CN106929585B

CN106929585B - 抗稻瘟病基因Pigm的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN106929585B
Application number: CN201710212270.2A
Authority: CN
Inventors: 金名捺; 丘式浚; 邓汉超; 唐晓艳; 邓兴旺
Original assignee: SHENZHEN XINGWANG BIOLOGICAL SEED INDUSTRY Co Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Current assignee: SHENZHEN XINGWANG BIOLOGICAL SEED INDUSTRY Co Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2017-04-01
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2037-04-01
Also published as: CN106929585A

Abstract

本发明涉及一种抗稻瘟病基因Pigm的检测方法及其应用，属于农业生物技术领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pigm的特异分子标记的高分辨率熔解曲线分析（High‑Resolution Melting Curve Analysis,HRM）稻瘟病抗性基因Pigm的特异分子标记，以及利用所述引物检测稻瘟病抗性基因Pigm的方法。本发明利用水稻60K基因芯片对谷梅4号、武运粳7号和9311进行全基因组扫描，选择在Pigm基因两端附近谷梅4号与武运粳7号和9311都不同的变异位点来设计HRM引物，在两端各开发一个与Pigm完全共分离的分子标记，并建立中高通量辅助选择体系，能够大大提高水稻抗病育种选育的效率。

Description

抗稻瘟病基因Pigm的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pigm的特异分子标记的高分辨率熔解曲线分析(High-Resolution Melting Curve Analysis,HRM)稻瘟病抗性基因Pigm的特异分子标记，以及利用所述引物检测稻瘟病抗性基因Pigm的方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，超过一半的世界人口以稻米为主食，我国超过60％的人口以稻米为主食。由子囊菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病是广泛发生在世界各稻区影响水稻生产的重要病害之一，每年都会造成严重的粮食损失。实践证明，选育和种植广抗病品种是防治水稻病害最经济有效的方法。近年来，水稻抗稻瘟病基因的克隆取得了重要进展，稻瘟病抗性基因的分子标记的开发对于培育抗稻瘟病水稻品种具有重要意义。

到目前为止，至少有9个稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi26,Pi50,Pi2-2)己经被定位在水稻第6染色体短臂端的Pi2/9基因簇内，这些基因都被认为是稻瘟病广谱抗性基因，在稻瘟病抗性育种方面具有重要的应用价值(Jiang et al.,2012)。其中，水稻稻瘟病主效显性基因Pigm为广谱抗性基因，其抗谱明显强于广谱抗性基因Pi2、Pi9等，在抗病育种中具有更高的应用价值。Pigm来自籼稻谷梅4号，对收集自中国、法国和泰国的30个强致病菌株中的29个表现高抗或免疫，定位于水稻第染色体上标记C5483和C0428之间的70-kb区间内，与标记PC22705、C24901、S29742共分离，与Pi2、Pi9紧密连锁或等位，在该区间中，通过日本晴的序列进行预测，发现有6个NBS-LRR结构域的基因，但Pigm具体是哪个基因还没有功能确认(Deng et al.,2006；Jia et al.,2008；Deng et al.,2009)。

由于Pigm基因还没有克隆，无法知道其详细的DNA序列，就不能针对其功能变异设计特异性的引物来检测其存在与否。为了检测Pigm基因，何祖华等和许一文等分别开发了显性分子标记M80362和M20265。但是这两个标记对Pigm基因的检测结果是根据目的条带的有无来判断的，这样的标记稳定性不好，实验结果重复性不强，在大规模分子辅助选择育种中存在着很大的局限性。周亮等设计了4对Indel引物S29742、S2997、S1408、S2723，共同能够将谷梅4号和其它95个亲本材料全部分开。同时，这4对引物对谷梅4号杂交后代的分离群体的分子检测检测结果和田间抗性鉴定的结果完全一致，使MAS的效率达到100％，表明这些标记与Pigm共分离，完全能够满足大规模分子标记辅助育种的要求。但是，对基因的共分离跟踪在基因没有克隆的条件下，一般只需要在基因的两端各设计一对引物即可满足要求，而周亮等对Pigm的跟踪选择却需要4对引物的共同检测才能实现这一目的。因此，有必要重新在Pigm的两端各开发一对新的共分离引物来对Pigm基因进行分子辅助选择。

