JP5750672B2 - 短稈コシヒカリ型の水稲品種ヒカリ新世紀のdna識別法 - Google Patents
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Description
本発明者は、短稈の在来種「十石」を利用してコシヒカリを短稈化した「ヒカリ新世紀」を開発し、2004年に品種登録された(水稲品種第12273号)。ヒカリ新世紀は、十石の半矮性遺伝子sd1を戻し交雑によってコシヒカリに導入したものと考えられている。
例えば、コシヒカリとの戻し交配を行ったsd1を持つ品種、例えば、「コシヒカリつくばSD1号」や「佐賀1号(ぴかいち)」であっても、マイクロサテライトマーカーによる識別が可能であった。
従って、十石sd1のSNPが公知であるにもかかわらず、本願出願以前に、それをイネ品種識別に利用する動機づけは全くなく、また、本発明者の知る限りにおいて、本願出願以前に、十石sd1のSNPをイネ品種識別に用いた報告はなかった。
十石sd1がSNPを有することが公知であったとしても、イネ品種の識別にSNPを利用することは、先述のとおり、本願出願時の本技術分野の当業者にとって全く意外なアプローチであって、この発想自体は、ヒカリ新世紀の識別がマイクロサテライトマーカーではできないという、本発明者の新規な知見があって初めてもたらされたものである。
従って、本発明は、公知のマイクロサテライトマーカーでは識別不可能であったヒカリ新世紀を正確に区別可能な識別方法を提供することにある。
[1]配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を含むことを特徴とする、ヒカリ新世紀の識別方法、
[2]配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を決定する工程、及び/又は、マイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程が遺伝子増幅法を使用する、請求項1に記載のヒカリ新世紀の識別方法、
[3]配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を、遺伝子増幅法を使用して同時に行う、請求項2に記載のヒカリ新世紀の識別方法、
[4]前記マイクロサテライトマーカーとして、MRG4653、MRG6545、RM153、RM253、MRG5375、MRG4931、RM264、RM144、RM72、及びRM6333からなる群から選んだ、少なくとも1つのマイクロサテライトマーカーを使用する、[1]〜[3]の識別方法、
[5]配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、281番目の塩基を含む10〜100の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド、
[6]配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、10〜100の連続した塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がt(281番目のtに対応)であるポリヌクレオチド、
[7]配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、10〜100の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がa(281番目のtに対応)であるポリヌクレオチド
に関する。
また、PCR法と同様な方法として、特異的に目的の遺伝子を増幅することができるものであれば、PCR法の替わりに、既知の他の遺伝子増幅法も使用することができる。
具体的には、配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を含むDNA断片を増幅可能なプライマーセットを用いてPCRを行った後、制限酵素PmaCI(認識部位=cac:gtg)により切断する。
配列番号1で表される塩基配列の277〜282番目の塩基配列(またはその対応塩基配列)が、ヒカリ新世紀ではcacgtgであるのに対して、コシヒカリではcacgggであるため、後述の実施例2に示すように、ヒカリ新世紀では2本のバンドが検出される(すなわち、制限酵素PmaCIで切断される)のに対して、コシヒカリでは1本のバンドのみが検出される(すなわち、制限酵素PmaCIで切断されない)。
具体的には、まず、配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を含むDNA断片を増幅可能なプライマーセットを用いてPCRを行う。
