过10-14d后调查病害情况，根据甜瓜病斑占叶面积大小不同，将病害划分为0-5个等级，并根据病害分级情况，将分级数转换为单个植株的抗病或感病表现型。
具体分级标准如下：
0级无任何病症；
1级病斑面积占整个叶片面积的＜1/10；
2级病斑面积占整个叶片面积的1/10-1/4；
3级病斑面积占整个叶片面积的1/4-1/2；
4级病斑面积占整个叶片面积的1/2-3/4；
5级叶上病斑基本布满，病斑面积占整个叶片面积的＞3/4。
F2代抗感基因池的构建取抗病(0级)和感病(5级)的F2代单株各5株等量的DNA，分别混合构建抗感基因池。
本发明对引物进行SSR扩增筛选中，采用参照国际葫芦科作物网站(ICuGI)公布的信息，通过合成1090对引物，除掉无扩增产物及扩增产物有拖尾现象的引物以外，有878对SSR引物能扩增出有效条带，利用抗感基因池对878对引物进行SSR扩增筛选后，只有3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699在抗感基因池之间扩增出稳定的多态性条带。
本发明根据已获得的分子标记SSR-666230，对F2代群体单株扩增检测，并进行遗传连锁分析：播种200穴种子，出苗197株，其中病级数为0-2级有53株，表现为抗病；病级数为3-5级有144株，表现为感病；在144株感病植株中，90株扩增出抗病和感病2条多态性条带，46株扩增出感病多态性条带，无扩增条带6株，2株只扩增出抗病多态性条带，即发生重组；在53株抗病植株中，48株只扩增出抗病多态性条带，0株扩增出感病多态性条带，无扩增条带2株，3株扩增出感病多态性条带，即表现重组。利用常见的遗传软件进行遗传连锁性分析，以3.0为最小LOD阈值，确定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因与分子标记SSR-666230紧密连锁，遗传连锁距离为2.66cM。
本发明选用的遗传软件优先采用公知的QTLIciMapping遗传软件。
本发明所提供的与甜瓜PI438685抗霜霉病基因连锁的分子标记SSR-666230中，用引物SSR-666扩增甜瓜霜霉病抗源PI438685的DNA，只扩增出唯一1条长度为230bp特异性的条带，表明携带抗病基因。
本发明涉及到的各种遗传资源都可以通过购买途径或赠予途径可以获得。
本发明中所选用的新抗源PI438685来源于美国农业部国家植物种质资源体系(USDANPGS)，现新疆农业科学院哈密瓜中心保存，抗源PI438685材料本领域普通技术人员可以通过引进途径获得。
本发明中所选用的农家品种“卡拉克赛”，来源于新疆农业科学院哈密瓜研究中心，新疆种子市场可购买获得。
本发明中所选用的F1，来源于抗病材料与感病自交系杂交获得，即通过以PI438685父本，“卡拉克赛”为母本，通过常见的杂交技术手段获得，本领域普通技术人员通过常规杂交途径可以获得。
本发明中所选用的F2，来源于F1自交产生，本领域普通技术人员通过常规自交途径可以获得。
本发明以PI438685及其衍生品种或品系为父本或母本与其它甜瓜杂交并繁衍至F2代以上。所述PI438685及其衍生品种或品系，是指以PI438685为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或用别的物理或化学方法杂交诱导单倍体，再用秋水仙素及其它植物染色体加倍试剂加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的甜瓜品种或品系，这些技术手段均为本领域普通技术人员所熟知。
本发明筛选用的SSR引物的序列信息来自本实验室开发和ICuGI已公开发表(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：
(1)通过本发明首次获得与甜瓜PI438685抗霜霉病基因连锁的SSR分子标记SSR-666230。
(2)通过本发明可以预测甜瓜植株的霜霉病抗性，快速筛选抗病品种或品系用于甜瓜育种；检测抗病基因方便快速，而且不受环境影响。
(3)通过本发明提供的分子标记，辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交回交建立群体，而且要对群体中霜霉病抗性进行单株选择。对甜瓜霜霉病进行苗期人工接种鉴定，因接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率和准确率。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过SSR-666标记，只需检测是否只有唯一1条230bp的特异性条带，即可鉴定出是否抗霜霉病，在苗期即能鉴定出抗霜霉病的抗病单株，淘汰其它感病单株，不仅节约生产成本而且大大提高抗霜霉病甜瓜的选择效率。
附图简要说明
图1显示为引物SSR-666对双亲、F1、构建抗感基因池及抗病单株和感病单株的扩增检测，图中：M为LadderDNA，1：PI438685，2：F1，3：“卡拉克赛”，4：抗池，5：感池，R：抗病单株，S：感病单株。