高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)是近几年兴起的由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一种单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism,SNP)以及突变研究的工具。它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。在植物育种上，HRM可用于突变扫描、基因分型、基于特定基因的种质资源鉴定以及功能标记开发等方面，对于SNP、InDel等多种标记的开发和利用具有重要的价值。

通过本团队自主开发设计的水稻60K基因芯片对谷梅4号、武运粳7号和9311进行全基因组扫描，选择在Pigm基因两端附近谷梅4号与武运粳7号和9311都不同的变异位点来设计HRM引物，在两端各开发一个与Pigm完全共分离的分子标记，并建立中高通量辅助选择体系，能够大大提高水稻抗病育种选育的效率。

发明内容

Pigm基因定位于水稻第染色体上标记C5483和C0428之间的70-kb区间内的Pi2/9基因簇上，一直没有该基因的克隆报道和序列的公布。研究表明，主效显性基因Pigm为广谱抗性基因，其抗谱明显强于广谱抗性基因Pi2、Pi9等，在抗病育种中具有更高的应用价值，而分子标记辅助选择在抗稻瘟病聚合育种中具有重要的作用，能够大大提高水稻育种选育的效率。以前的Pigm分子标记研究中，要么引物稳定性不好，实验结果重复性不强，要么需要4对甚至更多对的引物才能完成基因的跟踪选择，在大规模分子辅助选择育种中存在着很大的局限性。对于这种还未公布序列的基因的分子标记开发，最有效的方法是在基因两端附近分别开发一个完全共分离的分子标记，因此有必要在对Pigm的分子标记进行重新设计，以便提高分子辅助育种是效率。

利用水稻60K基因芯片(PCT/CN2013/000131)对谷梅4号、武运粳7号和9311进行全基因组扫描，选择在Pigm基因两端附近谷梅4号与武运粳7号和9311都不同的变异位点(如表1)来设计HRM引物，在两端各开发一个与Pigm完全共分离的分子标记，分别为Pigm-HRM-1和Pigm-HRM-2。在基因两侧都开发连锁的分子标记对基因进行跟踪，能够最大限度的防止导入基因的丢失，这是目前对只定位而没有克隆基因进行分子标记辅助选择的最有效的方法。

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用分子标记快速、准确检测抗稻瘟病基因Pigm的方法，本发明提供两对结合高分辨率熔解曲线分析技术——HRM用于检测抗稻瘟病基因Pigm的分子标记引物，所述引物根据Pigm基因两端附近的基因特异性单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)设计，可以结合HRM用于Pigm基因的辅助选择，以提高水稻分子标记辅助选择的效率以及抗病品种选育的效率。

本发明提供如下解决方案：

两对结合HRM用于检测抗稻瘟病基因Pigm的分子标记引物，其上、下游序列分别为：

Pigm-HRM-1F：5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'(SEQ ID NO:1)；

Pigm-HRM-1R：5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'(SEQ ID NO:2)；

Pigm-HRM-2F：5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'(SEQ ID NO:3)；

Pigm-HRM-2R：5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'(SEQ ID NO:4)；

上述引物根据水稻60K基因芯片在Pigm基因两端附近在谷梅4号与武运粳7号和9311的特异性SNP设计(如表1)，两个变异位点分别为T→C和A→C。

一种结合HRM检测水稻抗稻瘟病Pigm的方法：利用上述两对引物扩增23份待测水稻材料的基因组DNA(如表2)，取扩增产物用HRM仪器LightScanner96进行高分辨率熔解曲线采集分析，若上述待测材料的两个高分辨率熔解曲线与阳性对照——水稻抗稻瘟病品种“谷梅4号”的溶解曲线都一致，则待测水稻材料含有抗稻瘟病基因Pigm；否则待测水稻材料不含有抗稻瘟病基因Pigm。结果显示，所选择的23份待测水稻材料都不含有抗稻瘟病基因Pigm，其中红色曲线为阳性对照“谷梅4号”，灰色为待测水稻品种(如图1和图2)。同时，用已经报道过的分子标记S1408、S29742、S2723、S2997、M80362、M26205对这些材料进行分子标记检测，统计结果发现，它们与Pigm-HRM-1和Pigm-HRM-2的检测结果完全一致(如表3)。

