CN109913575A - 一种鉴定辣椒cms雄性不育恢复基因的kasp分子标记、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴定辣椒CMS雄性不育恢复基因的KASP分子标记、试剂盒及其应用，涉及分子标记辅助育种技术领域，所述KASP分子标记由包括上游引物F1、上游引物F2和下游引物R的引物组扩增得到。利用本发明所述KASP分子标记可快速完成对辣椒CMS分离群体中的育性鉴定，快速判断辣椒是否含有CMS育性恢复基因，可进行批量实验，节省了大量人力，特别适用于大量样本的操作。本发明提供了鉴别辣椒CMS恢复基因的试剂盒以及鉴别方法准确性高。

Description

一种鉴定辣椒CMS雄性不育恢复基因的KASP分子标记、试剂盒 及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及一种鉴定辣椒CMS雄性不育恢复基因的KASP分子标记、试剂盒及其应用。

背景技术

辣椒利用CMS(Cytoplasmic male sterility)三系配套制种可以省去人工去雄，提高种子纯度，同时有利于知识产权的保护。但是，如果父本的育性恢复力不强，则会严重影响F1的果形和产量(王立浩，2007)。因此，选育恢复性强、配合力高、农艺性状优良的恢复系(父本)成为辣椒CMS在杂种优势利用中急需解决的主要问题之一(沈火林和石正强，2002)。传统的辣椒CMS育性基因选择是根据测交组合的育性表现进行筛选。分子标记辅助选择可直接反映不同材料DNA的多态性差异，并且选择不受时间和环境的影响(华明艳等，2008)。通过育性紧密连锁的分子标记直接进行育性基因的选择，可以有效加快恢复系的筛选进程。目前，分子标记辅助育种技术已在多种作物的CMS恢复系选育中得到应用，在杂交后代(或花药再生植株)苗期鉴定有Rf基因的个体，短时间内即可在室内检测大量样品，显著提高育种的选择效率(王俊霞等,2000；刘保申等,2002；华明艳等,2008)。众多研究认为辣椒育性恢复是由主效恢复基因Rf控制，另外还受修饰基因和环境因素的影响(Zhang etal.,2000；GμLyas et al.,2006)。

Zhang等(2000)采用RAPD技术发现位于Rf基因两侧的标记OP131400(0.37cM)和OW19800(8.12cM)；Kim(2005)将分子标记OPP131400转化为更容易操作的OPP13-CAPS(HinfI)标记，此标记为显性标记且通用性较强。Lee等(2004)和GμLyas等(2006)利用与Rf基因连锁的RAPD标记OPT-02/570(5cM)开发出一个STS标记CRF-SCAR。Kim等(2006)成功地将AFLP标记AFRF8转化成一个与Rf基因紧密连锁的共显性CAPS标记AFRF8CAPS(1.8cM)。Lee等(2008a)发现在辣椒中存在部分可育(pr)现象，利用AFLP-BSA方法开发出1个与pr基因连锁的分子标记PR-CAPS(1.8cM)，可用于部分育性材料的去除。常彩涛等(2005)利用BSA分析法筛选得到PCR标记S4181515，并证明其能用于候选育性材料的初筛。Min等(2009)利用AFLP技术开发了3个与Rf基因连锁的标记AFRF1、AFRF3和AFRF4，并转化为可用于PCR的标记类型。杨娟等(2010)发现AF208834标记与Rf基因连锁，遗传距离为20.8cm。Jo等(2010)利用矮牵牛Rf基因筛选辣椒BAC文库开发出连锁标记BAC13T7SCAR(1.4cM)。吴国平等(2012)以甜椒为试材，利用SRAP分子标记技术筛选得到一个与甜椒恢复基因相关的分子标记，并成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。

米志波等(2015)利用36份已知基因型(RfRf或rfrf)的辣椒自交系对11对已报道的辣椒恢复基因连锁标记进行适用性检验，发现显性标记CRF3S1S和CRF-SCAR的适用性最广，其准确率分别为91.67％、88.89％；在6对共显性标记中CaRf-FL-M2的适用性最广，其准确率为80.56％。育种实际应用中可以首先利用显性标记CRF3S1S或者CRF-SCAR对辣椒材料进行初次鉴定，对其中含有Rf基因的辣椒材料利用共显性标记CaRf-FL-M2再次进行鉴定。李怡斐等(2016)利用已报道的9个与辣椒恢复基因连锁的标记对加工型辣椒CMS不育系83-3A、恢复系812、F1(83-3A×812)、F1'(F1×83-3B)与保持系83-3B回交群体进行试验，发现CRF-SCAR、PR-CAPS和OPP13-CAPS标记与CMS育性恢复基因Rf紧密连锁，但标记CRF-SCAR不需要酶切，通过PCR产物电泳就能鉴定加工型辣椒材料中是否含有恢复基因，且对回交群体辣椒育性鉴定准确度可以达到100％。

