WO2023176983A1 - コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方に関する分子マーカー、及びその利用 - Google Patents

コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方に関する分子マーカー、及びその利用 Download PDF

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WO2023176983A1
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wheat
grain protein
seq
wheat plant
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PCT/JP2023/010818
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洋平 寺沢
浩一 八田
美環子 伊藤
誠 山守
亘 アキリ
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国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
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    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention relates to a molecular marker related to at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants, a determination method using the same, a manufacturing method, a determination kit, and a gene.
  • Wheat grain protein content greatly affects the quality of flour, so it is important as a requirement for commercial products. Particularly in Japan, there is a need to develop wheat for soft flour with a low grain protein content. In addition, the number of ears of wheat is one of the yield components and is therefore very important as an agricultural characteristic. Therefore, various studies have been conducted on the traits of grain protein content and panicle number in wheat.
  • Non-Patent Document 1 describes the identification of major genes related to the trait of grain protein content in wheat.
  • One aspect of the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and its purpose is to provide a technology for early determining traits related to at least one of wheat grain protein content and panicle number. The aim is to realize this.
  • a determination method is a determination method for determining at least one of the grain protein content rate and the number of panicles in a wheat plant, and is shown in SEQ ID NO: 1 representing the Gpc-B2 gene.
  • the method includes a step of detecting a base sequence corresponding to the base sequence from the 1614th to the 2228th base sequence as a molecular marker regarding at least one of grain protein content and panicle number in a wheat plant.
  • a production method is a production method for producing a wheat plant having at least one of a low content of grain protein and a large number of ears, the production method comprising wheat plants obtained by breeding or wheat plants obtained by breeding or wheat plants obtained after breeding.
  • a step of determining a wheat plant having at least one of a low content of grain protein and a large number of panicles from the wheat plants of the generation line by the determination method described in any one of claims 1 to 3. includes.
  • a molecular marker according to one aspect of the present invention is a molecular marker related to at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants, and is a molecular marker from positions 1614 to 2228 of a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a polynucleotide consisting of a base sequence corresponding to the base sequence up to the base sequence.
  • a determination kit is a determination kit for determining at least one of the degree of grain protein content and the degree of panicle number in a wheat plant, the determination kit having a base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Contains a forward primer containing 15 or more consecutive bases.
  • the wheat grain protein content and panicle number regulating gene is a wheat grain protein content and panicle number regulating gene that is involved in regulating at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants. and: (1) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence from 1614th to 2228th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence from 1614th to 2228th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1; A polynucleotide consisting of a base sequence having 80% or more sequence identity to, and involved in regulating at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants; or (3) the base shown in SEQ ID NO: 1.
  • a determination method is a determination method for determining the degree of panicle number in a wheat plant, and includes a step of detecting a mutation in the promoter region of the Gpc-B2 gene of the wheat plant.
  • traits related to at least one of grain protein content and panicle number of wheat can be determined at an early stage.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a molecular marker according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of restriction enzyme-treated amplification products in Examples.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of amplified products in Examples. It is a figure which shows the measurement result of the grain protein content rate of an Example. It is a figure which shows the measurement result of the number of panicles of an Example.
  • FIG. 3 is a diagram showing measurement results of grain protein content in various varieties in Examples.
  • FIG. 2 is a diagram showing the positions of polymorphisms of the Gpc-B2 gene detected in Examples.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of a probe assay using Taqman (registered trademark) probes in Examples. It is a figure showing the result of a probe assay using a Cycling probe in an example.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of SYBR (registered trademark) Green assay in Examples.
  • nucleic acid may exist in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA) or RNA (eg, mRNA).
  • DNA or RNA may be double-stranded or single-stranded.
  • Single-stranded DNA or RNA may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand).
  • bases are expressed using the one-letter notation defined by IUPAC and IUB as appropriate.
  • One aspect of the present invention relates to a technique for determining at least one of the degree of grain protein content and the degree of panicle number in a wheat plant.
  • One aspect of the present invention can be used to determine at least one of wheat plants with a low grain protein content and individuals with a large number of ears.
  • One aspect of the present invention is to determine the genotype of a wheat grain protein content and panicle number regulating gene present in the genome of a wheat plant, thereby determining wheat grain production based on at least one of grain protein content and panicle number. Determine the individual plant.
  • One embodiment of the present invention can also be used to determine at least one of wheat varieties with low grain protein content and varieties with a large number of ears.
  • the concept of grain protein content refers to the fact that the grain protein content in a certain wheat plant individual is relatively high or low compared to other wheat plant individuals. Includes the degree of content.
  • the concept of panicle number includes the degree of panicle number, which indicates whether the number of panicles in a certain individual wheat plant is relatively large or small compared to other individual wheat plants. .
  • wheat plants include all plants of the genus Triticum of the family Poaceae.
  • Examples of wheat varieties include ⁇ Kitahonami'', ⁇ Hokushin'', ⁇ Biwahonami'', ⁇ Yumechikara'', ⁇ Kitano Kaori'', ⁇ Norin 61'', ⁇ Shiroganekomugi'', ⁇ Satonosora'', ⁇ Chikugoizumi'', and ⁇ Chikugoizumi''. "Minamino Kaori" etc.
  • the wheat plant can be a candidate plant for breeding material or a plant obtained in a breeding process.
  • Candidate plants for breeding materials include, for example, parent plants used for hybridization and plants used for molecular breeding using genetic recombination technology.
  • plants obtained through the breeding process include, for example, plants obtained by intraspecific hybridization of plants belonging to the above-mentioned varieties of wheat plants, and their progeny lines.
  • the wheat plant may be a plant resulting from interspecific hybridization, such as a hybrid plant between a wheat plant belonging to a certain variety and a wheat plant belonging to another variety, or a progeny line thereof.
  • the wheat plant may be a plant obtained by interspecific crossbreeding of varieties known to have at least one of low grain protein content and large number of ears, and a progeny line thereof.
  • the wheat plants may be plants produced by intraspecific crosses between individuals known to have at least one of a low grain protein content and a large number of ears, and their progeny lines.
  • a plant may be part or all of a plant.
  • examples of the part of the plant include propagation materials (seeds, scales, etc.), leaf scales, flowers, roots, and the like.
  • the "grain protein content” in a wheat plant is intended to be the protein content contained in the grain of a wheat plant. Note that the "grain protein content” may also be referred to as “grain protein content” or “grain protein content.”
  • the "number of panicles” in a plant is intended to be the number of panicles per unit area in which a wheat plant is grown, and is intended to be an index representing the yield of a wheat plant.
  • the grain protein content of wheat greatly affects the quality of flour, and is therefore important as a requirement for commercial products.
  • the number of ears of wheat is one of the yield components and is therefore very important as an agricultural characteristic. Therefore, it would be very beneficial if wheat plants could be easily selected using at least one of wheat grain protein content and panicle number as an index.
  • the grain protein content and the number of panicles may vary depending on the variety of wheat.
  • "Kitahonami” has a low grain protein content
  • “Yumechikara” has a high grain protein content
  • “Kitahonami” also has a large number of ears.
  • wheat varieties with high grain protein content such as ⁇ Yumechikara,'' may be required.
  • wheat plants with a large number of ears are susceptible to the effects of wind, and lines with a small number of ears may be desired.