上述扩增产物的核苷酸序列如下(两个变异位点突出显示)：

5'-

GCTTAATCAAGCCCATTTCCTCTATAACCACAGAGGATGAGAGGGATTCCTACCTAGAAGATGCTT/

CGCAATCGATCAGGTAGCAACACTGACGAGTCAGAACTTGTGGGCT-3'(SEQ ID NO:5)；

5'-

AAGCTGTCACGACCTGAGAAGGGATGGCAAAGGATCAGCTGTAGAAATGGAA/CGCAACGGAGCC

CCTCCCTGAGCCCGAGAGCTAGAACTCACAGGTGAGCACG-3'(SEQ ID NO:6)；

一种抗稻瘟病水稻材料分子标记辅助选择方法：以含有抗稻瘟病基因Pigm的水稻材料为“谷梅4号”亲本，与其它不含有抗稻瘟病基因Pigm的水稻品种杂交，提取杂交后代个体和两个亲本的基因组DNA，以引物对Pigm-HRM-1F/1R与Pigm-HRM-2F/2R分别进行PCR扩增，其扩增产物的高分辨率溶解曲线呈现出三种类型，其中阳性对照“谷梅4号”的溶解曲线为红色，另一对照亲本为蓝色，两亲本的杂交后代为灰色，且波峰显著比两亲本要低(如图3和图4)。对含有Pigm基因与不含有该基因的两亲本的F₂代分离个体46个样品用引物对Pigm-HRM-1F/1R与Pigm-HRM-2F/2R分别进行分子检测，它们的分型结果完全一致(如图5和图6)。

上述引物对Pigm-HRM-1F/1R与Pigm-HRM-2F/2R优先对水稻苗期所提取的DNA进行分子标记鉴定，检测是否携带“纯合型/杂合型”抗稻瘟病基因Pigm。鉴于HRM检测对PCR要求较低，可通过简单破碎快速制备PCR模板，提高分子标记的检测效率。简单破碎“一管法”抽提水稻材料的总DNA优选过程如下：取2-4cm叶片，直接加提取液(10mMTris-HCl、0.5mMEDTA、0.15M KCl)研磨，沸水浴10min后，静置分层取上清(1μL)即可做PCR扩增的DNA模板。

本发明还提供了一种基于HRM技术的水稻Pigm基因检测的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含引物对：Pigm-HRM-1F：5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'(SEQ ID NO:1)，Pigm-HRM-1R：5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'(SEQ ID NO:2)，Pigm-HRM-2F：5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'(SEQ ID NO:3)，Pigm-HRM-2R：5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'(SEQ ID NO:4)用于检测水稻材料中是否含有Pigm基因。

更具体地，本发明所提供的试剂盒进一步包含PCR试剂和荧光染料。

本发明还提供了一种试剂盒的使用方法，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：提取待测样本DNA；配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂盒和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；和对PCR产物进行HRM分析扫描。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的分子标记几乎不出现假阳性：传统的PCR扩增结合限制性内切酶的检测方法以电泳条带的“有无”来判读，往往假阳性较高，且不稳定导致重复性不强。本发明提供的分子标记在检测上极具简便性和灵敏性，添加有饱和荧光染料的PCR产物直接进行高分辨率熔解曲线采集，达到“零损失”，并且PCR体系成分的存在不影响荧光信号采集，同时该检测方法的分子标记对结果的判定是通过带型的不同来进行的，因此高分辨率熔解曲线检测结果几乎不出现假阳性且稳定性高和重复性好。

(2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量：目前，高分辨率熔解曲线分析方法是仅次于DNA芯片的中高通量SNP检测方法，10min内即可一次性采集96个PCR产物样品的高分辨率熔解，明显比传统的酶切电泳检测方法要简便快捷；并且该分子标记的PCR体系仅需10μl，是普通PCR体系的一半，因此即使需要0.04元/体系的饱和荧光染料，其成本也并不高于普通PCR，特别适用于大规模分子辅助选择育种的生产实践中。

