CN109161605B

CN109161605B - 水稻抗稻瘟病基因Pi1的SNP分子标记的开发和应用

Info

Publication number: CN109161605B
Application number: CN201810344665.2A
Authority: CN
Inventors: 梁毅; 彭佩; 郑秀婷; 贺治洲; 石彦龙; 江南; 张凤勤
Original assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huazhi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN109161605A

Abstract

本发明提供了一组与水稻稻瘟病抗性基因Pi1紧密连锁的SNP分子标记，所述分子标记K_110573，K_110573的多态性为G或A。利用所述的分子标记，可以快速、精确的检测Pi1基因，大幅提高该基因在水稻育种中的选择效率。检测过程不需要酶切、电泳及测序等，操作简便，可以实现商业化的高通量快速检测，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染、EB对环境的污染以及甲醛对人体的危害。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pi1的SNP分子标记的开发和应用

技术领域：

本发明涉及水稻育种领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pi1的SNP分子标记的开发和应用。

背景技术：

由稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻瘟病是一种世界性的稻作病害，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失可达11％～30％，长期实践表明，培育抗病品种(系)是目前防治稻瘟病最经济有效的方法。近几十年来，随着分子遗传学的发展，水稻抗病育种已从常规接种鉴定过渡到分子标记辅助育种，利用分子标记辅助选择含有目标基因的单株进行杂交，能够精准进行目标性状的选育，且能减小选育群体规模，缩短育种年限，节约育种成本。

在分子标记辅助选择中起重要作用的分子标记，至今为止经历从第一代技术到第三代技术的发展，第一代分子标记的代表是RFLP，即限制性片段长度多态性；第二代分子标记的代表是SSR和STR，即简单序列重复，目前还广泛应用；第三代分子标记的代表是SNP，即单核苷酸多态性，它是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的一种DNA序列多态性，具有分布密度高，遗传稳定性好，易于分型，适于快速、规模化筛查等特点。目前SNP标记主要通过基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术和焦磷酸测序法等进行基因分型，而KASP技术是利用通用荧光探针，通过简单的touch-down PCR的方法实现分型，其经济灵活的特点，作为国际上主流SNP检测方法之一，替代传统的高通量测序，在SNP分型研究中发挥重要作用。

抗稻瘟病基因Pi1源自利比亚粳稻“LAC23”，位于水稻第11染色体长臂近端粒处，是水稻主效抗稻瘟病基因之一，对稻瘟病菌IK81-3，PO6-6等有较强的叶瘟抗性。研究结果显示，Pi1基因定位在标记CRG11-7和K28之间的277kb的区间内，抗性由2个紧密连锁、具有独立功能的NBS-LRR基因协同作用，与Pi-k、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p同为复等位基因。

目前，检测Pi1基因所用的标记多为RFLP和SSR标记，与Pi1基因存在一定的物理距离，检测结果易引起误判，RFLP和SSR标记只能用于特定亲本组合间的多态性分析，不适合大规模的种质资源鉴定或抗性资源筛选。

因此，现有技术中亟需一种与水稻稻瘟病抗性基因Pi1紧密连锁且检测方便快速的SNP标记。

发明内容：

针对上述情况，本发明提供了与水稻稻瘟病抗性基因Pi1紧密连锁的SNP标记，利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，可实现大规模的种质资源Pi1基因鉴定和稻瘟病抗性资源筛选。

首先，由于Pi1基因已经被克隆，根据文献将Pi1基因位置确定在水稻11号染色体的27984697-27989134区间，利用Pi1的供体材料与非供体材料的重测序数据对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。

具体的，标记的开发流程为：

(1)已克隆目标基因Pi1；(2)根据基因登录号确定物理区间；(3)数据库提取SNP位点；(4)标记设计和合成；(5)标记筛选测试；(6)表型验证。

经上述SNP位点的研究过程，申请人发现与Pi1基因紧密连锁的SNP标记K_110573，所述SNP标记K_110573的特异性位点位于水稻11号染色体27996426位(MSU7.0 position)，其位点特异性为G/A。

当两条染色体特异性位点均为碱基G，则水稻样品含有纯合的Pi1基因，表现为稻瘟病抗性；当两条染色体特异性位点均为碱基A，则水稻样品含有纯合的pi1基因，表现为稻瘟病易感。