ヒカリ新世紀を識別するプローブとしては、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、281番目の塩基を含む10〜100(好ましくは15〜50、より好ましくは20〜30)の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。このプローブは、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのセンス鎖の281番目の塩基がtである場合に、それを鋳型とするPCR増幅産物とハイブリダイズするのに対して、前記塩基がt以外の塩基(特にg)である場合には、それを鋳型とするPCR増幅産物とハイブリダイズしない。従って、前記プローブを適当な手段で標識することにより、プローブのハイブリダイズの有無を容易に解析することができ、その結果に基づいて、ヒカリ新世紀であるか否かを判定することができる。
一方、コシヒカリで増幅産物が得られるプライマー(以下、コシヒカリ用プライマーと称する)としては、例えば、配列番号2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はg)において、10〜100の連続した塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がg(281番目のgに対応)であるポリヌクレオチド(フォワードプライマー)、あるいは、配列番号2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はg)において、10〜100の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がc(281番目のgに対応)であるポリヌクレオチド(リバースプライマー)を用いることができる。
各プライマーの塩基長は、10〜100である限り、特に限定されるものではないが、好ましくは15〜50、より好ましくは20〜30である。
ヒカリ新世紀用フォワードプライマーSD1JF(配列番号8):
5−ccgcgtgcgccacgcacgt−3
ヒカリ新世紀用リバースプライマーSD1JR(配列番号9):
5−cggacacctggaagaaca−3
コシヒカリ用フォワードプライマー(配列番号10):
5−ccgcgtgcgccacgcacgg−3
コシヒカリ用リバースプライマー(配列番号11):
5−cggacacctggaagaacc−3
一方、コシヒカリ用プライマーを用いてPCRを実施すると、識別する品種がコシヒカリである場合には、前記プライマーの3’末端塩基と鋳型DNAの判定用SNP部位とが塩基対を形成できるため、PCRによる増幅産物が得られるが、識別する品種がヒカリ新世紀である場合には、ミスマッチであるため、PCRによる増幅産物が得られない。
この場合のPCR条件は、プライマー配列の3’末端の特異性に依存する方法であるので、一般的な条件で実施することができる。また、検出方法も、PCR増幅産物の有無を確認できれば良いため、簡易な検出手段、例えば、3%アガロースゲル電気泳動により充分に検出することができる。
例えば、実施例に示すように、ヒカリ新世紀が有するSNPを判定するためには、フォワードプライマーF3(SD1F3)及びヒカリ新世紀用リバースプライマー(SD1JR)を使用すると、高感度かつ高精度に検出することができるので好ましく、更に、これらのプライマーは、他のマイクロサテライトマーカーを検出するためのマーカーと共存させて行うPCR(マルチプレックスPCR)にも使用できるので非常に有用である。
ヒカリ新世紀用フォワードプライマー(配列番号12):
5−ccgcgtgcgccacgcadgt−3
ヒカリ新世紀用リバースプライマー(配列番号13):
5−cggacacctggaagabca−3
コシヒカリ用フォワードプライマー(配列番号14):
5−ccgcgtgcgccacgcadgg−3
コシヒカリ用リバースプライマー(配列番号15):
5−cggacacctggaagabcc−3
(配列中、dは、c以外の塩基、すなわち、a、g、又はtであり、bは、a以外の塩基、すなわち、g、c、又はtである)
また、ASP−PCRにて、ヒカリ新世紀が有するSNPとそれに対応するコシヒカリが有する塩基を同時に検出する場合、上記のプライマーSD1F3とSD1JRとに加え、コシヒカリ用リバースプライマーを改変して作製したSD1NRMを組み合わせて使用することができる。前記SD1NRMは、コシヒカリ用リバースプライマーのbをcとし、SD1F3とSD1JRで増幅される塩基配列と容易に見分けられるようにするため、その5’側に3塩基付加したものである。例えば、実施例5に示すように、これらのプライマーを使用してマルチプレックスPCRが行え、簡便かつ正確に、十石型SNPと野生型配列を識別できるので好ましい。
SD1NRM(配列番号55):
5−gctcggacacctggaagaccc−3
表1に示す品種は、コシヒカリを除けば、十石に由来する品種である。表1に示す各マイクロサテライトマーカー毎に使用したプライマーセットの塩基配列を以下に示す。なお、下線で示す配列gtgtcttは、明瞭なバンド(ピーク)を得るために付加したテール配列である。また、付加するテール配列や使用するプライマーの標識の種類は、使用するマイクロサテライトマーカーの組み合わせやプライマーの組み合わせによって、適宜変更することができる。