SNP作为第三代分子标记技术，其在生物基因组中分布广泛、数目多且相对稳定，是物种中不同个体表型变异的主要遗传来源，是构建生物高通量基因分型最适合的标记，而且SNP标记技术易于自动化、高通量的检测分析。但是由于SNP是单核苷酸变异产生的多态性，所以不能使用常规的PCR技术与凝胶电泳技术来区分其多态性。而使用测序技术来分析SNP位点，这样虽然标记密度高，但是成本也相对很高，而且很耗时。近几年来，由LGC公司开发的竞争性等位基因特异PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)技术，因其经济灵活的特点，作为国际上主流SNP检测方法之一，替代传统的高通量测序，在SNP分型研究中发挥重要作用。

发明内容

本发明在对辣椒CMS雄性不育恢复基因精细定位的基础上，结合转录组测序技术和重测序技术，研究和开发了一种与辣椒CMS雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记和试剂盒，在不同遗传背景的分离群体汇总均得到了标记有效性的验证。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鉴定CMS辣椒雄性不育恢复基因KASP分子标记，所述KASP分子标记由包括上游引物F1、上游引物F2和下游引物R构成的引物组扩增得到；

所述上游引物F1的核酸序列为SEQ ID NO.1所示；

所述上游引物F2的核酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物R的核酸序列为SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种鉴别辣椒CMS恢复基因的试剂盒，包括：上游引物F1、F2，下游引物R，荧光探针和PCR反应试剂；

所述上游引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述上游引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述荧光探针为两种不同的荧光探针；所述上游引物和下游引物用于扩增上述技术方案所述的KASP分子标记

优选的，所述荧光探针包括FAM、VIAfluorescein、FITC、TET、HEX、JOE、R110、TAMRA、Texas Red和BODIPY中的任意两种。

优选的，所述PCR反应试剂包括2x Mastermix和去离子水。

本发明还提供了前述技术方案所述的KASP分子标记或上述技术方案所述试剂盒在鉴别辣椒CMS分离群体中恢复基因单株的应用。

本发明还提供了前述技术方案所述的KASP分子标记或前述技术方案试剂盒在判断辣椒种质资源是否含有CMS恢复基因中的应用。

本发明还提供了前述技术方案所述的KASP分子标记或前述技术方案所述试剂盒所述的KASP分子标记在鉴定辣椒三系杂交种纯度中的应用。

优选的，利用KASP分子标记或试剂盒进行鉴别的方法，包括以下步骤：

(1)将两种不同的荧光探针分别标记上游引物F1和F2，得到荧光标记的F1和F2；

(2)提取待测辣椒的基因组DNA；

(3)将荧光标记的F1和F2、下游引物R、基因组DNA以及PCR反应试剂混合，进行PCR反应，以扩增前述技术方案所述的KASP分子标记；

(4)采用具有FRET功能的仪器检测PCR反应结束的样品的荧光信号，分别以标记F1和F2的荧光信号为横纵坐标绘制荧光信号坐标，接近标记F1的荧光信号坐标轴的判断为雄性不育样品，接近标记F2的荧光信号坐标轴的判断为纯合可育样品，接近横纵坐标对角线的判断为杂合可育样品；

所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的先后。

优选的，所述PCR反应的试剂以5μL总体积计，包括：基因组DNA 2.5μL、2xMastermix 2.5μL、上下游引物混合物共0.07μL和余量的水。

优选的，所述PCR反应的反应程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火1min，每循环降低0.6℃、共10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26～29个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1)快速准确：利用本发明提供的分子标记可快速完成对辣椒CMS分离群体中的育性鉴定，快速判断辣椒是否含有CMS育性恢复基因，2h以内就可完成96～384个样品的基因分型，可进行批量实验，节省了大量人力，特别适用于大量样本的操作。