图2显示为引物SSR-666对F2单株的扩增检测图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中设备和材料有：TC-512型PCR扩增仪(英国Techne公司)、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪电源(北京六一生物科技有限公司)、JY-SPE型电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)、JY04S-3C型数码凝胶成像仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，SSR引物、Taq酶、PCR反应试剂盒及其它试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
本发明中涉及到的育种材料包括：甜瓜抗霜霉病资源PI438685，经遗传规律研究分析PI438685携带霜霉病抗性基因，抗性基因表现为隐性遗传，抗源PI438685引自美国农业部国家植物种质资源体系，现新疆农业科学院哈密瓜中心保存，抗源PI438685材料本领域普通技术人员可以通过引进途径获得。甜瓜农家品种“卡拉克赛”，为本发明中所选用的常见农家品种“卡拉克赛”，为新疆厚皮甜瓜，易感霜霉病，来源于新疆农业科学院哈密瓜研究中心，新疆种子市场可购买获得。
本发明中，6％聚丙烯凝胶：30％聚丙烯酰胺(29:1)24mL，10×TBE8mL，双蒸水40mL，APS650μL，TEMED80μL。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记
一种与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记具体包括以下步骤：
(1)以感病农家品种“卡拉克赛”为母本，抗病资源PI438685为父本进行杂交，得到杂种F1。
(2)由杂种F1自花授粉获得F2代群体，F1与“卡拉克赛”杂交获得回交群体BCS，F1与PI438685杂交获得回交群体BCr。
(3)分别在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F1、BCS、BCr和F2进行霜霉病抗病性鉴定。
霜霉病菌接种液的配备：从田间采集自然发病的早期病叶，用软毛刷刷取叶背面的孢子囊，置于盛有无菌水的烧杯中，用常见的点接法接种于感病品种的子叶上，之后放入光照培养箱进行扩繁，待子叶背面长出大片黑色霉层后，再用软毛刷刷取叶背面的孢子囊，置于盛有无菌水的烧杯中，搅拌均匀后用血球计数板计数分生孢子数，最终浓度为5×103个/ml孢子。
接种：分别选用PI438685、“卡拉克赛”和F1各40粒，BCr和BCs各60粒，200粒F2播种于常见的大棚内的消毒营养钵中，待第2片真叶完全展开时，采用喷雾法进行接种，接种浓度为5×103个/mL，将配制好的霜霉病菌接种菌液均匀喷于整株叶面，接种后黑暗保湿48小时，控制温度夜间20℃白天25℃，相对湿度90％以上。
根据在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F1、BCS、BCr和F2进行抗病性鉴定结果：甜瓜抗霜霉病资源PI438685携带霜霉病抗性基因，抗性基因表现为隐性遗传，PI438685全部抗病，“卡拉克赛”全部感病，F1、BCS全部感病，BCr抗感比接近1：1，F2中抗感比接近1：3，表明抗源PI438685抗性基因为单基因隐性。
(4)F2代抗感基因池的构建取抗病和感病的F2代单株各5株等量的DNA，分别混合构建抗感基因池；具体先选取表现型为0级抗病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建抗病基因混合池，再选取表现型感病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建感病基因混合池，抗感池最终浓度100ng/mL。
(5)利用公知引物公布的信息，除掉无扩增产物及扩增产物有拖尾现象的引物以外，通过对SSR引物能扩增出有效条带，利用抗感基因池对引物进行SSR扩增筛选后，只有3对引物在抗感基因池之间扩增出稳定的多态性条带。
(6)通过对已获得3对引物SSR-666、SSR-689和SSR699做进一步验证；以抗病资源PI438685、感病自交系“卡拉克赛”、F1以及用于构建抗感基因池的5个抗病F2单株和5个感病F2单株为模板进行PCR验证，最终引物SSR-666扩增稳定，重复性好，在抗亲、抗病基因池和抗病单株上均能扩增出230bp的片段，在感亲、感病基因池和感病单株上没有出现这条特异性条带，由此推断引物SSR-666可能与抗源PI438685的抗霜霉病基因存在连锁关系，命名SSR-666230。
