CN108866233A - 用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的标记位点、引物对、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用。该多态性标记位点是桃基因组第2染色体的第4,467,346‑4,467,380bp处序列存在35bp缺失。本发明根据该位点上下游200bp序列设计的PCR引物,能够用于鉴定或辅助鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状,在鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状时具有较高的准确率。本发明对250份红根甘肃桃1号与贝蕾杂交的F2群体待测桃单株进行PCR标记准确率的验证,结果表明,本发明在进行杂交群体的表型性状预测时,准确率可以达到100.00%。这说明,利用本发明的标记位点开发的PCR引物进行检测具有简单、快速、成本低的优点,能够实现生产中大规模的应用。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的标记位点、引物对、试剂盒及应用,属于生物技术领域。
背景技术
后代筛选是育种中最重要的环节之一,它是指在一个杂交育种群体中选择符合预期育种目标的基因型,来进行后续的复选和区域试验,从而完成新品种的培育过程。在传统常规育种中,由于很难获知后代的基因型,因此选择的依据通常根据单株的表现型。这种选择方法对质量性状而言一般是有效的,但对数量性状来说,因其表现型受环境影响明显;且数量性状由多个位点控制,与单个基因型之间缺乏明确的对应关系,因而选择效率不高。同时,果树不仅植株高大、占地多,且童期长,因此采用表型筛选后代费时、费力。
近20年来迅速发展起来的基于DNA的分子标记技术,即“分子标记辅助选择”(marker-assisted selection,缩写为MAS)给育种提供了崭新的途径。它通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种,从而达到提高育种效率的目的。常见的标记类型如AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片段长度多态性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)、SRAP(Sequence-relatedamplified polymorphism,相关序列扩增多态性)、SSR(Simple Sequence Repeats,简单重复序列)和RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性内切酶片段长度多态性)等。
在根结线虫标记筛选方面,郭瑞等(2009)用SSR、SRAP标记构建了‘红根甘肃桃1号’ב贝蕾’桃遗传连锁图,将抗南方根结线虫标记定位在第2染色体的顶端,与SSR标记EPDCU4017紧密连锁,连锁距离为19.3cM,与SRAP标记M8E1-95紧密连锁,连锁距离为4.7cM。Cao等(2011)利用SSR、SRAP、RGA标记将‘红根甘肃桃1号’抗南方根结线虫基因PkMi定位到桃第2染色体的顶端,位于RGA标记NBS3和NBS29之间,与SSR标记UDP98-025连锁,遗传距离为10cM。之后,Cao等(2014)又利用SSR、SRAP、PGA标记对NBS3和NBS29区间进行加密,发现两个可能的PkMi位点,其中1个在2号染色体7.5Mb处;另1个在同染色体的3.7Mb-6.9Mb处。发明人对上述标记中重复性高的SSR标记进行验证,发现其在杂交后代中鉴定的准确率仅为90%左右,且关键基因不明确,需要进一步开发相应的较为准确的标记。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的是提供用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的标记位点、引物对、试剂盒及应用,相对于前期研究成果,该标记位点在鉴定桃树抗南方根结线虫时,准确率高达100%,适合用于桃抗根结线虫单株的早期鉴定。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:
用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的标记位点,是桃基因组第2染色体的第4,467,346~4,467,380处多态性Indel位点,该位点长35bp,序列为GCGTCCAACTTTGCCGAACCCATCCCCATGCGAGG。
用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的PCR扩增引物对,其中,引物对中的上游引物是根据桃基因组第2染色体的第4,467,346~4,467,380处存在35bp的Indel位点的上游200bp序列进行设计,所述引物对中的下游引物是根据第2染色体的第4,467,346~4,467,380处存在35bp的Indel位点的下游200bp进行设计。
引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成。
一种标记位点在桃树对南方根结线虫抗病/感病性状中标记辅助选择育种方面的应用。
标记位点在鉴定或辅助鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状中的应用。
用于鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的试剂盒,包括用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的PCR扩增引物对,。