(3)本发明提供的分子标记能够显著地减少PCR模板制备的人力成本和时间成本：在实际应用中，传统的普通PCR结合限制性内切酶的SNP检测方法对PCR模板纯度的要求很高，往往需要使用CTAB等费时费力的提取方法，以避免蛋白质、RNA等杂质残留。本发明的分子标记对PCR模板要求不高，通过简单破碎“一管法”得到的提取液即可作为PCR模板，大大提高了分子检测的简便性。

(4)该方法检测的是Indel或SNP类的变异，这类变异在个体中频率非常高，因此可以更容易找到适合作为跟踪基因的分子标记，大大提高分子标记辅助选择育种的效率。

因此，本发明所提供结合HRM用于检测抗稻瘟病基因Pigm的分子标记引物，以及利用所述引物检测抗稻瘟病基因Pigm的分子标记方法在生产实践中具有广阔的应用前景，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种中的利用效率。

附图说明

图1、引物Pigm-HRM-1检测“谷梅4号”及其它23个待测水稻材料的抗稻瘟病基因Pigm的高分辨率熔解曲线及熔解峰(红色曲线代表“谷梅4号”含有的纯合型Pigm基因的高分辨率熔解曲线及熔解峰，灰色曲线代表其它23个待测水稻材料的抗稻瘟病基因Pigm的高分辨率熔解曲线及熔解峰，图上部代表标准化的溶解曲线，下部代表溶解峰，方格代表对应样品Pigm基因的检测情况)。

图2、引物Pigm-HRM-2检测“谷梅4号”及其它23个待测水稻材料的抗稻瘟病基因Pigm的高分辨率熔解曲线及熔解峰(红色曲线代表“谷梅4号”含有的纯合型Pigm基因的高分辨率熔解曲线及熔解峰，灰色曲线代表其它23个待测水稻材料的抗稻瘟病基因Pigm的高分辨率熔解曲线及熔解峰，图上部代表标准化的溶解曲线，下部代表溶解峰，方格代表对应样品Pigm基因的检测情况)。

图3、引物Pigm-HRM-1检测“谷梅4号”、不含抗稻瘟病基因Pigm亲本以及它们的杂交F₁代的高分辨率熔解曲线及熔解峰(红色曲线代表“谷梅4号”含有的纯合型Pigm基因的高分辨率熔解曲线及熔解峰，蓝色代表不含抗稻瘟病基因Pigm亲本的高分辨率熔解曲线及熔解峰，灰色曲线代表它们的杂交F₁代的高分辨率熔解曲线及熔解峰，图上部代表标准化的溶解曲线，下部代表溶解峰)。

图4、引物Pigm-HRM-2检测“谷梅4号”、不含抗稻瘟病基因Pigm亲本以及它们的杂交F₁代的高分辨率熔解曲线及熔解峰(红色曲线代表“谷梅4号”含有的纯合型Pigm基因的高分辨率熔解曲线及熔解峰，蓝色代表不含抗稻瘟病基因Pigm亲本的高分辨率熔解曲线及熔解峰，灰色曲线代表它们的杂交F₁代的高分辨率熔解曲线及熔解峰，图上部代表标准化的溶解曲线，下部代表溶解峰)。

图5、引物Pigm-HRM-1检测“谷梅4号”、不含抗稻瘟病基因Pigm亲本以及它们的杂交F₂代分离群体的高分辨率熔解曲线及熔解峰(红色曲线代表“谷梅4号”含有的纯合型Pigm基因的高分辨率熔解曲线及熔解峰，蓝色代表不含抗稻瘟病基因Pigm亲本的高分辨率熔解曲线及熔解峰，灰色曲线代表它们的杂交F₁代的高分辨率熔解曲线及熔解峰，D11和D12分别为Pigm基因阴性对照和阳性对照，图上部代表标准化的溶解曲线，下部代表溶解峰，方格代表对应样品Pigm基因的检测情况)。