MRG4653F(TexasRed標識)(配列番号16):
5−tgatttctcggacaagcatgatct−3
MRG4653R(配列番号17):
5−gtgtcttcgagctaccaaccgatgcagat−3
MRG6545F(TexasRed標識)(配列番号18):
5−tccgctccgttttcatcccaatag−3
MRG6545R2(配列番号19):
5−gtgtcttcatgggaggggggggtgtagaa−3
RM153F(TexasRed標識)(配列番号20):
5−gcctcgagcatcatcatcag−3
RM153R11(配列番号21):
5−gtgtctttgccgaactcgatcaacctgcactt−3
RM253F(TexasRed標識)(配列番号22):
5−tccttcaagagtgcaaaccttaatac−3
RM253R(配列番号23):
5−gcattgtcatgtcgaagccgttctac−3
MRG5375F(FITC標識)(配列番号24):
5−gaatggaacgacaagagatgcacgt−3
MRG5375R(配列番号25):
5−gtgtcttgtgcttttcgtatccaccttcggg−3
MRG4931F2(FITC標識)(配列番号26):
5−acaaaagcgaagggaggcggtg−3
MRG4931R1(配列番号27):
5−gtgtctttggtaatatgggcggctgttttag−3
MRG6288F(FITC標識)(配列番号28):
5−acaagataatagacaacatgtctcaaatact−3
MRG6288R(配列番号29):
5−gtgtctttatgtggcagtttaagagcgtttc−3
RM223F(FITC標識)(配列番号30):
5−gagtgagcttgggctgaaac−3
RM223R(配列番号31):
5−gaaggcaagtcttggcactg−3
RM264F(FITC標識)(配列番号32):
5−gttgcgtcctactgctacttc−3
RM264R(配列番号33):
5−gatccgtgtcgatgattagc−3
RM144F(FITC標識)(配列番号34):
5−tgccctggcgcaaatttgatcc−3
RM144R2(配列番号35):
5−gacatcatcacttctcctcga−3
RM336F(配列番号36):
5−cttacagagaaacggcatcg−3
RM336R(TexasRed標識)(配列番号37):
5−gctggtttgtttcaggttcg−3
MRG6237F(TexasRed標識)(配列番号38):
5−atttctagccccacagcgaacgt−3
MRG6237R(配列番号39):
5−gtgtcttttctattgctgtttcggttttgcac−3
RM333F(FITC標識)(配列番号40):
5−gatcgactacgagtgtcaccaa−3
RM333R(配列番号41):
5−gtcttcgcgatcactcgc−3
RM72F(FITC標識)(配列番号42):
5−ccggcgataaaacaatgag−3
RM72R(配列番号43):
5−gcatcggtcctaactaaggg−3
RM6333F(FITC標識)(配列番号44):
5−agagaagacacggtggatgg−3
RM6333R(配列番号45):
5−gtgtcttcaaactcctcatttcgctcc−3
また、表1に本発明の判定用SNP部位による、十石型のsd1遺伝子型(J)と野生型GA20ox−2遺伝子型(N)判定クラスを示す。
(1)農業生物資源研究所
(2)九州沖縄農業研究センター
(3)佐賀農業試験研究センター
(4)高知県農業技術センター
(5)(株)植物ゲノムセンター
(6)兵庫県農業試験場
(7)鳥取大学
(8)鹿児島農業開発センター
(9)鹿児島農業試験場
また、前記ASP−PCR法においてヒカリ新世紀用プライマーとして用いることのできる、「配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、10〜100の連続した塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がt(281番目のtに対応)であるポリヌクレオチド」や、「配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、10〜100の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がa(281番目のtに対応)であるポリヌクレオチド」も、それ自体、新規化合物である。
本実施例では、ヒカリ新世紀及びコシヒカリの玄米から、それぞれ、DNAサンプルを調製し、sd1遺伝子(ヒカリ新世紀)及びGA20ox2遺伝子(コシヒカリ)のエキソン1の塩基配列を決定した。
