CN109924120A - 一种改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，将携带抗稻瘟病基因Pi1、Pita的Tetep及携带抗白叶枯基因Xa7、Xa21的华恢1337分别与不携带上述抗性基因的水稻材料杂交，以抗性待改良的水稻材料为轮回亲本来连续回交，利用特异性连锁SNP标记选择同时携带Pi1、Pita的单株以及同时携带Xa7、Xa21的单株，在此基础上，根据农艺性状对应基因的特异性SNP标记分别选择回复率最高的单株，杂交后与抗性待改良材料回交，并选择回复率最高的3棵单株自交，得到抗性改良且农艺性状优异的改良新材料。通过特异性SNP标记筛选抗稻瘟病、抗白叶枯病基因以及高回复率的子代，不仅实现聚合稻瘟病、白叶枯病抗性基因以达到改良目的，且育种周期短，节省成本。

Description

一种改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法

技术领域

本发明涉及水稻育种技术领域，特别涉及一种改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物。稻瘟病和白叶枯病是危害水稻的主要病害，危害严重时可导致水稻减产30-50％甚至绝收。培育具有抗性的水稻品种一直是育种界公认的防治稻瘟病和白叶枯病的最经济有效的途径。利用多个抗性基因聚合到同一个品种中是使该品种获得持久抗性的前提和基础。Tetep是华智水稻生物技术有限公司自有的常规稻材料，华恢1337是华智水稻生物技术有限公司通过合作协议引进的常规稻材料。通过分子生物学检测发现Tetep携带Pi1、Pita 2个稻瘟病抗性基因，华恢1337携带Xa7、Xa212个白叶枯病抗性基因，因此Tetep和华恢1337可作为抗性基因供体亲本通过聚合杂交来改良水稻材料的稻瘟病抗性与白叶枯病抗性。

传统的杂交结合表型的选育方法往往因为宏观上表型把握不准而需要加大回交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。分子标记辅助育种可以从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目标基因的单株进行杂交(回交)，能准确的进行目标性状方向的育种，且减小回交群体的大小，节省成本。SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP包括单个碱基的转换或颠换，也包括插入或缺失，在整个基因组上具有高密度性，因此比较容易找到目标基因的SNP。利用目标基因的SNP标记可以在育种过程中进行相关性状的精准选育，也可以将相关的SNP锚定进芯片，在进行全基因组标记选择的同时选择含有此目标基因的个体(单株)。

国内授权专利201510460914.0公开了一种培育广谱、持久穗瘟抗性水稻育种材料的方法，获得了同时聚合2个品种的抗病基因Pigm和Pi54且农艺性状与轮回亲本相似的水稻改良后代材料。但该方法通过宏观上表型把握以对基本农艺性状进行选择，因此通过至少6次回交，存在育种周期长、劳动强度大、靶向性较差的问题。

在此背景下，本发明提出了一种将Tetep携带的Pi1、Pita 2个抗性基因与华恢1337携带的Xa7、Xa212个白叶枯病抗性基因同时导入到不携带这4个抗性基因的水稻待改良材料中，以获得稻瘟病抗性和白叶枯病抗性改良的水稻材料，且育种周期短的育种方法。

发明内容

本发明采用的是利用特异性连锁SNP标记来选择性的聚合Tetep中存在的Pi1、Pita 2个稻瘟病抗性基因与华恢1337中存在的Xa7、Xa212个白叶枯病抗性基因，同时利用在Tetep及华恢1337与待改良水稻材料之间具有多态性的全基因组SNP标记进行背景选择，并结合常规育种手段以选育稻瘟病抗性和白叶枯病抗性提高且农艺性状与待改良材料基本一致的水稻新材料的育种方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是通过下述步骤实现的：

一种改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，包括以下步骤：

(1)轮回亲本分别与Tetep、华恢1337杂交，获得杂交F₁代种子，分别以F_1-Tetep、F_1-华恢1337表示；其中Tetep携带Pi1、Pita 2个抗稻瘟病基因、华恢1337携带Xa7、Xa212个抗白叶枯病基因；