图6、引物Pigm-HRM-2检测“谷梅4号”、不含抗稻瘟病基因Pigm亲本以及它们的杂交F₂代分离群体的高分辨率熔解曲线及熔解峰(红色曲线代表“谷梅4号”含有的纯合型Pigm基因的高分辨率熔解曲线及熔解峰，蓝色代表不含抗稻瘟病基因Pigm亲本的高分辨率熔解曲线及熔解峰，灰色曲线代表它们的杂交F₁代的高分辨率熔解曲线及熔解峰，D11和D12分别为Pigm基因阴性对照和阳性对照，图上部代表标准化的溶解曲线，下部代表溶解峰，方格代表对应样品Pigm基因的检测情况)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd edition)》(Sambrook，J.，Russell,David W.，2001，Cold Spring Harbor)，《Plant Propagation byTissue Culture》(Edwin F.George,Michael A.Hall,Geert-Jan De Klerk,2008,Springer)。

实施例1：Pigm附近两端特异性单碱基多态性(SNP)分析

由于Pigm基因还没有克隆，无法知道其详细的DNA序列，就不能针对其功能变异设计特异性的引物来检测其存在与否。利用水稻60K基因芯片对谷梅4号、武运粳7号和9311进行全基因组扫描，选择在Pigm基因两端附近谷梅4号与武运粳7号和9311都不同的变异位点(如表1)来设计HRM引物，以便在两端附近各开发一个与Pigm完全共分离的分子标记，两个特异性变异位点分别为T→C和A→C，具体如下述的SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。

5'-

GCTTAATCAAGCCCATTTCCTCTATAACCACAGAGGATGAGAGGGATTCCTACCTAGAAGATGCTT/

CGCAATCGATCAGGTAGCAACACTGACGAGTCAGAACTTGTGGGCT-3'(SEQ ID NO:5)；

5'-

AAGCTGTCACGACCTGAGAAGGGATGGCAAAGGATCAGCTGTAGAAATGGAA/CGCAACGGAGCC

CCTCCCTGAGCCCGAGAGCTAGAACTCACAGGTGAGCACG-3'(SEQ ID NO:6)；

一种抗稻瘟病水稻材料分子标记辅助选择方法：以含有抗稻瘟病基因Pigm的水稻材料为“谷梅4号”亲本，与其它不含有抗稻瘟病基因Pigm的水稻品种杂交，提取杂交后代个体和两个亲本的基因组DNA，以引物对Pigm-HRM-1F/1R与Pigm-HRM-2F/2R分别进行PCR扩增，其扩增产物的高分辨率溶解曲线呈现出三种类型，其中阳性对照“谷梅4号”。

表1

实施例2：Pigm共分离分子标记引物设计与HRM检测

(1)引物设计

根据HRM引物设计原则，分别在Pigm基因两端附近设计了一对基因特异性分子标记引物，引物对碱基序列如下：

Pigm-HRM-1F：5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'(SEQ ID NO:1)；

Pigm-HRM-1R：5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'(SEQ ID NO:2)；

Pigm-HRM-2F：5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'(SEQ ID NO:3)；

Pigm-HRM-2R：5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'(SEQ ID NO:4)；

(2)HRM检测

通过Pigm特异性共分离分子标记引物对Pigm-HRM-1F/1R和Pigm-HRM-2F/2R对含有纯合型Pigm基因的水稻水稻材料“谷梅4号”、水稻两系不育系、三系保持系、恢复系、常规稻以及其它水稻抗病亲本(如表2)的DNA模板进行PCR扩增，扩增产物通过HRM仪器LightScanner96采集高分辨率熔解曲线，得到阳性对照与其它23个水稻材料中抗稻瘟病基因Pigm呈特征性峰型的高分辨率熔解曲线(如图1和图2)。同时通过已经报道过的分子标记S1408、S29742、S2723、S2997、M80362、M26205对这些材料进行分子标记检测，统计结果发现，它们与Pigm-HRM-1和Pigm-HRM-2的检测结果完全一致(如表3)。

表2

表3

PCR扩增反应体系如下：

为了防止体系蒸发，在PCR扩增前需滴加15μL-20μL矿物油覆盖。

PCR扩增条件如下：

Pigm-HRM-1：95℃3分钟；95℃30秒、57℃30秒、72℃10秒，40个循环；72℃3分钟；95℃1分钟；25℃1分钟。

Pigm-HRM-2：95℃3分钟；95℃30秒、58℃30秒、72℃10秒，40个循环；72℃3分钟；95℃1分钟；25℃1分钟。

PCR结束后，取洁净的白底黑框96孔PCR板，每孔加入1μL温度内参(InternalTemperature Controls)，然后将PCR产物分别转移至各孔中，2000rpm离心1分钟，即可进行高分辨率熔解曲线采集及分析。