配列決定のためのイネ品種としては、鳥取大学農学部から入手したヒカリ新世紀(8個体)と、独立行政法人農業生物資源研究所から入手したコシヒカリ(8個体)を使用した。
まず、下記のフォワードプライマーF3とリバースプライマーR3、LA−Taq(タカラバイオ社)、GCバッファー(タカラバイオ社)を用いて、94℃30秒間、58℃30秒間、72℃1分間からなるサイクルを35サイクル実施して、エキソン1全領域を含む領域を増幅した(図1参照)。
フォワードプライマーF3(配列番号6):
5−gctcgtcttctcccctgttacaaatacccc−3
リバースプライマーR3(配列番号5):
5−gacgtcgtcctggaggaggatggtgagggc−3
増幅したPCR産物を、pGEM−Tベクター(プロメガ社)に連結し、市販の反応液(ABI-Terminator Ready Mix;ABI社)で塩基配列決定反応後、DNAシークエンサー(ABI-Prism;ABI社)で解読した。
本実施例では、実施例1で得られたDNAサンプルを用いて、下記手順(PCR、制限酵素処理、及び電気泳動)を実施することにより、ヒカリ新世紀とコシヒカリとを視覚的に明確に識別可能であることを確認した。
まず、下記に示す反応条件でPCRを実施した。
反応液組成:
DNA(10ng) 1 μL
2×GCバッファーI(タカラバイオ社) 5 μL
プライマーHSF3(2.5μmol/L) 0.1μL
プライマーHSR5(2.5μmol/L) 0.1μL
d−NTP(2.5mmol/L) 1.6μL
La Taq(5U/μL) 0.1μL
水 2.1μL
総量 10 μL
PCR反応条件:
94℃ 1分間
サイクル(35サイクル)
94℃ 30秒間
62℃ 30秒間
72℃ 30秒間
72℃ 2分間
フォワードプライマーF3(配列番号6):
5−gctcgtcttctcccctgttacaaatacccc−3
リバースプライマーR5(配列番号7):
5−caccatcgttttaattaccccattggcgcg−3
反応液組成:
PCR増幅産物 10μL
10×バッファーL(タカラバイオ社) 2μL
PmaCI(10U/μL) 1μL
水 7μL
総量 20μL
制限酵素反応条件:
37℃ 90分間
65℃ 2分間
8℃ (電気泳動まで静置)
また、フォワードプライマーF3及びリバースプライマーR5の上記組合せ以外にも、図1に示す各種フォワードプライマーF1〜F4と、各種リバースプライマーR1〜R5との任意の組合せを用いて得られたPCR増幅産物を制限酵素PmaCIで処理しても、同様の結果が得られた。なお、加工品など、含有する遺伝子が断片化されているようなサンプルの場合は、増幅領域が短い方が好ましく使用できる。
従って、識別すべきイネ品種から、実施例1の手順に従ってDNAサンプルを調製し、続いて、実施例2の手順に従って、PCR、制限酵素処理、及び電気泳動を実施することにより、上記サイズの一本のバンドが検出された場合にはコシヒカリと、上記サイズの2本のバンドが検出された場合にはヒカリ新世紀と識別することができる。
(1)基準品のDNAの抽出
表2に示す基準品種(188品種)の種子(玄米)を各1粒用意し、2mLマイクロチューブにジルコニアビーズ5粒と共に入れ、振とう後、抽出バッファー(10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA-2Na, 0.1% SDS, 5mol/L NaCl 30 mL/L)900μL、5mol/L塩酸グアニジン100μL、20mg/mLプロテイナーゼK溶液50μLを加えた。これをローテーターで撹拌しながら、55℃で3時間加温した後、マイクロチューブ遠心機を用いて15,000rpmで3分間遠心分離を行った。
分離後、新たな2mL容量のマイクロチューブに上清各500μLを移し取り、市販の核酸精製キット(Wizard DNA Cleanupsystem;プロメガ社製)を用いてDNAの精製を行った。精製は,全てキットに収載のプロトコールに従って行い、個体ごとにDNA溶液を1.5mLマイクロチューブに得た。コシヒカリ及びヒカリ新世紀については各4個体からDNAを抽出した。
実施例2で示したようなPCR−RFLP法によるSNPの判定は、電気泳動の前に、PCR工程および増幅産物の制限酵素処理工程が必要であり、操作が煩雑である。品種識別技術に適用するには、従来のマイクロサテライトマーカーと同様にPCR工程と電気泳動工程のみで判定できることが望ましい。さらに、適切なプライマーを作製することで、マイクロサテライトマーカーと同一反応系にて検出を行えるマルチプレックスPCRが可能になる。特に、半矮性はイネ育種上重要な表現型であり、戻し交配の繰返しによる育種法が多く用いられ、その結果、育成品種と親品種の遺伝的背景が非常に似ており、従来のマイクロサテライトマーカーだけでは、品種識別が困難となることが予想されるため、表現型に直接関与する遺伝子の塩基配列を簡便に検出する技術が必要である。
