CN106520762A - 与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记及其应用，分子标记包括6个SNP标记以及5个InDel标记，分别为SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334。此外，本发明还提出筛选该标记的方法，以及上述标记的应用。本发明利用全基因组重测序技术开发出的SNP及InDel标记，结合R gls 基因初步定位结果（位于SSR标记S0304673和S0405127之间），选出在R gls 基因两侧的的SNP和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP位点和30个InDel位点进行了分析，筛选出6个SNP 及5个InDel标记与R gls 基因位点紧密连锁。
Description
技术领域
本发明属于苹果育种技术领域，具体涉及一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
苹果炭疽菌叶枯病(Glomerella Leaf Spot，GLS)是一种流行性很强的真菌病害，短时间内即可造成大量叶片干枯脱落，严重时造成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点(Leite et al.1988；González&Sutton,1999；González,2003；wang et al.2012；宋清等2012)。对该病进行有效药物防治较为困难。培育抗病品种是解决该问题的有效途径。由于苹果杂种树有较长的童期，导致传统育种周期很长。因此利用DNA分子标记进行早期选择对提高筛选效率和育种效率有着极其重要的意义。
先前的研究结果表明，苹果对炭疽菌叶枯病的抗性是由隐性单基因控制的(Dantas et al.2009；刘源霞等，2015)。本课题组利用11个SSR标记构建了苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点的遗传连锁图谱，将其定位于苹果第15条染色体上，位于标记SSR0304673和SSR0405127之间，遗传距离为1.3cM，物理距离为500kb。
大量存在于基因组DNA序列的SNP和InDel标记，已被广泛应用于图位克隆、基因定位、动植物遗传多样性的鉴定、分子标记辅助育种等领域(Jander et al.2002；Schnabelet al.2005；王岩等,2009；王明军等，2010)。随着高通量测序技术的快速发展，利用全基因组重测序(whole genome re-sequencing,WGR)技术结合混合分组分析法(bulkedsegregant analysis,BSA)可高效检测出通过双亲杂交建立的后代群体中导致表型变异的QTL和突变位点(Abe et al.2012；Takagi et al.2013)，并且可以识别大量的SNP和InDel位点,从而进行SNP及InDel标记的开发，获得基因区SNP及InDel标记，为后续遗传图谱的构建及基因定位奠定基础。
分子标记辅助选择育种(marker assisted selection，MAS)作为一种高效的现代分子育种技术，已被广泛应用于作物遗传改良和品种选育。它是利用与目标基因紧密连锁的分子标记，来鉴定不同个体的基因型，从而进行辅助选择育种。与通过表现型间接对基因型进行选择的传统育种方法相比，MAS育种能有效结合基因型与表型鉴定结果，避免选育过程中的盲目性和不可预测性，从而显著提高选择的准确性和育种效率。
发明内容
本发明的目的是利用全基因组重测序技术与BSA分析相结合的方法获得的SNP及InDel位点，开发SNP及InDel引物，并通过HRM技术进行筛选与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的SNP和InDel标记，进一步缩小抗病基因位点的区域范围，为基因克隆提供有价值的遗传信息。技术方案如下：
首先本发明提出一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，包括6个SNP标记以及5个InDel标记，分别为SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334；用于扩增上述标记的引物分别为：
SNP3955-R和SNP3955-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2所示；
SNP4236-R和SNP4236-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、4所示；
SNP4257-R和SNP4257-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.5、6所示；
SNP4299-R和SNP4299-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、8所示；
SNP4336-R和SNP4336-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.9、10所示；
SNP4432-R和SNP4432-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.11、12所示；
InDel4199-R和InDel4199-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.13、14所示；
InDel4227-R和InDel4227-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.15、16所示；
InDel4254-R和InDel4254-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.17、18所示；