一种试剂盒在桃树对南方根结线虫抗病/感病性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
一种利用标记位点鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的方法,包括以下步骤:
(1)PCR扩增:以待测桃的基因组DNA为模板,用PCR扩增引物对进行PCR扩增,获得PCR扩增产物;
(2)琼脂糖电泳:将完成扩增反应的产物进行1%琼脂糖电泳,统计条带类型及大小;
(3)基因分型:根据条带类型及大小情况判定种质的基因分型,预测表型。
引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成。
当条带出现161bp单带或同时含有161bp和196bp双带的,种质分型对应为抗南方根结线虫的桃种质;当条带出现196bp单带的,种质分型对应为感病桃种质。
本发明有益效果:
1、本发明筛选得到桃基因组第2染色体第4,467,346-4,467,380bp处存在35bp的缺失(Indel)序列,能够用于鉴定或辅助鉴定桃树抗南方根结线虫性状,在鉴定桃树抗南方根结线虫性状时具有很高的准确率。
2、本发明针对桃基因组第2染色体的第4,467,346-4,467,380bp处具有多态性Indel标记的特性,设计了特定的用于扩增该标记的引物对,通过琼脂糖电泳结果可以获得该基因分型结果。
3、本发明对250份‘红根甘肃桃1号’与‘贝蕾’杂交F2群体种质进行分子标记预测表型的准确率验证,结果表明,本发明对抗病/感病性表型预测的准确率可达100%。这说明,利用本发明的标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点,能够实现生产中大规模的应用。
附图说明
图1为抗南方根结线虫Indel标记在部分F2代自交群体中的扩增结果。图中,M表示marker,S表示感病单株,R表示抗病单株。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1Indel位点的获得
本发明以从中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃构建的‘红根甘肃桃1号’与‘贝蕾’杂交后代F1自交产生构建的F2代250份自交群体种质为样品,对其接种南方根结线虫并调查抗病指数。然后从中选取20株抗病与20株高感种质分别构建混合基因池,采用常规CTAB法提取样品DNA,并通过Illumina HiSeq 2000测序仪对亲本‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’、抗病混合池、感病混合池及F1代共5个样本的DNA进行测序,得到47.58Gb数据,平均覆盖桃基因组95.50%~96.49%,平均测序深度为38.04×~49.18×间。根据测序得到的序列,与桃参考基因组v.1.0(http://www.rosaceae.org/node/355)进行比对,鉴定出2,442,036个SNPs,通过计算抗病和感病基因池间每个SNP的SNP-index,将桃树抗南方根结线虫性状的基因位点定位于第2染色体顶端4.0Mb-5.5Mb处。同时,根据BSA测序得到的Indel信息,在该区间得到一个在抗、感基因池差异最为明显的多态性位点,位于桃基因组第2染色体的4,467,346~4,467,380bp处。
实施例2利用多态性Indel位点开发的PCR标记鉴定桃树抗南方根结线虫性状的方法
1、DNA提取
采用常规CTAB法提取待测桃样品组织的DNA,去除RNA,DNA样品总体积不低于15μl。用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值,计算DNA含量和OD260/280的比值。DNA样品纯度OD260/280值应在1.8~2.0之间,浓度稀释至50ng/μl。
2、设计引物
根据桃基因组第2染色体的第4,467,346~4,467,380处存在35bp的缺失序列位点上、下游200bp序列(具体的核苷酸序列见表1),设计引物。
表1 35bp Indel旁侧序列信息
其中,W表示35bp Indel,即“GCGTCCAACTTTGCCGAACCCATCCCCATGCGAGG”。
引物由生物技术公司合成后,稀释PCR扩增上、下游引物至终浓度均为10.0μM。PCR标记引物序列见表2,扩增产物为分别含有161bp和196bp的单带或者同时含有二者的双带。
表2引物序列
3、PCR反应体系及电泳检测
(1)首先是配制PCR扩增体系,见表3。
表3PCR扩增反应组分
其中,Primer Mix为PCR扩增上游引物和下游引物各加入0.2μl。
(2)将上述试剂转移到PCR管或板中,PCR扩增程序如下:94℃ 4min;94℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 30s,共35个循环;72℃ 10min;4℃保存。
(3)配制1%琼脂糖凝胶,对PCR反应后的产物进行电泳,并对电泳结果进行条带统计。统计中凡是出现161bp单带或同时含有161bp和196bp双带的,即种质分型对应为抗南方根结线虫的桃种质;出现196bp单带的,即种质对应的为感病桃种质。
实施例3利用桃树抗南方根结线虫Indel位点开发的PCR标记对桃种质表型性状的验证
1、实验材料的选择
以郑州果树研究所资源圃中构建‘红根甘肃桃1号’与‘贝蕾’杂交后代F1自交产生构建的F2代250份自交群体种质为实验材料。
2、利用与桃树抗南方根结线虫性状关联的Indel位点开发的标记进行表型预测的鉴定方法
以本发明桃基因组第2染色体的第4,467,346~4,467,380处上、下游各200bp序列开发的一对PCR引物,对250份自交群体试材的抗病/感病性状进行鉴定,具体的鉴定方法参照实施例2的方法。