  • a molecular marker according to one aspect of the present invention is a molecular marker related to at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants.
  • the molecular marker is (a) a polynucleotide consisting of a base sequence corresponding to the base sequence from 1614th to 2228th of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Molecular markers can be used to identify loci related to grain protein content and panicle number on chromosome 2 of wheat plants.
  • the genetic locus related to grain protein content and panicle number refers to a quantitative trait locus or gene region that influences grain protein content and panicle number.
  • Quantitative trait loci generally refers to chromosomal regions involved in the expression of quantitative traits. QTLs can be defined using molecular markers that indicate specific loci on chromosomes. Techniques for defining QTL using such molecular markers are well known in the art.
  • molecular markers examples include SNP markers, AFLP (molecular amplified fragment length polymorphism) markers, RFLP markers, microsatellite markers, SCAR markers, CAPS markers, InDel markers, and the like.
  • the term "molecular marker” refers to a DNA polymorphism in which a mutation is observed in a specific region in a DNA base sequence.
  • the DNA polymorphism is based on the genome sequence of wheat (Triticum aestivum).
  • the genome sequence (IWGSC RefSeq V2.1) of the reference plant Chinese spring is published in the genome database (https://www.wheatgenome.org/).
  • the molecular marker according to one aspect of the present invention is the molecular marker described in this example or a molecular marker that can be identified as the same.
  • the molecular marker according to one embodiment of the present invention it is possible to determine the grain protein content and the number of panicles in a wheat plant.
  • the nucleotide sequence corresponding to the 1614th to 2228th nucleotide sequence of the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a variation at the locus related to fruit protein content and panicle number on chromosome 2. It is.
  • the gene locus related to grain protein content and panicle number on chromosome 2 consists of a base sequence derived from a standard wheat plant. Other wheat plants may contain portions in which the base sequence differs from the reference base sequence in addition to the mutations described above. Since the genomic region where this molecular marker is located is conserved among many wheat plants, this molecular marker can be identified by techniques such as homology search.
  • the base shown in SEQ ID NO: 1 A nucleotide sequence corresponding to the 1614th to 2228th nucleotide sequence of a polynucleotide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO. It refers to the nucleotide sequence on the genetic locus related to fruit protein content and panicle number on chromosome 2, which is said to correspond to the nucleotide sequence up to the nucleotide sequence up to No.
  • the molecular marker according to one aspect of the present invention is a molecular marker newly identified by the present inventors, and a person skilled in the art would be able to identify the location of the molecular marker on the genome based on the base sequence of the molecular marker. I can do it.
  • the molecular marker according to one aspect of the present invention is such that when the base sequence of the molecular marker is detected in the promoter region of the Gpc-B2 gene of a wheat plant, the wheat plant has a low grain protein content and a large number of panicles. It can be determined that Here, a wheat plant with a low grain protein content and a large number of panicles means that the wheat plant has a relatively low grain protein content and a high number of panicles compared to other wheat plant individuals. A relatively large number is intended.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a molecular marker according to one embodiment of the present invention.
  • "Kitahonami” is known to have a low grain protein content and a large number of ears
  • "Yumechikara” is known to have a high grain protein content.
  • the molecular marker according to one aspect of the present invention includes (a1) a polynucleotide consisting of the base sequence from 1614th to 2228th of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, (a2) the polynucleotide of (a1) (a3) (a1 ) consists of a base sequence in which 120 or fewer bases are substituted, deleted, added, or inserted into the base sequence of the polynucleotide, and is involved in the regulation of at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants. It is a polynucleotide that
  • the polynucleotide (a1) can be used, for example, in wheat plants with a low grain protein content and a large number of panicles (e.g., wheat It can be obtained from the cultivar ⁇ Kitahonami'').
  • the polynucleotide of (a2) retains the function of regulating at least one of the grain protein content and the number of panicles, and in the base sequence of the polynucleotide of (a1), for example, 80% or more, 85% or more, 90% It may have an identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the identity of such base sequences can be determined, for example, by aligning two base sequences using analysis software such as BLAST and FASTA.
  • the polynucleotide (a3) retains the function of regulating at least one of grain protein content and panicle number, and has, for example, 120 or less, 100 or less, 80 or less in the base sequence of the polynucleotide (a1). Below, 60 or less, 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 or less, 15 or less, 10 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, 1 base may be substituted, deleted, added, or inserted.
  • the base sequence of such a polynucleotide is obvious to a person skilled in the art and can be determined by referring to the above-mentioned wheat genome sequence or from a wheat plant with a low grain protein content and a high number of panicles. It can be determined by decoding the base sequence of the promoter region of the Gpc-B2 gene on the genome.
  • polynucleotides (a1) to (a3) are detected in the promoter region of the Gpc-B2 gene of a wheat plant, it can be determined that the wheat plant has a low grain protein content and a large number of panicles.
  • polynucleotides (a1) to (a3) are not detected in the promoter region of the Gpc-B2 gene of a wheat plant, it can be determined that the wheat plant has a high grain protein content and a low number of panicles. .
  • a wheat plant having at least one of a low grain protein content and a large number of ears according to one aspect of the present invention is a plant obtained by the production method described below.
  • Such a wheat plant has a mutation identified by the above-mentioned molecular marker, and has at least one of a low grain protein content and a high number of panicles.
  • Wheat plants having at least one of a low grain protein content and a high number of ears are wheat plants obtained by breeding and This can be obtained by identifying wheat plants that have at least one of a low grain protein content and a high number of panicles from the progeny lines using the molecular marker according to one embodiment of the present invention. Note that wheat plants that have been genetically engineered to have mutations identified by the above-mentioned molecular markers and that have at least one of a low grain protein content and a high number of panicles are also within the scope of the present invention. included.
  • the degree of grain protein content and the number of panicles in wheat plants are determined using the molecular marker according to one embodiment of the present invention, and high grain protein content is selected based on the determination results. Also included in the scope of the present invention are wheat plants with a small number of ears.
  • a determination method for determining at least one of the degree of grain protein content and the degree of panicle number in wheat plants is based on the 1614th to The method includes a step of detecting a base sequence corresponding to the base sequence up to the 2228th base sequence as a molecular marker for at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants.
  • the determination method according to one aspect of the present invention is to determine at least one of the degree of grain protein content and the number of panicles in a wheat plant subject using the above-described molecular marker according to one aspect of the present invention. do.
  • mutations are identified using the above-mentioned molecular markers on the genome of a wheat plant to be tested, so that the test wheat plant has a level of grain protein content and a level of panicle number. Determine at least one of the following.
  • the wheat plant to be tested is a candidate plant for breeding material or a plant obtained through a breeding process.
  • the wheat plants to be tested include, for example, hybrid plants between wheat plants with a low grain protein content and a large number of panicles, and wheat plants with a low grain protein content and a high number of panicles and other wheat plants. They may be plants, hybrid plants of plants with high grain protein content and low panicle number, and progeny lines thereof.
  • the wheat plant to be tested may be a hybrid plant obtained by crossing wheat plants whose grain protein content and number of ears are unknown, or a progeny line thereof.
  • the wheat plants to be tested include wheat plants used for molecular breeding using genetic recombination technology, wheat plants obtained by molecular breeding, and wheat plants used for haploid breeding. Wheat plants used and wheat plants obtained by haploid breeding are included.