2)标记稳定：本发明提供的鉴别辣椒CMS恢复基因的试剂盒以及鉴别方法准确性高，采用荧光定量PCR和本发明所述方法对多个CMS分离群体和三系辣椒杂种进行验证，采用本发明所述分子标记鉴定的结果和遗传分析结果完全一致。

3)本发明所述的试剂盒仅需要进行一次PCR扩增即可完成检测，准确高效。

附图说明

图1为实施例1中利用荧光定量PCR仪LC480II对由15个单株组成的辣椒三系分离群体的KASP检测结果；

图2为实施例2中利用LGC公司的SNPline基因分型平台对由384份辣椒种质资源的KASP检测结果。

具体实施方式

在辣椒Rf恢复基因精细定位、RNA转录组测序和重测序的基础上，本发明基于Rf候选基因Capana06g003028内部存在的SNP位点A/T碱基的序列差异，提供了一种鉴定CMS辣椒雄性不育恢复基因KASP分子标记，所述KASP分子标记由包括上游引物F1、上游引物F2和下游引物R构成的引物组扩增得到；

所述上游引物F1的核酸序列为SEQ ID NO.1所示；

所述上游引物F2的核酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物R的核酸序列为SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1：AAGATCTGTGAGCCCAACGA；

SEQ ID NO.2：AAGATCTGTGAGCCCAACGT；

SEQ ID NO.3：CCCTTTTGCTGAGTCCATTC。

本发明还提供了一种鉴别辣椒CMS恢复基因的试剂盒，包括：上游引物F1、F2，下游引物R，荧光探针和PCR反应试剂；

所述上游引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

所述上游引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

所述荧光探针为两种不同的荧光探针；所述上游引物和下游引物用于扩增上述技术方案所述的KASP分子标记。

在本发明中，所述上游引物F1和F2仅在3’端第一位存在差异，设计两种不同的上游引物目的是利用LGC公司的KASP技术，即竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR)对SNP位点进行精准的双等位基因判断。

在本发明中，所述荧光探针包括但不限于FAM、VIAfluorescein、FITC、TET、HEX、JOE、R110、TAMRA、Texas Red和BODIPY中的任意两种。本发明所述的荧光探针用于标记上游引物F1和F2，进而在检测时产生不同的荧光。

在本发明中，所述PCR反应试剂包括2x Master mix和去离子水。在本发明的具体实施方式中，2x Master mix购自LGC公司。

本发明提供了前述技术方案所述的KASP分子标记或上述技术方案所述试剂盒在鉴别辣椒CMS分离群体中恢复基因单株的应用。本发明所述KASP分子标记与辣椒的雄性不育恢复基因紧密连锁，通过检测辣椒CMS分离群体中是否含有KASP分子标记即可鉴别该群体中含有恢复基因的单株，进而将含有恢复基因的单株分离，加速育种进程。

本发明提供了前述技术方案所述的KASP分子标记或前述技术方案所述试剂盒在判断辣椒种质资源是否含有CMS恢复基因中的应用。本发明所述KASP分子标记与辣椒的雄性不育恢复基因紧密连锁，通过检测辣椒种质资源是否含有本发明所述的KASP分子标记，能够快速的从辣椒种质资源中筛选出带有恢复基因的品种，更为快捷的筛选到辣椒恢复系。

本发明提供了前述技术方案所述的KASP分子标记或前述技术方案所述试剂盒在鉴定辣椒三系杂交种纯度中的应用。本发明所述KASP分子标记与辣椒的雄性不育恢复基因紧密连锁，通过检测本发明所述KASP杂合分子标记在辣椒三系杂交种子中的百分比，可有效判断其纯度和杂合程度。

具体的，利用本发明所述KASP分子标记或试剂盒鉴别辣椒CMS恢复基因的方法，包括以下步骤：

(1)将两种不同的荧光探针分别标记上游引物F1和F2，得到荧光标记的F1和F2；

(2)提取待测辣椒的基因组DNA；

(3)将荧光标记的F1和F2、下游引物R、基因组DNA以及PCR反应试剂混合，进行PCR反应，以扩增前述技术方案所述的KASP分子标记；

(4)采用具有FRET功能的仪器检测PCR反应结束的样品的荧光信号，分别以标记F1和F2的荧光信号为横纵坐标绘制荧光信号坐标，接近标记F1的荧光信号坐标轴的判断为雄性不育样品，接近标记F2的荧光信号坐标轴的判断为纯合可育样品，接近横纵坐标对角线的判断为杂合可育样品；