3、自交群体中分型结果对表型的预测
表4和图1显示了本发明开发的桃树抗南方根结线虫病/感病性状Indel标记位点对250份F2代自交群体的鉴定结果。从表4和图1可以看出,本发明针对桃树抗南方根结线虫病与感病表型准确率高达100.00%。另外,本发明在试验过程中在第4,467,346~4,467,380处Indel旁侧发现20个SNPs和1个3个碱基(CCA)的Indel,但在250份F2代中验证准确率均在90%以下。
表4桃树抗南方根结线虫病/感病的Indel标记位点在群体的分型及表型预测准确率
综上所述,本发明的Indel标记位点能够帮助实现利用桃幼苗DNA早期预测桃树抗南方根结线虫病/感病的目的,该方法是利用BSA结合二代测序得到的244万个以上SNPs中进行分析得到连锁区间,并选择Indel标记开发而来,标记数量大,定位区间精确,因此该标记预测表型的准确率也很高。
以上所述仅为本发明最佳的实施例,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的标记位点、引物对、试剂盒及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 435
<212> DNA
<213> 桃(Amygdalus persica L.)
<400> 1
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cccacttctg ccagtgtggc tcccacccac cccatacgag taatttgaag aagtccacca 180
acaacttctc aaaagctctt gcgtccaact ttgccgaacc catccccatg cgaggccgta 240
gaaaagtttt cagccacaga aaaagaagga acagtacttg aaagaggggt ttaccaaggc 300
aagattacaa gtttatgtta tctacactct taaaaagctt ccatacttgt ttacaaacct 360
gtatttccaa gttgtgctag cctagcttca tccaaatccc ttgcagtctg cagagaagat 420
aaaagacatg gcttt 435
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
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<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
acataaactt gtaatcttgc cttg 24
Claims (10)
1.用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的标记位点,其特征在于,所述的标记位点是桃基因组第2染色体的第4,467,346~4,467,380处多态性Indel位点,该位点长35bp,序列为GCGTCCAACTTTGCCGAACCCATCCCCATGCGAGG。
2.用于鉴定桃树对南方根结线虫的抗病/感病性状的PCR扩增引物对,其特征在于,所述引物对中的上游引物是根据桃基因组第2染色体的第4,467,346~4,467,380处存在35bp的Indel位点的上游200bp序列进行设计,所述引物对中的下游引物是根据第2染色体的第4,467,346~4,467,380处存在35bp的Indel位点的下游200bp进行设计。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的PCR扩增引物对,其特征在于,所述引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成。
4.一种权利要求1所述的标记位点在桃树对南方根结线虫抗病/感病性状中标记辅助选择育种方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的标记位点在鉴定或辅助鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状中的应用。
6.用于鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括权利要求2或3所述的PCR扩增引物对。
7.一种权利要求6所述的试剂盒在桃树对南方根结线虫抗病/感病性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
8.一种利用权利要求1所述标记位点鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)PCR扩增:以待测桃的基因组DNA为模板,用PCR扩增引物对进行PCR扩增,获得PCR扩增产物;
(2)琼脂糖电泳:将完成扩增反应的产物进行1%琼脂糖电泳,统计条带类型及大小;
(3)基因分型:根据条带类型及大小情况判定种质的基因分型,预测表型。
9.根据权利要求8所述标记位点鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的方法,其特征在于,所述引物对由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的两条单链DNA分子组成。
10.根据权利要求8所述标记位点鉴定桃树对南方根结线虫抗病/感病性状的方法,其特征在于,当条带出现161bp单带或同时含有161bp和196bp双带的,种质分型对应为抗南方根结线虫的桃种质;当条带出现196bp单带的,种质分型对应为感病桃种质。
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