(2)种植F_1-Tetep及F_1-华恢1337，并分别与轮回亲本回交，获得BC₁F₁代种子，分别以BC₁F_1-Tetep和BC₁F_1-华恢1337表示；

(3)种植BC₁F_1-Tetep和BC₁F_1-华恢1337，通过检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₁F_1-Tetep代单株，通过检测Xa7、Xa212个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₁F_1-华恢1337代单株，利用与轮回亲本之间具有多态性的SNP标记，从上述2类单株中分别筛选遗传背景回复率最高的单株，各3株，分别与轮回亲本回交，获得BC₂F_l代种子，分别以BC₂F_1-Tetep和BC₂F_1-华恢1337表示；

(4)种植BC₂F_1-Tetep和BC₂F_1-华恢1337，通过检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₂F_1-Tetep代单株，通过检测Xa7、Xa212个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₂F_1-华恢1337代单株，利用与轮回亲本之间具有多态性的SNP标记，从上述2类单株中分别筛选遗传背景回复率最高的单株，各1株；

(5)种植步骤(4)得到的2个遗传背景回复率最高的单株，进行杂交，获得聚合杂交F₁；

(6)种植步骤(5)中的聚合杂交F₁代种子，并利用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的F₁代单株3株，与轮回亲本回交，获得BC₁F_l代种子；

(7)种植步骤(5)中的BC₁F₁代种子，利用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的单株，然后从这些BC₁F₁代单株中，利用与轮回亲本之间具有多态性的SNP标记筛选遗传背景回复率最高的3个单株自交，自交代数为n(n≥2)，获得农艺性状稳定的BC₁F_n代种子；

(8)种植步骤(7)中的BC1Fn代种子，用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的BC₁F_n代单株，得到抗性改良且农艺性状与轮回亲本无明显差异的改良新材料。

进一步的，所述步骤(1)中，轮回亲本来自籼稻、粳稻、恢复系、保持系中的任意一种育种材料。

更进一步的，所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(6)利用不携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的待改良水稻材料作为轮回亲本进行连续回交的目的是，使最终获得的水稻新材料的农艺性状与轮回亲本相似。

进一步的，所述步骤(3)、步骤(4)，利用检测抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的单株进行回交或自交的目的是，保证Pi1、Pita 2个抗性基因在改良后代中始终存在；利用检测Xa7、Xa212个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Xa7、Xa212个抗性基因的单株进行回交的目的是，保证Xa7、Xa212个抗性基因在改良后代中始终存在。

进一步的，所述步骤(6)、步骤(7)、步骤(8)，利用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的单株进行回交或自交的目的是，保证Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因在改良后代中始终存在。

更进一步的，检测Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的特异性SNP标记根据Pi1、Pita Xa7、Xa214个抗性基因的己公开DNA序列进行自行开发。

进一步的，其特征在于，检测农艺性状对应基因的特异性SNP标记根据农艺性状对应基因的己公开DNA序列进行自行开发。

本发明的有益效果：

(1)本发明最终获得的育种材料同时聚合Tetep携带的Pi1、Pita 2个抗性基因及华恢1337携带的Xa7、Xa212个白叶枯病抗性基因；

(2)本发明在检测抗性基因的特异性SNP标记下，对农艺性状对应基因的全基因组SNP标记进行检测，可显著缩短育种周期，提高育种效率；

(3)本发明使最终获得的育种材料与待改良材料的农艺性状基本保持一致，而稻瘟病抗性和白叶枯病抗性上有显著提高。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

用一个具体实施例子进行详细说明：利用Tetep和华恢1337改良黄华占的稻瘟病抗性和白叶枯病抗性。本发明人利用特异性的SNP标记检测显示黄华占不携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因，而Tetep携带Pi1、Pita 2个抗性基因，华恢1337携带Xa7、Xa212个抗性基因，具体实施步骤如下:

1.将Tetep与黄华占杂交，获得杂种F_1-Tetep代种子50粒；同时，将华恢1337与黄华占杂交，获得杂种F_l-华恢1337代种子40粒。杂交时，用黄华占做母本、Tetep及华恢1337做父本或Tetep及华恢1337做母本、黄华占做父本；同时，作为优选，本实施例用黄华占做母本、Tetep及华恢1337做父本进行杂交得到F₁代，分别以F_1-Tetep、F_l-华恢1337表示。

2.种植上述杂种F_{1-Tetep种子}，将杂种F_1-Tetep单株与黄华占回交，获得BC₁F_1-Tetep代种子1200粒。种植BC₁F_1-Tetep代种子，在幼苗期利用4个与Pi1、Pita紧密连锁的SNP标记对BC₁F_1-Tetep代单株进行检测，选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的单株220株，再利用Tetep与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这220个单株中筛选遗传背景回复率最高(≥90％)，即与黄华占农艺性状最相似的3个单株与黄华占回交，获得BC₂F_1-Tetep种子1100粒；

同时，种植上述杂种F_l-华恢1337，将杂种F_l-华恢1337单株与黄华占回交，获得BC₁F_1-华恢1337代_种子1100粒。种植该BC₁F_1-华恢1337代种子，在幼苗期利用4个与Xa7、Xa21紧密连锁的SNP标记对该BC₁F₁代单株进行检测，选择同时携带Xa7、Xa212个抗性基因的单株210株，再利用华恢1337与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这210个单株中筛选遗传背景回复率最高(≥90％)，即，与黄华占遗传背景最相似的3个单株与黄华占回交，获得BC₂F_1-华恢1337种子1000粒；

遗传背景进行检测，如果受体基因型为AA，记为“0”，供体基因型为BB，记为“2”，杂合基因型为AB，记为“1”，遗传背景回复率＝(a*2+b)/[(a+c+b)*2]。

其中a代表“0”的总数，b代表“1”的总数，c代表“2”的总数；

3.种植BC₂F_1-Tetep代种子，在幼苗期利用4个与Pi1、Pita紧密连锁的SNP标记对BC₂F_1-Tetep代单株进行检测，选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的单株190株，再利用Tetep与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这190个单株中筛选遗传背景回复率最高(≥95％)—即与黄华占遗传背景最相似的1个单株；

同时，种植BC₂F_1-华恢1337代种子，在幼苗期利用4个与Xa7、Xa21紧密连锁的SNP标记对该BC₂F₁代单株进行检测，选择同时携带Xa7、Xa212个抗性基因的单株190株，再利用华恢1337与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这190个单株中筛选遗传背景回复率最高(≥95％)—即与黄华占遗传背景最相似的1个单株；

4.将步骤3获得的2个单株进行杂交，获得聚合杂交F₁种子120粒。种植该聚合杂交F₁种子，在幼苗期利用8个特异性的SNP标记对该F₁代单株进行检测，选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的单株3株，与黄华占回交，获得BC₁F₁种子2200粒；

5.种植步骤4获得的BC₁F₁代单株，利用8个特异性的SNP标记对BC₁F₁代单株进行检测，选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的单株140株，再利用Tetep及华恢1337与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这140个单株中筛选遗传背景回复率最高(≥98％)—即与黄华占遗传背景最相似的3个单株自交，3个BC₁F₂代单株分别收获，每单株全收，得到3个BC₁F₂代株系；

6.种植3个BC₁F₂代株系，每株系种1300株，每株系每个单株均提取叶片利用8个特异性的SNP标记进行检测，发现共有13个单株同时携带纯合的Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因，成熟时将这13个单株收获，每个单株全收，得到13个BC₁F₃代株系；

7.种植13个BC₁F₃代株系，每株系种64株，发现其中3个株系农艺性状与黄华占相似，这3个株系为导入了Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因而且农艺性状又和黄华占相似的最终改良品系。

检测Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因是否存在的特异性的SNP标记的开发方法为根据已报道的Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的DNA序列自行开发。

检测一个水稻单株是否携带Pi1、Pita 2个抗性基因的方法为:利用自行开发的4个特异性SNP标记分别检测该单株的叶片DNA，如果4个特异性SNP标记都能同时检测出为有利基因型，则该单株同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因。