优选的，所述SNP标记K_110573的序列为SEQ ID NO.4。

SEQ ID NO.4的序列为：

CACTCTATAAGTACCAAATCTTTGCGTTGCAATTGGACAATCATAATATC[A/G]ACGTATGATTGCCCCAATCACAAAGAGATAAAGGAATAGCACGCTTACAC。

本发明还提供了两对引物，用于检测所述SNP标记K_110573的特异性位点，所述两对引物分别为：

第一对引物：

正向引物：SEQ ID NO.1：ATTGGGGCAATCATACGTC；

反向引物：SEQ ID NO.3：AAGTACCAAATCTTTGCGTTG。

第二对引物：

正向引物：SEQ ID NO.2：ATTGGGGCAATCATACGTT；

反向引物：SEQ ID NO.3：AAGTACCAAATCTTTGCGTTG。

进一步的，本发明中利用基于KASP反应原理及材料的单碱基差异设计的标记能高通量的对水稻材料进行Pi1基因检测。

每个标记由三条引物组成，两条特异性引物5’端分别连接LGC公司KASP反应试剂特定的荧光接头序列，一条通用引物。引物信息如表1所示。

表1：引物信息

根据KASP的检测结果，如果样品PCR产物只检测到引物PrimerX对应荧光信号，则检测位点为碱基G，判定测试的水稻样品含有纯合的Pi1基因；若只检测到引物PrimerY对应荧光信号，则检测位点为碱基A，判定测试的水稻样品含有纯合的pi1基因；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为A：G，判断待测水稻含有杂合的Pi1基因。

本发明的另一方面，提供一种检测水稻Pi1基因的方法，检测方法包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用K_110573标记的引物组，对K_110573分子标记进行检测；

S3、如果K_110573的SNP位点碱基为A，判定测试的水稻样品含有纯合的pi1基因；若检测位点碱基为G，判定测试的水稻样品含有纯合的Pi1基因；若检测位点同时检测到A、G，判断待测水稻含有杂合的Pi1基因。

优选的，S1中，从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

优选的，S2中，采用KASP技术对SNP位点进行检测。其中，两条特异性引物分别为SEQ ID NO.1：ATTGGGGCAATCATACGTC，SEQ ID NO.2：ATTGGGGCAATCATACGTT，5’端分别连接不同的荧光接头序列。所述荧光接头序列为LGC公司的FAM或HEX接头序列。

优选的，S2中，通用引物为SEQ ID NO.3：AAGTACCAAATCTTTGCGTTG。

优选的，S2中KASP反应体系如表3所示。所述KASP Master Mix试剂，以及与其配套使用的LGC SNPline基因分型平台均购于英国LGC公司。

本发明的另一方面，提供了一种水稻育种的方法，检测水稻样品11号染色体27996426位(MSU7.0 position)位点的碱基，选择位点为G的水稻样品进行育种。

本发明的另一方面，提供了一种上述分子标记在水稻育种中的应用，利用K_110573分子标记进行检测，选择携带有Pi1基因的水稻品系进行后续育种。

本发明的另一方面，提供了一种检测Pi1基因SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO.1-3的引物序列。

优选的，每种分子标记的特异性引物5’端分别连接不同的荧光序列。所述荧光序列可以为FAM和HEX荧光序列。

所述试剂盒用于水稻育种。

本发明的另一方面，提供了一种基因芯片，所述基因芯片包含SEQ ID NO.1-3的引物序列。

本发明的有益效果为：本发明开发的SNP标记与Pi1基因紧密连锁，经过分离群体稻瘟病表型鉴定后，验证开发的SNP标记表型选择效率达到90％，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测抗稻瘟病基因Pi1。本发明利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，KASP技术流程中DNA抽提、PCR体系构建和荧光信号检测等基本自动化，可实现96，384，1536孔板高通量检测，适用于大规模、高通量的Pi1基因鉴定和稻瘟病抗性资源筛选。本发明在操作过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择和背景选择，提高背景回复率，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于Pi1基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为标记K_110573检测一部分自然群体分型图；

图2为标记K_110573检测另一部分自然群体分型图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。

在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1引物设计

根据相关文献将Pi1基因位置确定在水稻11号染色体的27984697-27989134区间，利用Pi1的供体材料与非供体材料的重测序数据对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。每组标记有三条引物如表2所示，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。

表2引物信息

实施例2样品检测

DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

KASP反应：KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表3。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，TouchdownPCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

表3：KASP检测的反应体系

	终浓度	体积(ul)
			100UM Primer C	0.42μM	0.0125
100UM Primer X	0.17μM	0.0050
			100UM Primer Y	0.17μM	0.0050
2x KASP Master Mix	1x	1.4792
			超纯水		1.4983
总体积		3