(7)根据已获得的分子标记SSR-666230，对F2代群体单株扩增检测，并进行遗传连锁分析；用公用的遗传软件QTLIciMapping进行遗传连锁性分析，以3.0为最小LOD阈值，确定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因与分子标记SSR-666230紧密连锁，遗传连锁距离为2.66cM。
本发明获得3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699其引物序列为：
实施例二：与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记SSR-666230的应用
本发明提供与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记SSR-666230的应用，通过将分子标记SSR-666230用于甜瓜品种或品系的基因型检测，用于判断该品种或品系是否抗甜瓜霜霉病，包括以下步骤：
(1)以抗病资源PI438685与其他甜瓜杂交并繁衍至F2代以上。
(2)对通过步骤(1)获得的甜瓜单株提取基因组DNA，用SSR-666230这个标记进行PCR扩增，检测是否只有唯一的230bp特异性条带出现，如只有这条特异性条带出现，则预测甜瓜植株抗霜霉病。
实施例三：与甜瓜抗霜霉病基因连锁的SSR分子标记SSR-666230的获得。
(1)将抗病材料PI438685为父本和新疆厚皮甜瓜“卡拉克赛”为母本进行杂交获得F1，F1自交产生F2，F1与PI438685杂交得到BCr，F1与“卡拉克赛”杂交得到BCs。通过对双亲、F1、F2、BCr、BCs进行人工接种并统计各个单株的发病情况：BCs、F1和“卡拉克赛”全部表现感病，PI438685表现抗病，BCr中抗病与感病比例约等于1：1，F2代分离群体统计表明，197株群体中，53株表现抗病，144株表现感病，抗感比符合1:3，所以确定PI438685抗霜霉病基因为单基因隐性。
(2)接种霜霉病和病害分级：采用分生孢子悬浮液喷雾接种和6级病害分级的方法，用微型喷雾器喷洒孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度为5×103个·mL-1，喷到植株叶片开始滴水为止；接种后用小拱棚保湿，相对湿度90％以上，3d后揭开小拱棚，7d后调查统计病情。根据植株茎部病害进行分级并记录个体抗感表型。
0级无任何病症；
1级病斑面积占整个叶片面积的＜1/10；
2级病斑面积占整个叶片面积的1/10-1/4；
3级病斑面积占整个叶片面积的1/4-1/2；
4级病斑面积占整个叶片面积的1/2-3/4；
5级叶上病斑基本布满，病斑面积占整个叶片面积的＞3/4；
上述采用的鉴定方法参照常见的翁祖信等(1989)的抗性分级标准，以叶片背面霉层的覆盖面积为统计标准。病害级别为0、1和2的个体记录为抗病，病害级别为3、4和5的个体记录为感病。
(3)基因组DNA的提取和DNA池的构建：基因组DNA提取采用CTAB法。利用Q3000UVDNAAnalizer测定F2单株DNA浓度，利用BSA法取5个抗病单株和5个感病单株的DNA等量混合，构建成抗感池用于SSR引物的多态性筛选；用于筛选多态性的引物序列见ICuGI网站http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/misc/download.cgi。
(4)SSR-PCR反应体系为：5×PCR反应液4μL；10mmol/mL正向和反向引物各)1.0μL；模板DNA(30ng·μL-1)1.0μL；ddH20 13μL，共20μLPCR扩增在TC-512扩增仪(TECHNE)上进行，反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行35个循环，在72℃下继续延伸10min，4℃保存。
(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：取10μLPCR反应产物与1.5μL嗅酚蓝(0.25％)混合，点样于6％聚丙烯酰胺凝胶中，以1×TBE为电泳缓冲液，在120V稳定电压下电泳1.5h左右。用JY04S-3C数码凝胶成像仪拍照片。
(6)连锁性分析：利用QTLIciMapping软件对F2代分离群体单株的标记和抗性表现数据进行遗传连锁分析，并利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)，采用QTLIciMapping软件对获得的SSR标记和抗病基因之间的遗传关系进行连锁分析，结果表明：该标记与抗性基因存在连锁关系，其遗传连锁距离为2.66cM，定名为SSR-666230。
实施例四：引物SSR-666对双亲的扩增检测