  • the wheat plant in the step of detecting, when the base sequence of the molecular marker is detected in the promoter region of the Gpc-B2 gene of the wheat plant, the wheat plant contains grain protein. It is determined that at least one of a low ratio and a high number of panicles exists.
  • the wheat plant in the step of detecting, when the base sequence of the molecular marker is not detected in the promoter region of the Gpc-B2 gene of the wheat plant, the wheat plant It is determined that the content is high or the number of ears is low.
  • the method of detecting a molecular marker in a wheat plant using a molecular marker is not particularly limited, and any known analysis method can be used.
  • An example of this is a method of analysis by detecting a molecular marker region in a PCR amplified fragment of a subject.
  • a primer set that amplifies a region containing a molecular marker may be used to amplify the region in the DNA of a wheat plant. That is, a primer set that amplifies a region containing a molecular marker can be a determination kit for determining at least one of the grain protein content and the number of panicles in a wheat plant.
  • Amplification of the above region in the DNA of the wheat plant test subject can be performed by polymerase chain reaction (PCR) using DNA extracted from the wheat plant test sample as a template and primers that amplify the above region. Then, the nucleotide sequence (genotype) of the obtained amplified fragment is determined, and based on data showing the relationship between the determined nucleotide sequence (genotype) and at least one of grain protein content and panicle number in wheat plants. Then, at least one of the degree of grain protein content and the degree of panicle number in the wheat plant is determined.
  • Conventionally known methods can be used to determine the genotype of an amplified fragment, and examples include DNA sequence analysis, a method using agarose gel electrophoresis, and TaqMan analysis using real-time PCR.
  • the primer set used in PCR is not particularly limited as long as it can amplify the DNA fragment in the region containing the target molecular marker, and the primer set may be designed to shorten the length of the amplified fragment. Good too.
  • a primer set is designed such that the length of the primer amplified fragment is preferably 200 base pairs (bp) or less, 160 bp or less, 150 bp or less, 140 bp or less, 130 bp or less, 120 bp or less, or 100 bp or less.
  • the primer set includes a forward primer and a reverse primer.
  • the length of these primers may be, for example, 15 bp or more, 16 bp or more, 17 bp or more, 18 bp or more, 19 bp or more, 20 bp or more, or 25 bp or more, and 50 base bp or less, 40 bp or less, or 30 bp or less. It's okay.
  • the primer set that amplifies the region containing the molecular marker is a determination kit for determining at least one of the grain protein content and the number of panicles in wheat plants.
  • the primer set for amplifying a region containing a molecular marker includes a forward primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • the reverse primer used in combination with the above forward primer is not particularly limited as long as it can amplify the promoter region of the Gpc-B2 gene of wheat plants.
  • the reverse primer used in combination with the above forward primer may be a reverse primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the primer set for amplifying a region containing a molecular marker includes a forward primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a forward primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the primer set may include a reverse primer.
  • PCR in the detection step may be either singleplex PCR, which amplifies a DNA fragment with a reaction system containing a single primer set, or multiplex PCR, which amplifies genes with a reaction system containing multiple primer sets.
  • multiplex PCR primer sets labeled with fluorescent substances having different wavelengths (eg, NED, 6-FAM, VIC, PET) may be mixed.
  • the primer set for amplifying the region containing the molecular marker may be a primer set used in nested PCR.
  • Primer sets used in Nested PCR include, for example, a first primer set including the forward primer shown in SEQ ID NO: 5 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 6; the forward primer shown in SEQ ID NO: 7 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 8; A second primer set comprising a reverse primer shown in SEQ ID NO: 9; a third primer set comprising a forward primer shown in SEQ ID NO: 9 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 10; and a forward primer shown in SEQ ID NO: 9 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 11.
  • a fourth primer set comprising the reverse primer shown;
  • the promoter region and first exon of the Gpc-B2 gene of wheat plants can be amplified by nested PCR using the first primer set and the second primer set.
  • By nested PCR using the third primer set and the fourth primer set it is possible to amplify the first to third exons of the Gpc-B2 gene of wheat plants.
  • a PCR amplification product consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 can be obtained in wheat plants with low grain protein content and a large number of panicles, which can be used as a molecular marker. Corresponding base sequences can be detected. Furthermore, by using the primer set, it is possible to specifically amplify a region containing a molecular marker and determine the genotype by agarose electrophoresis.
  • the reaction conditions for PCR can be appropriately set depending on the type of DNA polymerase and PCR device used, the length of the amplified fragment, etc.
  • As the cycle conditions a 3-step PCR method in which one cycle consists of the three steps of denaturation, annealing, and extension, and a two-step PCR method in which one cycle consists of the two steps of denaturation, annealing, and extension are applied. can do.
  • reaction conditions in 3-step PCR is a denaturation step at 90-100°C for 40-60 seconds (e.g., 95°C for 30 seconds), an annealing step for 10-60 seconds (e.g., 60 seconds), and Extension steps of 10-150 seconds at 80°C (eg, 150 seconds at 72°C) are performed for 10-40 cycles (eg, 35 cycles).
  • the annealing temperature may be lowered stepwise for each predetermined cycle from an initial annealing temperature of 55 to 70°C (e.g., 61°C) to a final annealing temperature of 40 to 60°C (e.g., 45°C). , 1°C decrease per cycle).
  • PCR reaction conditions may be adjusted in order to stably detect the molecular marker.
  • real-time PCR such as TaqMan (registered trademark)-PCR method, which performs PCR amplification and identification of molecular markers
  • a TaqMan (registered trademark) probe that detects a molecular marker contained in an amplified fragment amplified using a primer set may be further used.
  • a high-throughput discrimination method can be provided.
  • analysis may be performed by determining the base sequence of the amplified fragment using an automatic DNA sequencer or the like.
  • the method for extracting DNA to be amplified by PCR from a wheat plant specimen is not particularly limited, and any known DNA extraction method can be used.
  • DNA may be extracted using a commercially available DNA extraction kit. Depending on the type of specimen, the amount of contaminants, etc., pretreatment may be performed as appropriate before the DNA extraction step.
  • the DNA extracted from the subject may be washed or purified as necessary in order to be used as a template in a PCR reaction.
  • restriction enzyme fragments obtained by digesting DNA extracted from a subject with two types of restriction enzymes may be amplified by PCR.
  • the grain protein content of a test wheat plant is determined using a molecular marker. and the number of panicles can be determined. Therefore, based on the determination results, wheat plants and their progeny lines having desired levels of grain protein content and desired number of panicles can be selected.
  • the determination method it is possible to select wheat plants with desired levels of grain protein content and number of panicles, and the period for breeding and selection can be significantly shortened. can be shortened to Furthermore, by planting and growing only seedlings selected at the seedling stage that have desired grain protein content and panicle numbers, it is possible to improve field utilization efficiency.
  • a production method for producing wheat plants with low grain protein content and high number of ears is a production method for producing a wheat plant that has at least one of a low grain protein content and a large number of ears.
  • the production method according to one embodiment of the present invention is to obtain wheat plants with low grain protein content and low panicle number from wheat plants obtained by breeding or wheat plants of its progeny line by the determination method according to one embodiment of the present invention.
  • the method includes the step of determining a wheat plant having at least one of the following.