所述的温度内参碱基序列如下：

InTemF：5＇-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3＇(SEQID NO:7)；

InTemR：5＇-

AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCACGAT-3＇(SEQ ID NO:8)；

上述互补的寡聚核苷酸InTemF和InTemR合成后，1OD的量用800μLddH₂O溶解，然后反应体系如下：

在95℃条件下变性3分钟后，自然冷却至室温复性，即可作为温度内参。

实施例3：Pigm共分离分子标记在辅助育种中的应用分析

以含有抗稻瘟病基因Pigm的水稻材料为“谷梅4号”亲本，与其它不含有抗稻瘟病基因Pigm的水稻品种杂交，提取杂交后代个体和两个亲本的基因组DNA，以引物对Pigm-HRM-1F/1R与Pigm-HRM-2F/2R分别进行PCR扩增，其扩增产物的高分辨率溶解曲线呈现出三种类型，其中阳性对照“谷梅4号”的溶解曲线为红色，另一对照亲本为蓝色，两亲本的杂交后代为灰色，且波峰显著比两亲本要低(如图3和图4)。对含有Pigm基因与不含有该基因的两亲本的F₂代分离个体46个样品用引物对Pigm-HRM-1F/1R与Pigm-HRM-2F/2R分别进行分子检测，它们的分型结果完全一致(如图5和图6)。说明本发明所开发提供的共分离分子标记引物Pigm-HRM-1F/1R与Pigm-HRM-2F/2R可以高效、精确的用于鉴定材料中是否含有抗稻瘟病基因Pigm。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳兴旺生物种业有限公司

深圳市作物分子设计育种研究院

<120> 抗稻瘟病基因Pigm的检测方法及其应用

<130>

<150> 201611251329.0

<151> 2016-12-29

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcttaatcaa gcccatttcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agcccacaag ttctgactcg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aagctgtcac gacctgagaa g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgtgctcacc tgtgagttct a 21

<210> 5

<211> 112

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 5

gcttaatcaa gcccatttcc tctataacca cagaggatga gagggattcc tacctagaag 60

atgcttcgca atcgatcagg tagcaacact gacgagtcag aacttgtggg ct 112

<210> 6

<211> 104

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 6

aagctgtcac gacctgagaa gggatggcaa aggatcagct gtagaaatgg aacgcaacgg 60

agcccctccc tgagcccgag agctagaact cacaggtgag cacg 104

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 7

atcgtgattt ctatagttat ctaagtagtt ggcattaata atttcatttt 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 8

aaaatgaaat tattaatgcc aactacttag ataactatag aaatcacgat 50

Claims

1.一种Pigm基因的检测引物，其特征在于所述引物包含两对检测引物，所述检测引物1的正向引物是5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'，反向引物是5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'，检测引物2的正向引物是5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'，反向引物是5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'。

2.一种Pigm基因的HRM检测方法，其特征在于所述HRM检测方法包含两对检测引物，所述检测引物1的正向引物是5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'，反向引物是5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'；检测引物2的正向引物是5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'，反向引物是5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'。

3.根据权利要求2所述的HRM检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

a)提取待测样本DNA；

b)用检测引物1和检测引物2进行PCR扩增；和

c)对PCR产物进行HRM分析扫描。

4.一种Pigm基因的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中包含下述两对检测引物之一，检测引物1的正向引物是5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'，反向引物是5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'；检测引物2的正向引物是5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'，反向引物是5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中所述的试剂盒还包含PCR试剂和荧光染料。

6.权利要求4-5之任一所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述使用方法包括如下步骤：

a)提取待测样本DNA；

b)配制包含待测样本DNA、引物对、PCR试剂盒和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；和

c)对PCR产物进行HRM分析扫描。

7.权利要求1所述的检测引物1和检测引物2在检测水稻抗稻瘟病基因Pigm中的应用。

8.权利要求2或3所述的HRM检测方法在检测水稻抗稻瘟病基因Pigm中的应用。

9.权利要求4或5所述的试剂盒在检测水稻抗稻瘟病基因Pigm中的应用。