InDel4305-R和InDel4305-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.19、20所示；
InDel4334-R和InDel4334-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.21、22所示。
优选的，所述SNP标记SNP4236，InDel标记InDel4227以及InDel4254与Rgls基因位点共分离。
优选的，SNP标记SNP4236，InDel标记InDel 4254和InDel4227可应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。
优选的，SNP标记SNP4236和InDel标记InDel4254鉴定抗病感病的准确率分别为98.0％，96.0％。
本发明还提出一种与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记的筛选方法，包括如下步骤：
S1，通过全基因组重测序以及结合Rgls基因初步定位结果，筛选出位于Rgls基因两侧的SNP和InDel标记位点，并设计出SNP引物和InDel引物；
S2，利用BSA法及HRM技术分析对设计的引物进行筛选验证，从而筛选出与Rgls基因位点连锁的6个SNP标记及5个InDel标记，即权利要求1中所述的SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334。
此外，本发明还提出利用分子标记精细定位Rgls基因位点的方法，包括如下步骤：
S1，通过全基因组重测序以及结合Rgls基因初步定位结果，筛选出位于Rgls基因两侧的SNP和InDel标记位点，并设计出SNP引物和InDel引物；
S2，利用BSA法及HRM技术分析对设计的引物进行筛选验证，从而筛选出与Rgls基因位点连锁的6个SNP标记及5个InDel标记，即权利要求1中所述的SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334。
S3，利用SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432，以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4334对重组个体的基因型和抗病表型进行分析，将基因Rgls位点定位于InDel4199和SNP4257之间，物理距离为58kb。
此外，本发明还提出一种上述分子标记在苹果抗炭疽菌叶枯病分子育种的应用。
本发明相对于现有技术所具有的优点为：
1.首先，本发明利用全基因组重测序技术开发出的SNP及InDel标记，结合Rgls基因初步定位结果，选出在Rgls基因两侧的SNP和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP位点和30个InDel位点进行了分析，筛选出6个SNP及5个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。
2.本发明利用筛选出的6个SNP标记和5个InDel标记对Rgls基因位点进行了精细定位，将Rgls基因位点定位于InDel4199和SNP4257之间，物理距离由500kb缩小为58kb。
3.此外，本发明筛选出的标记InDel4227、SNP4236和InDel4254表现出与Rgls基因位点共分离，两个共分离标记SNP标记SNP4236和InDel标记InDel4254鉴定抗病感病的准确率分别为98.0％，96.0％，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SNP3955标记在F1群体上的PCR扩增的HRM图；
图2为SNP4236标记在F1群体上的PCR扩增的HRM图；
图3为SNP4257标记在F1群体上的PCR扩增的HRM图；
图4为SNP4432标记在F1群体上的PCR扩增的HRM图；
图5为InDel4305标记在F1群体上的PCR扩增的HRM图；
图6为抗炭疽菌叶枯病基因Rgls位点的精细定位，Rgls基因位点被重组个体限定在标记InDel4199和SNP4257之间。
图7为室内接种4d后部分品种(系)对炭疽菌叶枯病的抗性表现；
图8为SNP4236标记在不同品种(系)中扩增的HRM图；
图9为InDel4254标记在不同品种(系)中扩增的HRM图。
具体实施方式
1材料与方法
1.1基因组DNA的提取与抗感DNA池的构建
以2009年定植于青岛农业大学苹果试验基地(山东省胶州市)的207株‘金冠’ב富士’的F1杂交群体和50个田间栽培品种和品系(50个田间栽培品种和品系列于表2)做为试材。经过人工离体接种鉴定，杂交群体中抗病植株为93株，感病植株为114株。品种(系)中抗病植株为33株，感病植株为17株。
每个单株取嫩叶0.2g，液氮速冻，-70℃保存。参考Doyle and Doyle(1987)及Cullings(1992)提取基因组DNA的CTAB法，并加以改进。利用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA的纯度和浓度，并将浓度稀释到10ng·μl-1。
按BSA分析方法的要求，选取10份高抗单株的DNA等量混合构建DNA抗池；选取10份高感单株的DNA等量混合构建DNA感池(刘源霞等，2015)。
1.2 SNP及InDel引物的设计
根据基因Rgls位点的初步定位结果及通过全基因组重测序技术所获得的与苹果抗炭疽菌叶枯病相关的SNP及InDel位点，筛选出位于第15条染色体上的4.1Mb-4.7Mb区域内的18个SNP和30个InDel候选位点，并在候选位点两侧进行引物设计。引物设计的主要参数为：产物大小60-160bp；引物退火温度(Tm)在55-65℃之间，且上、下游引物Tm相差不大于2℃；引物GC含量为45％-55％。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3高分辨率熔解曲线分析
PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析在480 Ⅱ荧光定量PCR仪(Roche)上进行。反应试剂来自480 High Resolution Melting Master试剂盒。反应体系为15μl，内含10ng·μl-1的基因组DNA 1.0μl，1×Master Mix 7.5μl，2.0mmol·l-1MgCl2 1.5μl，左右引物为0.2μmol·l-1各0.5μl。
PCR扩增程序采用李炜等(2015)所用的程序：95℃预变10min，然后按95℃变性10min，55℃退火15s，72℃延伸10s进行45个循环。扩增产物HRM检测程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，在65℃升温至95℃的过程中，以25次·℃-1的频率收集荧光信息，最后降温至40℃。利用480的Gene Scanning软件(1.5version)进行高分辨率熔解曲线分析。
1.4SNP、InDel标记的筛选验证及基因Rgls位点的精细定位
用18对SNP及30对InDel引物在亲本和抗感基因池中筛选，将出现不同分型的引物在分离群体上进行验证，以确定该标记是否与目的基因连锁。
将筛选的多态性标记在重组个体上的基因型表现与重组个体的抗病表型进行统一分析，对抗炭疽菌叶枯病基因Rgls位点进行精细定位，缩小抗病基因位点的范围，为后续的候选基因筛选及图位克隆提供准确的信息。
1.5分子标记可靠性验证
利用与抗炭疽菌叶枯病基因Rgls位点紧密连锁的2个分子标记对50个品种(系)进行基因型验证，通过与表型鉴定结果比对，以确定分子标记的可靠性。
2结果与分析
2.1 SNP及InDel标记的筛选
通过对设计的引物进行BSA筛选，获得了与Rgls基因位点连锁的6个SNP及5个InDel标记，分别为SNP3955、SNP4236、SNP4257、SNP4299、SNP4336、SNP4432和InDel4199、InDel4227、InDel4254、InDel4305、InDel4334，如表1所示。
2.2 SNP及InDel标记的验证
将获得的11个标记在207株F1分离群体上检验其与抗炭疽菌叶枯病基因的连锁情况，结果表明，这11个标记的扩增子熔解曲线形状明显不同，可据此区分抗病型和感病型植株(图1-图5所示)。
2.3基因Rgls位点的精细定位
将从全基因组重测序中筛选出并经群体验证的与Rgls位点紧密连锁6个SNP及4个InDel标记(InDel4305标记在染色体上的物理位置与遗传位置不符，未用于精细定位分析)，共10个标记与重组个体基因型及表型进行分析。在已获得的初步定位的Rgls位点基础上进一步将基因Rgls位点定位于InDel4199和SNP4257之间，物理距离由500kb缩小为58kb(图6所示)。
表1 SNP、InDel引物筛选
2.4不同苹果品种(系)对炭疽菌叶枯病的抗性表现
通过室内人工接种对50个品种(系)进行抗性鉴定(表2)。鉴定结果表明，在50个苹果品种(系)中，有33个抗病品种(系)，17个感病品种(系)，抗感表现差异明显(图7)。
2.5不同标记对抗感品种(系)的鉴定
图8所示，在HRM图中，可以看出标记SNP4236和InDel4254能够很清楚的区分出抗感植株。
2.6标记准确性鉴定
两个共分离标记SNP标记SNP4236和InDel标记InDel4254对33个抗病品种(系)和17个感病品种(系)验证的结果显示(表2)，2个标记在基因型鉴定结果中与表型鉴定结果不相符的品种(系)分别为1个和2个，鉴定抗病感病的准确率分别为98.0％，96.0％，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。
表2 2个分子标记对苹果栽培品种和品系的抗病性的鉴定结果
HRM分析技术是近年来国际上新兴的一种用于检测基因突变，进行基因分型和SNP分析的技术方法。通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP位点。SNP位点因碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化，因而形成不同的融解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点及不同的基因型(Wittwer,2009)。该技术具有三个突出的优势：一是高通量、高灵敏度、高特异性、低成本且不受检测位点的限制；二是操作简单、快捷、节省时间成本；三是闭管操作，无污染且DNA不受损伤，熔解分析后还可以进行凝胶电泳或测序分析。
精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记法，对于有参基因组植物来说，就是根据对目的基因的初步定位结果，选择位于目的基因两侧的分子标记之间的碱基，用于设计合适的分子标记。筛选出的与目的基因连锁的分子标记，通过鉴定更大的群体来确定发生交换的重组单株，最终找到与目的基因紧密连锁的分子标记，从而实现对目的基因的精细定位。精细定位是图位克隆策略中重要的一步,可以通过开发新的分子标记，整合原来已有的遗传图谱来进行图谱加密，以实现对目的基因的精细定位。
本发明利用全基因组重测序技术开发出的SNP及InDel标记，结合Rgls基因初步定位结果，选出位于Rgls基因两侧的SNP和InDel标记，通过HRM曲线分析技术对18个SNP位点和30个InDel位点进行了分析，筛选出6个SNP及5个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。并选择其中的10个标记用于Rgls基因位点的精细定位，其中标记InDel4227、SNP4236和InDel4254表现出与Rgls基因位点共分离。