  • the description regarding the molecular marker according to one aspect of the present invention, the wheat plant having a low grain protein content and high number of panicles according to one aspect of the present invention, and the determination method according to one aspect of the present invention is incorporated in the description of a method for producing a wheat plant with a low grain protein content and a large number of ears.
  • the production method may include a step of breeding wheat plants before the step of determining.
  • Wheat plants used as parent plants for breeding include, for example, wheat plants with a low grain protein content and a large number of panicles, plants with a high grain protein content and a small number of panicles, and wheat plants with a high grain protein content and a low number of panicles. Wheat plants of unknown degree and number of panicles, as well as their progeny lines.
  • the wheat plant used as the parent plant for breeding may be a wheat plant with a low grain protein content and a large number of panicles according to one embodiment of the present invention.
  • the wheat plant used as the parent plant used for breeding may be a wheat plant with a low grain protein content and a large number of ears, which is selected by the determination method according to one embodiment of the present invention. That is, in the production method according to one embodiment of the present invention, before the breeding step, wheat having a low grain protein content and a large number of panicles is extracted from a test wheat plant by the determination method according to one embodiment of the present invention.
  • the method may further include a discrimination step of discriminating plants.
  • the degree of grain protein content and the number of panicles are determined in wheat plants using molecular markers, and a low grain protein content is selected based on the determination results. and wheat plants with a large number of ears can be produced.
  • the molecular marker according to one embodiment of the present invention is used to determine the degree of grain protein content and the number of panicles in wheat plants, and based on the determination results, the degree of grain protein content and the number of panicles are determined.
  • the scope of the present invention also includes a production method for producing a wheat plant with a high grain protein content and a small number of ears by selecting a wheat plant with a small amount of grain protein.
  • the molecular marker according to one embodiment of the present invention is used to control the grain protein content. Select tall wheat plants.
  • the production method according to one embodiment of the present invention selects wheat plants with a small number of ears using the molecular marker according to one embodiment of the present invention.
  • the wheat grain protein content and panicle number regulating gene is a gene involved in regulating at least one of the wheat grain protein content and the panicle number. If a wheat grain protein content and panicle number regulating gene exists, the wheat plant will have at least one of a low grain protein content and a high panicle number.
  • the wheat grain protein content and panicle number regulating genes are: (1) A polynucleotide consisting of the base sequence from 1614th to 2228th of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1; (2) Consists of a nucleotide sequence that has 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence from 1614th to 2228th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has a significant effect on grain protein content and panicle number in wheat plants.
  • nucleotide sequence consists of a nucleotide sequence in which 120 or less nucleotides are substituted, deleted, added, or inserted in the nucleotide sequence from 1614th to 2228th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide of (1) above includes the base sequence of the promoter region of the Gpc-B2 gene of a wheat plant, and is a polynucleotide that is involved in regulating at least one of grain protein content and panicle number in the wheat plant.
  • the sequence identity of the base sequence is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99%. It can be more than that.
  • the identity of such base sequences can be determined, for example, by aligning two base sequences using analysis software such as BLAST and FASTA.
  • mutant genes or homologous genes (including orthologs) derived from wheat plants are included in the polynucleotide category (2) above. These mutant genes and homologous genes are endogenous genes of the wheat plant.
  • the molecular marker according to one embodiment of the present invention may be a molecular marker on these mutant genes or homologous genes.
  • the number of substituted, deleted, added or inserted bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is, for example, 120 or less, 100 or less, 80 or less, 60 or less, The number may be 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 or less, 15 or less, 10 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1.
  • the base sequence of such a polynucleotide is obvious to a person skilled in the art and can be determined by referring to the above-mentioned wheat genome sequence or from a wheat plant with a low grain protein content and a high number of panicles. It can be determined by decoding the base sequence of the promoter region of the Gpc-B2 gene on the genome.
  • the wheat grain protein content and panicle number regulating gene refers to a gene into which mutations have been artificially introduced
  • substitution, deletion, addition, or insertion of a base is, for example, the Kunkel method (Kunkel, Proc Natl. Site-specific mutagenesis methods such as Acad Sci USA, 82: 488-492, 1985), mutagen treatment using drugs, mutagenesis methods using radiation (gamma rays, heavy ion beams, etc.), site-specific Mutations may be introduced artificially using genome editing using nuclease, or may be derived from similar naturally occurring mutated polypeptides.
  • Wheat grain protein content and panicle number regulating genes may exist in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA). DNA may be double-stranded or single-stranded.
  • RNA eg, mRNA
  • DNA eg, cDNA or genomic DNA
  • An example of a wheat grain protein content and panicle number regulating gene is a DNA consisting of the base sequence from the 1614th to the 2228th base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the wheat grain protein content and panicle number regulating gene may contain the CDS of the Gpc-B2 gene as well as additional sequences such as the base sequence of the untranslated region (UTR).
  • the method for obtaining (isolating) the wheat grain protein content and panicle number regulating gene is not particularly limited, but for example, a part of the base sequence of the wheat grain protein content and panicle number regulating gene may be used. Examples include a method of preparing a probe that specifically hybridizes with and screening a genomic DNA library or cDNA library.
  • a method for obtaining wheat grain protein content and panicle number regulating genes a method using amplification means such as PCR can be mentioned.
  • primers are prepared from the 5' and 3' sequences (or their complementary sequences) of the DNA of the wheat grain protein content and panicle number regulatory gene, and these primers are used to transform the genomic DNA ( By performing PCR or the like using a template such as (or cDNA) or the like and amplifying the DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing wheat grain protein content and panicle number regulating genes can be obtained.
  • the isolated candidate gene for wheat grain protein content and panicle number regulating gene has the desired activity of regulating wheat grain protein content and panicle number depends on the candidate gene in the plant from which it is derived. Evaluation can be made by observing whether the desired degree of wheat grain protein content and number of panicles are induced by the expression of the gene.
  • nucleotide sequence from 1614th to 2228th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which is the nucleotide sequence of the promoter region of the Gpc-B2 gene derived from the wheat variety "Kitahonami" Examples include polynucleotides consisting of base sequences.
  • Wheat grain protein content and panicle number regulating genes can be used to elucidate the regulatory mechanism of grain protein content and panicle number in wheat plants.
  • wheat grain protein content and panicle number regulating genes can be used to create transformants by incorporating their sequences into expression vectors and introducing them into the plants or cells of wheat plants. can.
  • a wheat plant having at least one of a low wheat grain protein content and a high panicle number can be obtained.
  • a method for determining the number of panicles in a wheat plant according to one aspect of the present invention includes a step of detecting a mutation in the promoter region of the Gpc-B2 gene of the wheat plant. .
  • the wheat variety ⁇ Kitahonami,'' which is known to have a large number of ears, has a mutation in the promoter region of the Gpc-B2 gene compared to ⁇ Yumechikara'' and the reference plant Chinese spring. Therefore, in the method for determining the number of panicles according to one aspect of the present invention, the degree of the number of panicles in a wheat plant can be determined by detecting the presence or absence of the mutation.
  • a method for detecting a mutation in the promoter region of the Gpc-B2 gene of a wheat plant is performed using the molecular marker according to one aspect of the present invention.
  • This is a method for executing the determination method according to one aspect of the present invention. Therefore, the explanation regarding the molecular marker according to one embodiment of the present invention and the determination method according to one embodiment of the present invention is incorporated into the description of the panicle number determination method according to one embodiment of the present invention.