所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的先后。

本发明将两种不同的荧光探针分别标记上游引物F1和F2，得到荧光标记的F1和F2。在本发明的具体实施例中，采用FAM荧光标签标记上游引物F1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；采用VIC荧光标签标记上游引物F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.4：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGATCTGTGAGCCCAACGA

SEQ ID NO.5：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGATCTGTGAGCCCAACGT

注：划线部分为荧光标签。

本发明提取待测辣椒的基因组DNA。在本发明中，所述基因组DNA的浓度优选为80～100ng/μL，更优选为85～95ng/μL。本发明对基因组DNA提取的方法没有特殊限定，采用本领域已知的方法即可。

得到荧光标记的上游引物F1和F2、待测辣椒的基因组DNA后，本发明将荧光标记的F1和F2、下游引物R、基因组DNA以及PCR反应试剂混合，进行PCR反应。

在本发明中，将荧光标记的F1和F2、下游引物R、基因组DNA以及PCR反应试剂混合后，先将混合物封膜并离心，而后再进行PCR反应。离心的目的是使PCR反应组分沉降到管底。在本发明中，所述离心的转速优选为800～100r/min，更优选为900r/min；所述离心的时间优选为20～60s，更优选为30s。

在本发明中，所述PCR的方法可根据选用的不同仪器进行选择，包括但不限于荧光定量PCR或水浴PCR。在本发明的具体实施方式中，水浴PCR利用机械臂移动样品蓝在三个不同温度的水浴槽中，无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件，而且每次反应检测的样品数量多，便于大量样品的高通量检测。

在本发明中，所述PCR反应的试剂以5μL总体积计，优选的包括：基因组DNA2.5μL、2x Mastermix 2.5μL、上下游引物混合物共0.07μL和余量的水。

在本发明中，所述PCR反应的反应程序优选的包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火1min，每循环降低0.6℃、共10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26～29个循环。

PCR反应结束后，本发明采用具有FRET功能的仪器检测PCR反应结束的样品的荧光信号，分别以标记F1和F2的荧光信号为横纵坐标绘制荧光信号坐标，接近标记F1的荧光信号坐标轴的判断为雄性不育样品，接近标记F2的荧光信号坐标轴的判断为纯合可育样品，接近横纵坐标对角线的判断为杂合可育样品。

在本发明中，具有FRET功能的仪器包括但不限于LGC公司的SNPline基因分型平台。

采用本发明提供的KASP分子标记及其试剂盒可以进行大批量的样品分析，检测结果快速准确，使用方便，适宜大规模推广应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以编号为PC324的朝天椒为例，从其F2代遗传分离群体选择15个单株(其中，5株不育，3株纯合可育，7株杂合可育)作为实验材料对KASP标记的可靠性进行测试。

1、2X CTAB法提取被检测辣椒的基因组总DNA，用Nanodrop测量样品DNA浓度，调整样本DNA终浓度为80～100ng/μL。

2、随后进行5μLPCR体系构建：包含步骤1得到的样本DNA2.5μL，浓度50μM混合引物0.07μL和2x Mastermix 2.5μL；其中混合引物包括下述三个引物等比例混合：

荧光标记的上游引物F1(SEQ ID NO.4)：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGATCTGTGAGCCCAACGA

荧光标记的上游引物F2(SEQ ID NO.5)：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGATCTGTGAGCCCAACGT

下游引物R(SEQ ID NO.3)：

SEQ ID NO.3：CCCTTTTGCTGAGTCCATTC。

3、将将PCR体系加入PCR孔板后封膜，800～1000r/min离心30s，随后在利用荧光定量PCR仪上LC480II进行PCR反应；PCR程序包：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火1min(每一个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26-29个循环，最后在37℃条件下读取荧光信号；

4、在X轴FAM(荧光465-510)和Y轴VIC(荧光533-580)条件下分析荧光信号，结果如图1所示：15个样品可以分为3种类型，蓝色标记样品表明为雄性不育样品，位于图片的右下方；绿色标记样品表明为纯合可育样品，位于图片的左上方；红色标记样品为杂合可育样品，位于x轴和y轴对角线附近(图1)。KASP标记结果与育性鉴定结果完全一致，说明标记的有效性。