检测一个水稻单株是否携带Xa7、Xa212个抗性基因的方法为:利用自行开发的4个特异性SNP标记分别检测该单株的叶片DNA，如果4个特异性SNP标记都能同时检测出为有利基因型，则该单株同时携带Xa7、Xa212个抗性基因。

检测一个水稻单株是否携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因的方法为:利用自行开发的8个特异性SNP标记分别检测该单株的叶片DNA，如果8个特异性SNP标记都能同时检测出为有利基因型，则该单株同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa214个抗性基因。

本发明涉及的SNP检测等实验技术为竞争性等位基因PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)原理，反应检测在Array Tape基因分型平台上进行，该方法已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高和荧光信号采集数据准确等优势。配套的试剂耗材均购于英国LGC公司。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)轮回亲本分别与Tetep、华恢1337杂交，获得杂交F₁代种子，分别以F_1-Tetep、F_1-华恢1337表示；其中Tetep携带Pi1、Pita 2个抗稻瘟病基因、华恢1337携带Xa7、Xa21 2个抗白叶枯病基因；

(2)种植F_1-Tetep及F_1-华恢1337，并分别与轮回亲本回交，获得BC₁F₁代种子，分别以BC₁F_1-Tetep和BC₁F_1-华恢1337表示；

(3)种植BC₁F_1-Tetep和BC₁F_1-华恢1337，通过检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₁F_1-Tetep代单株，通过检测Xa7、Xa21 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₁F_1-华恢1337代单株，利用与轮回亲本之间具有多态性的SNP标记，从上述2类单株中分别筛选遗传背景回复率最高的单株，各3株，分别与轮回亲本回交，获得BC₂F_l代种子，分别以BC₂F_1-Tetep和BC₂F_1-华恢1337表示；

(4)种植BC₂F_1-Tetep和BC₂F_1-华恢1337，通过检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₂F_1-Tetep代单株，通过检测Xa7、Xa21 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带2个抗性基因的BC₂F_1-华恢1337代单株，利用与轮回亲本之间具有多态性的SNP标记，从上述2类单株中分别筛选遗传背景回复率最高的单株，各1株；

(5)种植步骤(4)得到的2个遗传背景回复率最高的单株，进行杂交，获得聚合杂交F₁；

(6)种植步骤(5)中的聚合杂交F₁代种子，并利用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的F1代单株3株，与轮回亲本回交，获得BC₁F_l代种子；

(7)种植步骤(6)中的BC₁F₁代种子，利用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的单株，然后从这些BC₁F₁代单株中，利用与轮回亲本之间具有多态性的SNP标记筛选遗传背景回复率最高的3个单株自交，自交代数为n(n≥2)，获得农艺性状稳定的BC₁F_n代种子；

(8)种植步骤(7)中的BC₁F_n代种子，用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的BC₁F_n代单株，得到抗性改良且农艺性状与轮回亲本无明显差异的改良新材料。

2.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，轮回亲本来自籼稻、粳稻、恢复系、保持系中的任意一种育种材料。

3.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(6)利用不携带Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的待改良水稻材料作为轮回亲本进行连续回交的目的是，使最终获得的水稻新材料的农艺性状与轮回亲本相似。

4.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(3)、步骤(4)，利用检测抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的单株进行回交或自交的目的是，保证Pi1、Pita 2个抗性基因在改良后代中始终存在；利用检测Xa7、Xa21 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Xa7、Xa21 2个抗性基因的单株进行回交的目的是，保证Xa7、Xa21 2个抗性基因在改良后代中始终存在。

5.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(6)、步骤(7)、步骤(8)，利用检测Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的单株进行回交或自交的目的是，保证Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因在改良后代中始终存在。

6.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，其特征在于，检测Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的特异性SNP标记根据Pi1、Pita、Xa7、Xa21 4个抗性基因的己公开DNA序列进行自行开发。

7.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的方法，其特征在于，检测农艺性状对应基因的特异性SNP标记根据农艺性状对应基因的己公开DNA序列进行自行开发。