标记分型数据：

根据上述检测方法，用标记K_110573对含有Pi1基因的水稻品种BL6和其它不含Pi1的21个水稻品种进行KASP初筛反应验证，结果如表4。含Pi1基因的水稻品种在K_110573测试位点检测结果均为碱基G，除了3份Pi1的等位基因的供体，其他3份抗稻瘟病基因供体和15份稻瘟病感病材料均在测试位点检测出碱基A，证明了本发明对Pi1基因检测的准确性。

表4标记K_110573初筛分型数据

实施例3自然群体与遗传分离群体验证

为检测本发明中标记的特异性和实用性，利用190份材料对SNP标记K_110573进行自然群体验证。190份材料中包括已知含纯合Pi1基因的品种，含有其他稻瘟病基因供体、普感材料、常见杂交稻、核心水稻育种材料和核心育种材料构建的F1。标记在自然群体分型结果如图1和图2所示，5份已知含Pi1基因的品种检测为具有稻瘟病抗性的纯合Pi1基因型，其他抗稻瘟病基因供体、普感材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料共165份含有感病纯合pi1基因型，核心育种材料构建的F1未检出杂合Pi1基因型。可见，SNP标记K_110573检测Pi1基因位点特异性较好，可便捷高效的用于鉴定水稻品种中是否含有Pi1基因。

遗传分离群体验证：

利用供体亲本IRBL1-LA[CO]和受体亲本南粳5055的F2：3家系对本发明中的标记K_110573进行表型验证。在水稻苗期，对20个F2：3家系及2个亲本接种稻瘟病菌株E2007046A2，调查病情，表型数据与基因型90％一致，再次验证了本发明的可行性和准确性，检测结果如表5所示。

表5遗传分离群体验证结果

应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 华智水稻生物技术有限公司

<120> 水稻抗稻瘟病基因Pi1的SNP分子标记的开发和应用

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

attggggcaa tcatacgtc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

attggggcaa tcatacgtt 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

aagtaccaaa tctttgcgtt g 21

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n=a 或 g

<400> 4

cactctataa gtaccaaatc tttgcgttgc aattggacaa tcataatatc nacgtatgat 60

tgccccaatc acaaagagat aaaggaatag cacgcttaca c 101

Claims

1.一种分离的与水稻稻瘟病抗性基因Pi1紧密连锁的SNP分子标记片段，所述片段的序列为SEQ ID NO .4，其中SNP多态性位点位于SEQ ID NO .4所示序列的第51位，其多态性碱基为G或A。

2.根据权利要求1所述的分子标记片段，其特征在于：所述SNP多态性位点位于水稻11号染色体27996426位碱基处。

3.权利要求1或2中任一项所述的SNP分子标记片段在水稻育种中的应用，其特征在于，当两条染色体上所述SNP多态性位点均为碱基G，则表现为稻瘟病抗性；当两条染色体上所述SNP多态性位点均为碱基A，则表现为稻瘟病易感。

4.一种水稻育种的方法，其特征在于，检测权利要求1或2中任一项所述的SNP分子标记片段，选择片段上所述SNP多态性位点为G的水稻样品进行育种。

5.一种引物组，其特征在于，用于检测权利要求1或2中任一项所述的SNP分子标记片段，所述引物组由特异性引物和通用引物组成，

特异性引物序列为：

Primer Seq Allele X，SEQ ID NO .1：ATTGGGGCAATCATACGTC

Primer Seq Allele Y，SEQ ID NO .2：ATTGGGGCAATCATACGTT

通用引物序列为：

SEQ ID NO .3：AAGTACCAAATCTTTGCGTTG。

6.根据权利要求5所述的引物组，其特征在于：特异性引物分别连接不同的荧光基团，所述荧光基团分别为FAM或HEX。

7.权利要求5-6中任一项所述引物组在水稻育种中的应用。

8.一种检测权利要求1-2中任一项所述的与水稻稻瘟病抗性基因Pi1紧密连锁的SNP分子标记片段的方法，其特征在于，检测方法包括如下步骤：

S1、提取水稻样品基因组DNA；

S2、以水稻基因组DNA为模板，利用权利要求5或6所述的引物组进行检测；

S3、如果SNP位点碱基为A，判定测试的水稻样品含有纯合的Pi1基因，为稻瘟病易感；若SNP位点碱基为G，判定测试的水稻样品含有纯合的Pi1基因，为稻瘟病抗性；若SNP位点同时检测到A、G，判断待测水稻含有杂合的Pi1基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：S2中，采用KASP技术对SNP位点进行检测，其中，两条特异性引物5’端分别连接不同的荧光基团。

10.一种试剂盒，所述试剂盒包括序列如SEQ ID NO .1、2和3所示的三条引物。