前記(2)にて構築した、十石由来のsd1遺伝子型に関するASP−PCR法について、ヒカリ新世紀及びコシヒカリを含む188品種について、PCR−RFLP法による結果との相関を確認した。その結果、PCR−RFLP法により、十石由来のsd1遺伝子型を示したのは、「ニシホマレ」「はなさつま」「ヒカリ新世紀」「ミナミヒカリ」「レイホウ」「サイワイモチ」「ヒヨクモチ」「彩南月」「ユメヒカリ」「夢はやと」であり、十石由来のsd1遺伝子型特異的ASP−PCR法でも全く同一の結果が得られた。図4に、PCR−RFLP法とASP−PCR法の検出例を示す。これらのことから、プライマーSD1F3とSD1JRを用いたASP−PCRによって十石由来のsd1遺伝子型を正確に検出できることが明らかになった。
ASP−PCRとSSR−PCRのマルチプレックスPCRによる品種識別
前記の実施例のように、簡便に両品種を区別することが可能になった。さらに、従来のマイクロサテライトマーカーによる識別法を組み合わせることにより、多くの品種から、ヒカリ新世紀を同定することができる。例えば、188品種に対して、特開2004−65251号公報に記載のようにマイクロサテライトマーカーのデータベースを作成し、前記で構築されたASP−PCR法で得られた遺伝子型(十石型sd1あるいは野生型SD1)から成るデータベースを組み合わせて使用すれば、ヒカリ新世紀とコシヒカリを加えた188品種が同定可能になる。そこで、さらに検査工程の簡便化を考慮し、十石由来sd1遺伝子型に関するASP−PCRとSSRマーカーを組み合わせたマルチプレックスPCRの検討を実施した。
十石由来のsd1遺伝子型に関するASP−PCR法の精度向上
前記のように、プライマーSD1JRとSD1F3を用いることで、十石由来のsd1遺伝子型に関するASP−PCR法を開発した。本発明を用いた遺伝子型の判定は、増幅産物の有無により実施される。つまりASP−PCRは優性マーカーである。優性マーカーを、検査に実用化する場合、一般的に検査精度の維持が難しい。例えば、ASP−PCRで増幅産物が得られなかった場合、その原因としては、PCRの鋳型としたDNAが十石由来sd1遺伝子型では無い場合の他にも、テクニカルエラーなどによりPCR増幅が正常に行われなかった場合も想定される。そこで、本ASP−PCR法によるマーカーを共優性様にする、つまり十石由来sd1遺伝子型では無い場合にも区別できる増幅産物が得られるように改良することを試みた。
Claims (6)
- 配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を決定する工程、及びMRG4653、MRG6545、RM153、RM253、MRG5375、MRG4931、RM264、RM144、RM72、及びRM6333からなる群から選んだ、少なくとも1つのマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を含むことを特徴とする、ヒカリ新世紀の識別方法。
- 配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を決定する工程、及び/又は、マイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程が遺伝子増幅法を使用する、請求項1に記載のヒカリ新世紀の識別方法。
- 配列番号1で表される塩基配列の281番目の塩基を決定する工程、及びマイクロサテライトマーカーを用いて分析する工程を、遺伝子増幅法を使用して同時に行う、請求項2に記載のヒカリ新世紀の識別方法。
- 配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、281番目の塩基を含む10〜100の連続した塩基配列又はその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドと、請求項1に記載の少なくとも1つのマイクロサテライトマーカーに対応するプライマーセットとを含む、ヒカリ新世紀の識別用キット。
- 配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、10〜100の連続した塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がt(281番目のtに対応)であるポリヌクレオチドと、請求項1に記載の少なくとも1つのマイクロサテライトマーカーに対応するプライマーセットとを含む、ヒカリ新世紀の識別用キット。
- 配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(281番目はt)において、10〜100の連続した塩基配列の相補的塩基配列からなり、且つ、その3’末端塩基がa(281番目のtに対応)であるポリヌクレオチドと、請求項1に記載の少なくとも1つのマイクロサテライトマーカーに対応するプライマーセットとを含む、ヒカリ新世紀の識別用キット。
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