  • An evaluation method for evaluating wheat grain protein content and expression of panicle number regulating genes is an evaluation method for evaluating wheat grain protein content and expression of panicle number regulating genes.
  • the evaluation method according to one aspect of the present invention is performed at positions 2269, 2426, 2675, 2747, 2964, 3215, 3351, and 3585 of a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in wheat plants.
  • the method includes a step of evaluating the wheat grain protein content and the expression of the panicle number regulating gene according to one embodiment of the present invention in a plant. Also included in the scope of the present invention is an evaluation kit for evaluating wheat grain protein content and expression of panicle number regulating genes in wheat plants, which includes a primer set containing the primers.
  • the present inventors discovered multiple polymorphic regions specific to the Gpc-B2 gene, which is a gene that regulates wheat grain protein content and panicle number, and developed primers that amplify regions containing these regions. It has been found that by using this method, the Gpc-B2 gene can be specifically amplified.
  • Examples of polymorphisms specific to the Gpc-B2 gene discovered by the present inventors are positions 2269, 2426, 2675, 2747, 2964, and 3215 of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the primers used in this evaluation method may be primers that amplify a region containing at least one of the polymorphisms specific to the Gpc-B2 gene described above;
  • the primer may be a primer that amplifies a region including a plurality of .
  • the primer used in this evaluation method may be one that amplifies a region including the 2675th and 2747th bases of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the primers used in this evaluation method may amplify a region including the 4139th, 4140th, 4153rd, and 4155th bases of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the primers used in this evaluation method may amplify a region including the 3524th, 3525th, 3538th, and 3540th bases of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. . Furthermore, the primer used in this evaluation method has a region including the 4233rd base of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the 3618th base of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. It may also be something that amplifies it.
  • the evaluation method evaluates, in wheat plants, the presence or absence of expression of the wheat grain protein content and panicle number regulating gene according to one aspect of the present invention, the degree of expression of the gene, etc. .
  • the wheat grain protein content and panicle number regulating genes whose expression was evaluated are determined by the molecular marker according to one embodiment of the present invention, Can be used for detection.
  • Amplification of the region in the DNA of the wheat plant can be performed by polymerase chain reaction (PCR) using cDNA synthesized using RNA extracted from the wheat plant as a template and primers that amplify the region.
  • Evaluation of wheat grain protein content and expression of panicle number regulating genes by amplifying the above region in cDNA synthesized using wheat plant RNA can be performed using probes such as the TaqMan (registered trademark) probe method and the Cycling probe method, as an example. It can be performed by real-time PCR analysis such as an assay method or an intercalator method such as the SYBR (registered trademark) Green method.
  • the primer set used in the real-time PCR analysis is the 2269th, 2426th, 2675th, 2747th, 2964th, 3215th, 3351st, 3585th, 3599th, and 3615th of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • 3805th, and 3806th bases 2389th, 2546th, 2795th, 2867th, 3084th, 3335th, 3471st, and 3705th of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 , 3719th, 3735th, 3925th, 3926th, 4139th, 4140th, 4153rd, 4155th, and 4233rd bases, and a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the primer set may be designed to shorten the length of the amplified fragment without particular limitation, as long as it can amplify a region containing at least one base corresponding to the 3618th base.
  • a primer set is designed such that the length of the primer amplified fragment is preferably 200 base pairs (bp) or less, 160 bp or less, 150 bp or less, 140 bp or less, 130 bp or less, 120 bp or less, or 100 bp or less.
  • the primer set includes a forward primer and a reverse primer.
  • the length of these primers may be, for example, 15 bp or more, 16 bp or more, 17 bp or more, 18 bp or more, 19 bp or more, 20 bp or more, or 25 bp or more, and 50 base bp or less, 40 bp or less, or 30 bp or less. It's okay.
  • Primer sets used in real-time PCR analysis include, for example, a forward primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 14, and a reverse primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 15. This is a fifth primer set including.
  • Other examples of primer sets used in real-time PCR analysis include a forward primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, and a forward primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • probe used in the TaqMan (registered trademark) probe method is the first probe used with the fifth primer set described above, which includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 18.
  • the probe used in the Cycling probe method is, for example, one used with the fifth primer set described above, and includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 (TGCTCrACCG (in the sequence, "rA" is RNA)). 2 probes.
  • the sixth primer set described above can be used in the SYBR (registered trademark) Green method.
  • Real-time PCR such as TaqMan (registered trademark) probe method, Cycling probe method, SYBR (registered trademark) Green method, etc. can be performed according to the conditions shown in the examples described later. Further, real-time PCR may be performed using the above-mentioned primer set according to conventionally known conditions.
  • ⁇ Kitami 81'' also known as ⁇ Kitahonami'' or ⁇ Kitakei 1764 (Northern 1764)'', low protein content parent
  • ⁇ Kachikei 63'' low protein content parent
  • DH lines 194 doubled haploid lines
  • high protein content parents also known as 'Yumechikara' or 'Hokkai 261 (Hokkai 261)'
  • the DH line was created by the wheat haploid breeding method using wheat x maize intergeneric crosses (Inagaki and Tahir 1990). Experiments were conducted to identify the genotypes of 322 wheat varieties in Japan and around the world.
  • the experiment was divided into different fields and field conditions for each year.
  • the cultivation field areas in 2015, 2016, and 2017 were 253a, 247a, and 189a.
  • the previous crop was soybeans.
  • the planting dates for the experiment were September 16, 2015 in 2015, September 15, 2016 in 2016, and September 25, 2017 in 2017.
  • the cultivation method was as follows: In 2015, plots with 72 cm wide and 2 m long rows were used; in 2016, plots with 72 cm wide and 6 m long rows were used; in 2017, standard nitrogen (N) fertilization (4 kg/10 a) and additional N fertilization (6 kg/10 a) was applied in April (Ito et al. 2011).
  • the total amount of fertilization was 10 kg/10 a (N), 8 kg/10 a (P 2 O 5 ), and 4.8 kg/10 a (K 2 O) each year.
  • yield components Six yield component traits: stem length (CL), panicle length (SL), number of panicles per unit area (m 2 ) (NOS), thousand grain weight (TKW), test weight (TW), and per unit area Grain yield (GY) was measured for 3 years. TW was determined using the test weight module of an Infratec 1241 grain analyzer (Foss, Denmark). Single grain hardness (SKH), single grain weight (SKW), and single grain diameter (SKD) were measured using a Single-Kernel Characterization System (SKCS) (SKCS 4100, Perten Instruments, USA) at 50 grains. It was determined as the average value of
  • Grain protein content for 3 years from 2015 to 2017 was determined using a near-infrared reflector Inframatic 9500 NIR Grain Analyzer (Perten Instruments, Germany).
  • the promoter region and first exon of Gpc-B2 were amplified by Nested PCR (Yamamori and Guzman 2013) (first half of Gpc-B2).
  • primers GPCB2F1 SEQ ID NO: 5: CACGAGGAGCTTGTTGCACC
  • GPCB2R1 SEQ ID NO: 6: AGGATAGGTTTGTCCGTGCC
  • primers Pro Gpc-2B F-8 No5 SEQ ID NO: 7: CCGCGTAGAAGTAGCGGAATAC
  • GPCB2R5 SEQ ID NO: 8: TGCACGGTATAAGCATGATGGA
  • the first to third exons were first amplified using primers NAMB2F1 (SEQ ID NO: 9: AGCGCCGTATAGGAGCTCC) and NAMB2R3 (SEQ ID NO: 10: TGATGGAATAGACCCGGCCA), and then using primers NAMB2F1 and NAMB2R1 (SEQ ID NO: 11: CAGTGCTCACTGAATGCGAC). (Gpc-B2 second half).