实施例2

利用LGC公司SNPline基因分型平台，选取384株不同类型辣椒材料作为实验材料，对KASP标记的可靠性进行测试。

1、2X CTAB法提取被检测辣椒的基因组总DNA，用Nanodrop测量样品DNA浓度，调整样本DNA终浓度为80～100ng/μL；

2、在LGC公司SNPline上进行5μLPCR体系构建：包含步骤1处理得到的待试样本DNA2.5μL，浓度50μM混合引物0.14μL和2x Master mix5μL；其中混合引物包括下述三个引物等比例混合：

荧光标记的上游引物F1(SEQ ID NO.4)：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGATCTGTGAGCCCAACGA

荧光标记的上游引物F2(SEQ ID NO.5)：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGATCTGTGAGCCCAACGT

下游引物R(SEQ ID NO.3)：

SEQ ID NO.3：CCCTTTTGCTGAGTCCATTC。

3、将PCR体系加入96孔板后封膜，800～1000r/min离心30s，随后在LGC公司SNPline上进行如下反应，PCR程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火1min(每一个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26～29个循环，最后在37℃条件下读取荧光信号；

4、检测结果如图2所示，检测出的样品可以分为3种类型，蓝色标记样品表明为雄性不育样品，位于图片的右下方；绿色标记样品表明为纯合可育样品，位于图片的左上方；红色标记样品为杂合可育样品，位于x轴和y轴对角线附近。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南省农业科学院园艺研究所

<120> 一种鉴定辣椒CMS雄性不育恢复基因的KASP分子标记、试剂盒及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagatctgtg agcccaacga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagatctgtg agcccaacgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccttttgct gagtccattc 20

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc taagatctgt gagcccaacg a 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat taagatctgt gagcccaacg t 41

Claims (10)

1.一种鉴定CMS辣椒雄性不育恢复基因KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记由包括上游引物F1、上游引物F2和下游引物R的引物组扩增得到；

所述上游引物F1的核酸序列为SEQ ID NO.1所示；

所述上游引物F2的核酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物R的核酸序列为SEQ ID NO.3所示。

2.一种鉴别辣椒CMS恢复基因的试剂盒，其特征在于，包括：上游引物F1、F2，下游引物R，荧光探针和PCR反应试剂；

所述上游引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述上游引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述荧光探针为两种不同的荧光探针；所述上游引物和下游引物用于扩增权利要求1所述的KASP分子标记。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针包括FAM、VIAfluorescein、FITC、TET、HEX、JOE、R110、TAMRA、Texas Red和BODIPY中的任意两种。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括2x Master mix和去离子水。

5.权利要求1所述的KASP分子标记或权利要求2～4所述试剂盒在鉴别辣椒CMS分离群体中恢复基因单株的应用。

6.权利要求1所述的KASP分子标记或权利要求2～4所述试剂盒在判断辣椒种质资源是否含有CMS恢复基因中的应用。

7.权利要求1所述的KASP分子标记或权利要求2～4所述试剂盒所述的KASP分子标记在鉴定辣椒三系杂交种纯度中的应用。

8.根据权利要求5～7任意一项所述的应用，其特征在于，利用KASP分子标记或试剂盒进行鉴别的方法，包括以下步骤：

(1)将两种不同的荧光探针分别标记上游引物F1和F2，得到荧光标记的F1和F2；

(2)提取待测辣椒的基因组DNA；

(3)将荧光标记的F1和F2、下游引物R、基因组DNA以及PCR反应试剂混合，进行PCR反应，以扩增权利要求1所述的KASP分子标记；

(4)采用具有FRET功能的仪器检测PCR反应结束的样品的荧光信号，分别以标记F1和F2的荧光信号为横纵坐标绘制荧光信号坐标，接近标记F1的荧光信号坐标轴的判断为雄性不育样品，接近标记F2的荧光信号坐标轴的判断为纯合可育样品，接近横纵坐标对角线的判断为杂合可育样品；

所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的先后。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述PCR反应的试剂以5μL总体积计，包括：基因组DNA 2.5μL、2x Master mix 2.5μL、上下游引物混合物共0.07μL和余量的水。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述PCR反应的反应程序包括：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火1min，每循环降低0.6℃、共10个循环；94℃变性20s，55℃退火1min，26～29个循环。