以双亲PI438685和“卡拉克赛”的基因组DNA为模板，用引物SSR-666进行扩增，SSR-PCR反应体系为：5×PCR反应液4μL；10mmol/mL正向和反向引物各1.0μL；模板DNA(30ng·μL-1)1.0μL；ddH20 13μL，共20μL。PCR扩增在TC-512扩增仪(TECHNE)上进行，反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行35个循环，在72℃下继续延伸10min，4℃保存。
取10μLPCR反应产物与1.5μL嗅酚蓝(0.25％)混合，点样于6％聚丙烯酰胺凝胶中，以1×TBE为电泳缓冲液，在120V恒定电压下电泳1.5h左右。用JY04S-3C数码凝胶成像仪检测，抗源PI438685能扩增出一条约230bp的条带，而感病农家品种“卡拉克赛”在同一位置则没有扩增出条带。
实施例五：引物SSR-666对F1的扩增检测。
以杂种F1的基因组DNA为模板，用引物SSR-666进行扩增，PCR反应体系为：5×PCR反应液4μL；10mmol/mL正向和反向引物各1.0μL；模板DNA(30ng·μL-1)1.0μL；ddH2013μL，共20μL。PCR扩增在TC-512扩增仪(TECHNE)上进行，反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行35个循环，在72℃下继续延伸10min，4℃保存。取10μLPCR反应产物与1.5μL嗅酚蓝(0.25％)混合，点样于6％聚丙烯酰胺凝胶中，以1×TBE为电泳缓冲液，在120V恒定电压下电泳1.5h左右。用JY04S-3C数码凝胶成像仪检测，F1能扩增出抗源PI438685的特异性的230bp条带和感病自交系“卡拉克赛”在另一位置的条带。
实施例六：引物SSR-666对F2的扩增检测。
以197株F2群体各单株的基因组DNA为模板，用引物SSR-666进行扩增，PCR反应体系为：5×PCR反应液4μL；10mmol/mL正向和反向引物各1.0μL；模板DNA(30ng·μL-1)1.0μL；ddH2013μL，共20μL。PCR扩增在TC-512扩增仪(TECHNE)上进行，反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行35个循环，在72℃下继续延伸10min，4℃保存。取10μLPCR反应产物与1.5μL嗅酚蓝(0.25％)混合，点样于6％聚丙烯酰胺凝胶中，以1×TBE为电泳缓冲液，在120V恒定电压下电泳1.5h左右。用JY04S-3C数码凝胶成像仪检测。F2群体中50个单株只能扩增出1条约230bp的抗病特异性条带，49个单株只能扩增出1条感病特异性条带，90个单株能同时扩增出2条带，无扩增条带8株。
实施例七：引物SSR-666对5个抗病F2单株的扩增检测。
以构建抗病基因混合池的5个抗病F2单株的基因组DNA为模板，用引物SSR-666进行扩增，PCR反应体系为：5×PCR反应液4μL；10mmol/mL正向和反向引物各1.0μL；模板DNA(30ng·μL-1)1.0μL；ddH2013μL，共20μL。PCR扩增在TC-512扩增仪(TECHNE)上进行，反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行35个循环，在72℃下继续延伸10min，4℃保存。取10μLPCR反应产物与1.5μL嗅酚蓝(0.25％)混合，点样于6％聚丙烯酰胺凝胶中，以1×TBE为电泳缓冲液，在120V恒定电压下电泳1.5h左右。用JY04S-3C数码凝胶成像仪检测。5个单株均能只扩增出1条230bp的特异性条带。
实施例八：引物SSR-666对5个感病F2单株的扩增检测。
以构建感病基因混合池的5个感病F2单株的基因组DNA为模板，用引物SSR-666进行扩增，PCR反应体系为：5×PCR反应液4μL；10mmol/mL正向和反向引物各1.0μL；模板DNA(30ng·μL-1)1.0μL；ddH2013μL，共20μL。PCR扩增在TC-512扩增仪(TECHNE)上进行，反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，进行35个循环，在72℃下继续延伸10min，4℃保存。取10μLPCR反应产物与1.5μL嗅酚蓝(0.25％)混合，点样于6％聚丙烯酰胺凝胶中，以1×TBE为电泳缓冲液，在120V恒定电压下电泳1.5h左右。用JY04S-3C数码凝胶成像仪检测。5个单株在同一位置均没有扩增出条带。
实施例九：育种材料抗病基因检测
以甜瓜资源PI438685为亲本的F2，F3后代群体播种后，取植株子叶或叶片提取基因组DNA，用引物SSR-666进行PCR扩增及电泳检测，扩增和检测方法为同上，表现抗病的植株能够扩增出唯一1条230bp特异性条带，而表现感霜霉病的植株在同一位置不能扩增出条带，或是扩增出2条带，其中一条是抗病特异性条带，另一条是感病特异性条带。从提取基因组DNA到得到鉴定结果，在试验室内只需要1-2个工作日即可完成。