  • PCR for sequencing was performed as follows. The first PCR of the first half of Gpc-B2 was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 20 cycles of 95°C for 30 seconds, 65°C for 30 seconds, and 72°C for 150 seconds, and then reacted at 72°C for 7 minutes. The second PCR of the first half of Gpc-B2 was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 32 cycles of 95°C for 30 seconds, 65°C for 30 seconds, and 72°C for 120 seconds, and then reacted at 72°C for 7 minutes.
  • the first PCR of the second half of Gpc-B2 was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 20 cycles of 95°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, and 72°C for 150 seconds, and then reacted at 72°C for 7 minutes.
  • the second PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 32 cycles of 95°C for 30 seconds, 60°C for 30 seconds, and 72°C for 120 seconds, and then reacted at 72°C for 7 minutes.
  • the composition of the PCR reaction solution was as shown in Table 1.
  • the nucleotide sequence of the amplification product of "Kitahonami” was the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, and the nucleotide sequence of the amplification product of "Yumechikara” was the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • each amplification product was treated with restriction enzyme BmgBII (CACGTC) and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • PCR was performed under the following conditions: after reaction at 94°C for 5 minutes, 35 cycles of 30 seconds at 94°C; 60 seconds at 61°C; and 150 seconds at 72°C, and then reaction at 72°C for 10 minutes.
  • the composition of the PCR reaction solution was as shown in Table 2. Agarose gel electrophoresis was performed on the obtained amplification products.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of restriction enzyme-treated amplification products in Examples.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis of amplified products in Examples.
  • FIG. 4 is a diagram showing measurement results of grain protein content in Examples.
  • FIG. 5 is a diagram showing the measurement results of the number of panicles in Examples.
  • FIG. 6 is a diagram showing the measurement results of grain protein content in various varieties in Examples.
  • the amplification product of the Gpc-B2 gene of "Kitahonami” by Nested PCR was cut at two sites by restriction enzymes, and the Gpc-B2 gene of "Yumechikara” by Nested PCR was cut at one site by restriction enzymes. was severed. It was shown that each genotype could be identified by treating the amplified products with restriction enzymes and subjecting them to agarose gel electrophoresis.
  • the Gpc-B2 gene was compared with similar wheat endogenous genes, and polymorphisms in the Gpc-B2 gene were detected.
  • arrows indicate the positions of polymorphisms in the Gpc-B2 gene detected for use in the probe assay.
  • the polymorphism of the Gpc-B2 gene shown in FIG. 7 corresponds to the 2675th base and the 2747th base of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the forward primer of the primer set used in the intercalator method is the 4139th, 4140th, 4153rd, and 4155th bases of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, and the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13. It was designed to include nucleotides 3524th, 3525th, 3538th, and 3540th.
  • the reverse primer of the primer set used in the intercalator method is designed to include the 4233rd base of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the 3618th base of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. did.
  • a specific expression analysis of the Gpc-B2 gene was performed by designing a primer set that amplifies the sequence containing the detected polymorphism. Note that the forward primer of the primer set used in the probe assay method used for expression analysis was designed to span an exon in order to suppress genome amplification. Using the designed primers and probes, expression analysis of the Gpc-B2 gene was performed by real-time PCR analysis.
  • Primers 220307Gpc-B2 F1 (SEQ ID NO: 14: CATGGGAGCTGCCCGAGAAG) and 220307Gpc-B2 R1 (SEQ ID NO: 15: CGACGTAGCCGCCCTGTT) were used for expression analysis using Taqman (registered trademark) probes and Cycling probes.
  • 220307Gpc-B2 1-2 (SEQ ID NO: 18: CGACCTTCGGTGAGCAGGAGTGGTACTTCT) was used as a Taqman (registered trademark) probe.
  • chimera probe 220307Gpc-B2chimera1 (SEQ ID NO: 19: TGCTCrACCG (in the sequence, "rA" is RNA) was used as a Cycling probe.
  • a probe assay using a Taqman (registered trademark) probe was performed under the conditions shown below.
  • RNA extracted from leaf tissue using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio).
  • PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio).
  • reverse transcription reaction was performed at 37°C for 15 minutes, and enzyme inactivation was performed at 85°C for 5 seconds.
  • the composition of the reaction solution for cDNA synthesis was as follows.
  • a reaction solution was prepared using the synthesized cDNA, Taqman probe, primer, and Brilliant III Ultra-Fast QPCR Master Mix with Low ROX (Agilent), and a PCR reaction and Gpc-B2 were performed using a real-time PCR device AriaMX (Agilent). Gene expression was detected.
  • the real-time PCR was carried out under the following conditions: 95°C for 3 minutes, followed by 40 cycles of 95°C for 5 seconds and 60°C for 10 seconds.
  • the composition of the real-time PCR reaction solution was as shown below.
  • cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio) using RNA extracted from leaf tissue using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). For synthesis, reverse transcription reaction was performed at 37°C for 15 minutes, and enzyme inactivation was performed at 85°C for 5 seconds.
  • the composition of the reaction solution for cDNA synthesis was as follows.
  • a reaction solution was prepared using the synthesized cDNA, Cycling probe, primer, and Cycleave PCR Reaction Mix (Takara Bio), and the PCR reaction and Gpc-B2 gene expression were detected using a real-time PCR device AriaMX (Agilent).
  • the real-time PCR was performed under the following conditions: after reaction at 95°C for 30 seconds, 45 cycles of 5 seconds at 95°C, 10 seconds at 55°C, and 25 seconds at 72°C were performed.
  • the composition of the real-time PCR reaction solution was as shown below.
  • primer 221124Gpc-B2RTF2 SEQ ID NO: 16: GAGAGCATATATGCAGCTGATTGCG
  • primer 221124Gpc-B2RTR2 SEQ ID NO: 17: ATGAAACTAATATCATACTGTGTTGTGACTCGT
  • a reaction solution was prepared using the synthesized cDNA, primers, and TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio), and a PCR reaction and Gpc-B2 gene expression were performed using a real-time PCR device AriaMX (Agilent). Detected.
  • the real-time PCR was carried out under the following conditions: after reaction at 95°C for 30 seconds, 45 cycles of 95°C for 5 seconds and 61°C for 30 seconds were performed.
  • the composition of the real-time PCR reaction solution was as shown below.
  • FIG. 8 shows the results of a probe assay using Taqman(R) probes.
  • a graph 1001 shows the Gpc-B2 gene expression level of each line
  • a graph 1002 shows the Gpc-B2 gene expression level of "Kitahonami” and "Yumechikara.”
  • a graph 1003 shows the expression level of the genome background
  • a graph 1004 shows the Gpc-B2 gene expression level of "Yumeshihou”.
  • Figure 9 shows the results of a probe assay using a Cycling probe.
  • graph 1005 shows the Gpc-B2 gene expression level of each line
  • graph 1006 shows the Gpc-B2 gene expression level of "Kitahonami” and “Yumechikara”
  • graph 1007 shows the amount of Gpc-B2 gene expression of each line. The expression level is shown.