本发明利用2个与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点共分离的分子标记SNP4236和InDel4254对50个田间栽培品种和青岛农业大学选育出的优系进行了抗炭疽菌叶枯病的基因型鉴定，并结合其抗病的表型鉴定对2个标记的准确性进行了分析，结果表明2个标记的准确率分别为98.0％和96.0％，可以应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记及应用
<130>
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 人工序列
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<400> 22
gtatcttcta cattatcttt cgtg 24
Claims (7)
1.与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，包括6个SNP标记以及5个InDel标记，分别为SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334；用于扩增上述标记的引物分别为：
SNP3955-R和SNP3955-F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1、2所示； SNP4236-R和SNP4236-F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3、4所示；
SNP4257-R和SNP4257-F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5、6所示；
SNP4299-R和SNP4299-F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 7、8所示；
SNP4336-R和SNP4336-F核苷酸序列分别如SEQ ID No. 9、10所示；
SNP4432-R和SNP4432-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.11、12所示；
InDel4199-R和InDel4199-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.13、14所示；
InDel4227-R和InDel4227-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.15、16所示； InDel4254-R和InDel4254-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.17、18所示；
InDel4305-R和InDel4305-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.19、20所示；
InDel4334-R和InDel4334-F核苷酸序列分别如SEQ ID No.21、22所示。
2.根据权利要求1所述的与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述SNP标记SNP4236，InDel标记InDel4227以及 InDel4254与R gls 基因位点共分离。
3.根据权利要求2所述的与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，SNP标记SNP4236，InDel标记InDel4254和InDel4227可应用于田间栽培品种、品系、种质资源以及杂种后代幼苗对炭疽菌叶枯病抗性的鉴定。
4.根据权利要求3所述的与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，SNP标记SNP4236和InDel标记InDel4254鉴定抗病感病的准确率分别为98.0%，96.0%。
5.与苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点紧密连锁的分子标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，通过全基因组重测序以及结合R gls 基因初步定位结果，筛选出位于R gls 基因两侧的SNP和InDel标记位点，并设计出SNP引物和InDel引物；
S2，利用BSA法及HRM技术分析对设计的引物进行筛选验证，从而筛选出与R gls 基因位点紧密连锁的6个SNP标记 及5个InDel标记，即权利要求1中所述的SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334 。
6.利用分子标记精细定位R gls 基因位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，通过全基因组重测序以及结合R gls 基因初步定位结果，筛选出位于R gls 基因两侧的SNP和InDel标记位点，并设计出SNP引物和InDel引物；
S2，利用BSA法及HRM技术分析对设计的引物进行筛选验证，从而筛选出与R gls 基因位点紧密连锁的6个SNP标记 及5个InDel标记，即权利要求1中所述的SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334 ；
S3，利用SNP标记SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432，以及InDel标记InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4334对重组个体的基因型和抗病表型进行分析，将基因R gls 位点定位于InDel4199和SNP4257之间，物理距离为58kb。
7.权利要求1-4任意一项所述的分子标记在苹果抗炭疽菌叶枯病分子育种的应用。
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