通过传统方法鉴定是否携带抗霜霉病基因，则需要将待鉴定的甜瓜与PI438685先杂交得到F1，再自交和回交构建F2和BC，群体，结合人工接种甜瓜霜霉病菌，根据抗感表现型的遗传分离规律才能得到鉴定结果。每个杂交、自交和回交组合按照200个单株计算，至少需要种植1000株群体植株并进行人工接种蔓枯病菌。按照甜瓜一个生长季节100天计算，传统方法鉴定至少需要200天后，才能鉴定出是否携带抗霜霉病基因。
通过上述系列实施例提供的试验验证，本发明首次获得与甜瓜PI438685抗霜霉病基因连锁的SSR分子标记SSR-666230，可以预测甜瓜植株的霜霉病抗性，快速筛选抗病品种或品系用于甜瓜育种，检测抗病基因方便快速，鉴定方便，而且不受环境影响。
通过上述系列实施例提供的试验验证，本发明通过提供的分子标记，辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交回交建立群体，而且要对群体中霜霉病抗性进行单株选择。对甜瓜霜霉病进行苗期人工接种鉴定，因接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率和准确率。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过SSR-666标记，只需检测是否只有唯一1条230bp的特异性条带，即可鉴定出是否抗霜霉病，在苗期即能鉴定出抗霜霉病的抗病单株，淘汰其它感病单株，不仅节约生产成本而且大大提高抗霜霉病甜瓜的选择效率。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆农业科学院哈密瓜研究中心
<120> 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用
<130> SSR-666 Down
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> SSR-666 Down
<220>
<221> SSR-666 Down
<222> (1)..(21)
<400> 1
caaatccaac gattcataaa c 21
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆农业科学院哈密瓜研究中心
<120> 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用
<130> SSR-666 UP
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
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<220>
<221> SSR-666 UP
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gttccaattg gggagatg 18
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<110> 新疆农业科学院哈密瓜研究中心
<120> 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用
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<120> 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用
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tgcttgtccc aacggtgtca t 21
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆农业科学院哈密瓜研究中心
<120> 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用
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caatcgcaga tacttccacg 20
Claims (3)
1.一种与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记SSR-666230的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以感病农家品种“卡拉克赛”为母本，抗病资源PI438685为父本进行杂交，得到杂种F1；
(2)由杂种F1自花授粉获得F2代群体，F1与“卡拉克赛”杂交获得回交群体BCS，F1与PI438685杂交获得回交群体BCr；
(3)分别在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F1、BCS、BCr和F2进行霜霉病抗病性鉴定；