  • Figure 10 shows the results of the SYBR (registered trademark) Green assay.
  • graph 1008 shows the Gpc-B2 gene expression level of each line
  • graph 1009 shows the Gpc-B2 gene expression level of Kitahonami and "Yumechikara.”
  • a graph 1010 shows the expression level of the genome background
  • a graph 1011 shows the Gpc-B2 gene expression level of "Yumeshihou”.
  • a primer set for amplifying the sequence containing the 2675th and 2747th bases of a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer set for amplifying the sequence containing the 2675th and 2747th bases of the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12,
  • the present invention can be used in the agricultural field, plant breeding field, etc.

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Abstract

コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する判定方法は、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子を表す配列番号１に示す塩基配列の、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列を分子マーカーとして検出する工程を包含する。これにより、コムギの子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する形質を、早期に判定する。

Description

コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方に関する分子マーカー、及びその利用
　本発明は、コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方に関する分子マーカー、これを用いた判定方法、製造方法、判定キット、遺伝子に関する。
　コムギの子実タンパク質含有率は、小麦粉の品質に大きく影響するため、実需の生産物に対する要望として重要である。特に日本では、子実タンパク質含有率が低い薄力粉用のコムギの開発が求められている。また、コムギの穂数は、収量構成要素の１つであるため農業特性として非常に重要である。そのため、コムギにおいて、子実タンパク質含有率及び穂数の形質に関して様々な研究が行われている。
　非特許文献１には、コムギの子実タンパク質含有率の形質に関連する主要な遺伝子の同定について記載されている。
Terasawa et al., 2018　Identification of the major gene associated with grain protein content on chromosome 2B in hard red winter wheat (Triticum aestivum L.)LACC/IGW. 13th International Gluten Workshop. Proceedings p.18-21
　従来、コムギの子実タンパク質含有率及び穂数に関して、所望の形質を有する品種を育種する場合、収穫したコムギを用いて子実タンパク質含有率を測定したり、収穫期のコムギの穂数を計測したりして、品種を選抜している。そのため、コムギを収穫期まで生育させなければ、品種を選抜することができず、時間を要する。
　本発明の一態様は、上述した問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、コムギの子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する形質を、早期に判定するための技術を実現することにある。
　本発明の一態様に係る判定方法は、コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する判定方法であって、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子を表す配列番号１に示す塩基配列の、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列を、コムギ植物における、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する分子マーカーとして検出する工程を包含する。
　本発明の一態様に係る製造方法は、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を製造する製造方法であって、育種により得られたコムギ植物又はその後代系統のコムギ植物から、請求項１から３のいずれか１項に記載された判定方法によって、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を判別する工程を包含する。
　本発明の一態様に係る分子マーカーは、コムギ植物における、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する分子マーカーであって、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明の一態様に係る判定キットは、コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定するための判定キットであって、配列番号２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むフォワードプライマーを含む。
　本発明の一態様に係るコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子であって：（１）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列からなるポリヌクレオチド；（２）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチド；又は、（３）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に対して、１２０個以下の塩基が置換、欠損、付加、又は挿入された塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチド；を含む。
　本発明の一態様に係る判定方法は、コムギ植物における、穂数の程度を判定する判定方法であって、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の変異を検出する工程を包含する。
　本発明の一態様によれば、コムギの子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する形質を、早期に判定することができる。
本発明の一態様に係る分子マーカーを説明する図である。 実施例における、制限酵素処理した増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例における、増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例の子実タンパク質含有率の測定結果を示す図である。 実施例の穂数の測定結果を示す図である。 実施例において、様々な品種における子実タンパク質含有率の測定結果を示す図である。 実施例において検出したＧｐｃ－Ｂ２遺伝子の多型の位置を示す図である。 実施例における、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブを用いたプローブアッセイの結果を示す図である。 実施例における、Ｃｙｃｌｉｎｇプローブを用いたプローブアッセイの結果を示す図である。 実施例における、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎアッセイの結果を示す図である。
　本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。さらに、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、核酸は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。
　本発明の一態様は、コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する技術に関する。本発明の一態様は、コムギ植物において、子実タンパク質含有率の低い個体及び穂数の多い個体の少なくとも一方を判定するために使用することができる。本発明の一態様は、コムギ植物のゲノムに存在する、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の遺伝子型を判定することで、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に基づいてコムギ植物個体を判定する。本発明の一態様は、コムギの品種のうち、子実タンパク質含有率が低い品種及び穂数の多い品種の少なくとも一方を判定するために使用することもできる。なお、本発明の一態様において、子実タンパク質含有率の概念には、あるコムギ植物個体における子実タンパク質の含有率が、他のコムギ植物個体と比較して相対的に高い又は低いことを表す含有率の程度が含まれる。また、本発明の一態様において、穂数の概念には、あるコムギ植物個体における穂数が、他のコムギ植物個体と比較して相対的に多い又は少ないことを表す穂数の程度が含まれる。
　本発明の一態様において、コムギ植物には、イネ科コムギ属の植物全般が含まれる。コムギの品種は、一例として、「きたほなみ」、「ホクシン」「びわほなみ」「ゆめちから」、「キタノカオリ」、「農林６１号」、「シロガネコムギ」、「さとのそら」、「チクゴイズミ」、「ミナミノカオリ」等が挙げられる。
　コムギ植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物であり得る。育種素材の候補植物としては、例えば、交配に用いる親植物、及び、遺伝子組換え技術を利用した分子育種に用いられる植物が含まれる。また、育種のプロセスで得られた植物としては、例えば、コムギ植物の上述したような品種に属する植物を種内交雑した植物、及びこれらの後代系統である。また、コムギ植物は、ある品種に属するコムギ植物と他の品種に属するコムギ植物との交雑植物のように種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。さらに、コムギ植物は、子実タンパク質含有率が低いこと及び穂数が多いことの少なくとも一方が分かっている品種同士を種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。また、コムギ植物は、子実タンパク質含有率が低いこと及び穂数が多いことの少なくとも一方が分かっている個体同士を種内交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。
　本明細書において、植物とは、植物体の一部又は全部であってもよい。植物体の一部としては、例えば、繁殖素材（種子、鱗茎等）、鱗葉、花、根等が挙げられる。