霜霉病抗病性鉴定中，接种分别选用PI438685、“卡拉克赛”和F1各40粒，BCr和BCs各60粒，200粒F2播种于常见的大棚内的消毒营养钵中，待第2片真叶完全展开时，采用喷雾法进行接种，接种浓度为5×103个/mL，将配制好的霜霉病菌液均匀喷于整株叶面，接种后黑暗保湿48小时，控制温度夜间20℃白天25℃，相对湿度90％以上；
根据在苗期对PI438685、“卡拉克赛”、F1、BCS、BCr和F2进行抗病性鉴定结果：甜瓜抗霜霉病资源PI438685携带霜霉病抗性基因，抗性基因表现为隐性遗传，PI438685全部抗病，“卡拉克赛”全部感病，F1、BCS全部感病，BCr抗感比接近1:1，F2中抗感比接近1:3，表明抗源PI438685抗性基因为单基因隐性；
(4)抗感基因池的构建：F2代中选取极端抗病和极端感病的单株各5株，等量的基因组DNA分别混合构建抗感基因池；具体先选取表现型为0级抗病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建抗病基因混合池，再选取表现型感病的5个单株，吸取等量的基因组DNA，构建感病基因混合池，抗感池最终浓度100ng/mL；
(5)利用公知引物公布的信息，分别以抗感基因池为模板进行PCR扩增，经过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，只有3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699在抗感基因池之间能稳定扩增出多态性条带，所述3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699的引物序列为：
SSR-6665'GTTCCAATTGGGGAGATG'3，
5'CAAATCCAACGATTCATAAAC'3；
SSR-6895'TGTGTGTGTGAGAGAGAGAG'3，
5'GTGTTTGCCGATTCTACC'3；
SSR-6995'CAATCGCAGATACTTCCACG'3，
5'TGCTTGTCCCAACGGTGTCAT'3；
(6)通过对已获得3对引物SSR-666、SSR-689和SSR-699做进一步验证；以抗病资源PI438685、感病自交系“卡拉克赛”、F1以及用于构建抗感基因池的5个抗病F2单株和5个感病F2单株为模板进行PCR验证，最终引物SSR-666扩增稳定，重复性好，在抗亲、抗病基因池和抗病单株上均能扩增出230bp的片段，在感亲、感病基因池和感病单株上没有出现这条特异性条带，说明引物SSR-666与抗源PI438685的抗霜霉病基因存在连锁关系，命名SSR-666230；
(7)根据已获得的分子标记SSR-666230，对F2代群体单株扩增检测，并进行遗传连锁分析；用遗传软件进行遗传连锁性分析，以3.0为最小LOD阈值，确定甜瓜PI438685霜霉病抗性基因与分子标记SSR-666230紧密连锁，遗传连锁距离为2.66cM。
2.如权利要求1所述的与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记SSR-666230的筛选方法，其特征在于，所述的霜霉病抗病性鉴定中，霜霉病菌接种液的配备：从田间采集自然发病的早期病叶，用软毛刷刷取叶背面的孢子囊，置于盛有无菌水的烧杯中，用常见的点接法接种于感病品种的子叶上，之后放入光照培养箱进行扩繁，待子叶背面长出大片黑色霉层后，再用软毛刷刷取叶背面的孢子囊，置于盛有无菌水的烧杯中，搅拌均匀后用血球计数板计数分生孢子数，最终浓度为5×103个/ml孢子。
3.如权利要求1所述的与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记SSR-666230的应用，其特征在于，通过将分子标记SSR-666230用于甜瓜品种或品系的基因型检测，用于判断该品种或品系是否抗甜瓜霜霉病，包括以下步骤：
(1)以抗病资源PI438685与其他甜瓜杂交并繁衍至F2代以上；
(2)对通过步骤(1)获得的甜瓜单株提取基因组DNA，用SSR-666230这个标记进行PCR扩增，检测是否只有唯一的230bp特异性条带出现，如只有这条特异性条带出现，则甜瓜F2单株抗霜霉病。
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| "甜瓜霜霉病抗性基因的SSR标记";贺玉花等;《江苏农业科学》;20140731;第42卷(第7期);正文第1.2-2.2节，引证文件5 * |
| Diaz A等."A consensus linkage map for molecular markers and Quantitative Trait Loci associated with economically important traits in melon ( Cucumis melo L.)".《Bmc Plant Biology》.2011,第11卷(第1期),第1-14页. * |
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