　コムギ植物における「子実タンパク質含有率」とは、コムギ植物の子実中に含まれるたんぱく質の含有率が意図される。なお、「子実タンパク質含有率」は、「子実タンパク質含有量」又は「子実タンパク質含量」と称される場合もある。植物における「穂数」とは、コムギ植物を生育させる単位面積あたりの穂の本数が意図され、コムギ植物の収量を表す指標であることが意図される。コムギの子実タンパク質の含有率は、小麦粉の品質に大きく影響するため、実需の生産物に対する要望として重要である。また、コムギの穂数は、収量構成要素の１つであるため農業特性として非常に重要である。したがって、コムギの子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方を指標としてコムギ植物を容易に選抜することができれば、非常に有益である。
　また、子実タンパク質含有率及び穂数は、コムギの品種毎に異なり得る。一例として、「きたほなみ」は、子実タンパク質含有率が少なく、「ゆめちから」は、子実タンパク質含有率が高い。また、「きたほなみ」は、穂数も多い。特に日本では、子実タンパク質の含有率が低い薄力粉用のコムギ品種の開発が求められており、また、穂数が多く収量の多いコムギは有用である。そのため、「きたほなみ」のように、子実タンパク質含有率が少なく、穂数が多い品種を安定的かつ効率的に育種選抜することが望まれている。一方で、「ゆめちから」のような子実タンパク質の含有率の高いコムギ品種が求められる場合もある。さらに、風が強い地域においては、穂数が多いコムギ植物では風の影響を受けやすく、穂数の少ない系統が望まれる場合もある。すなわち、子実タンパク質含有率が多く、穂数が少ない品種についても同様に、安定的かつ効率的に育種選抜することが望まれている。
　〔コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数に関する分子マーカー〕
　本発明の一態様に係る分子マーカーは、コムギ植物における、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する分子マーカーである。分子マーカーは、（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　分子マーカーは、コムギ植物の第２染色体上の子実タンパク質含有率及び穂数に関する遺伝子座を特定するために用いることができる。子実タンパク質含有率及び穂数に関する遺伝子座とは、子実タンパク質含有率及び穂数に影響する量的形質遺伝子座又は遺伝子領域を意味する。量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｔｒａｉｔ　Ｌｏｃｉ；ＱＴＬ）は、一般に、量的形質の発現に関与する染色体領域を意味する。ＱＴＬは、染色体上の特定の座を示す分子マーカーを使用して規定できる。このような分子マーカーを使用してＱＴＬを規定する技術は、当該技術分野において周知である。
　本発明の一態様に係る分子マーカーは、例として、ＳＮＰマーカー、ＡＦＬＰ（分子増幅断片長多型）マーカー、ＲＦＬＰマーカー、マイクロサテライトマーカー、ＳＣＡＲマーカー、ＣＡＰＳマーカー、ＩｎＤｅｌマーカー等が挙げられる。
　ここで、分子マーカーは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。分子マーカーにおいて、当該ＤＮＡ多型は、コムギの（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）のゲノム配列を基準としたＤＮＡ多型である。基準植物であるＣｈｉｎｅｓｅ　ｓｐｒｉｎｇのゲノム配列（IWGSC RefSeq V2.1）は、ゲノムデータベース（https://www.wheatgenome.org/）に公表されている。
　本発明の一態様に係る分子マーカーは、本実施例に記載された分子マーカー又はこれと同一視できる分子マーカーである。本発明の一態様に係る分子マーカーを用いれば、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の程度を判定することができる。「配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列」は、第２染色体上の子実タンパク質含有率及び穂数に関する遺伝子座上の変異である。第２染色体上の子実タンパク質含有率及び穂数に関する遺伝子座は、基準となるコムギ植物由来の塩基配列からなる。他のコムギ植物においては、基準となる塩基配列に対して上記の変異以外の部分でも塩基配列が異なる部分が含まれ得る。この分子マーカーが位置するゲノム上の領域は、多数のコムギ植物間で保存されているため、ホモロジー検索等の手法によって、この分子マーカーを特定することができる。
　すなわち、他のコムギ植物において、第２染色体上の子実タンパク質含有率及び穂数に関する遺伝子座（すなわち植物間で高度に保存されている遺伝子座）が存在する場合、「配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列」とは、ホモロジー検索等の手法によって、「配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列」に相当するとされた、第２染色体上の子実タンパク質含有率及び穂数に関する遺伝子座上の塩基配列を指す。
　本発明の一態様に係る分子マーカーは、本発明者らが新たに同定した分子マーカーであり、当業者は、この分子マーカーの塩基配列に基づき、当該分子マーカーのゲノム上の位置を特定することができる。
　本発明の一態様に係る分子マーカーは、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域に、当該分子マーカーの塩基配列を検出したとき、当該コムギ植物は子実タンパク質含有率が少なく、穂数が多いと判定することができる。ここで、コムギ植物の子実タンパク質含有率が低い及び穂数が多いとは、他のコムギ植物個体と比較して、コムギ植物の子実タンパク質含有率が相対的に低い、及び、穂数が相対的に多いことが意図される。
　本発明者らは、図１に示すように、コムギ品種「きたほなみ」は、「ゆめちから」や基準植物であるＣｈｉｎｅｓｅ　ｓｐｒｉｎｇと比較して、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域に縦列重複（ｔａｎｄｅｍ　ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が存在していることを見出した。図１は、本発明の一態様に係る分子マーカーを説明する図である。「きたほなみ」は、子実タンパク質含有率が少なく穂数が多いこと、「ゆめちから」は子実タンパク質含有率が高いことが知られている。Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域に縦列重複のような変異を検出することにより、コムギ植物の子実タンパク質の程度及び穂数の程度を判定することができる。
　本発明の一態様に係る分子マーカーは、（ａ１）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ａ２）（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチド、又は、（ａ３）（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列に対して、１２０個以下の塩基が置換、欠損、付加、又は挿入された塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチドである。
　（ａ１）のポリヌクレオチドは、例えば、第２染色体上の子実タンパク質含有率及び穂数に関する遺伝子座の塩基配列に基づき、子実タンパク質含有率が少なく、穂数の多いコムギ植物（例えば、コムギ品種「きたほなみ」）から得ることができる。
　（ａ２）のポリヌクレオチドは、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方を調節する機能は保持し、（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するものであり得る。このような塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、２つの塩基配列をアライメントとすることによって決定することができる。
　（ａ３）のポリヌクレオチドは、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方を調節する機能は保持し、（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、１２０個以下、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個の塩基が置換、欠損、付加、又は挿入されたものであり得る。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、上述したコムギのゲノム配列を参照することにより、又は、子実タンパク質含有率が少なく、穂数の多いコムギ植物のゲノム上におけるＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。
　コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域において、ポリヌクレオチド（ａ１）～（ａ３）を検出したとき、当該コムギ植物は子実タンパク質含有率が少なく、穂数が多いと判定することができる。一方、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域において、ポリヌクレオチド（ａ１）～（ａ３）を検出しないとき、当該コムギ植物は子実タンパク質含有率が多く、穂数が少ないと判定することができる。
　〔子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物〕
　本発明の一態様に係る子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物は、後述する製造方法によって得られる植物である。このようなコムギ植物は、上述した分子マーカーで特定される変異を有し、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物である。
　本発明の一態様に係る子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物は、後述する判定方法及び製造方法に示すように、育種により得られたコムギ植物及びその後代系統から、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を判別することで得られる。なお、上述した分子マーカーで特定される変異を有するように遺伝子工学的に改変した子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物についても、本発明の範疇に含まれる。また、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、コムギ植物において子実タンパク質の含有率の程度及び穂数の程度を判定し、判定結果に基づき選抜される子実タンパク質の含有率が高い及び穂数が少ないコムギ植物についても、本発明の範疇に含まれる。
　〔コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する判定方法〕
　本発明の一態様に係るコムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する判定方法は、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子を表す配列番号１に示す塩基配列の、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列を、コムギ植物における、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する分子マーカーとして検出する工程を包含する。
　本発明の一態様に係る判定方法は、上述した本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、コムギ植物の被検体において、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する。本発明の一態様に係る判定方法は、コムギ植物の被検体のゲノム上において、上述した分子マーカーにより変異を特定することで、被験コムギ植物が、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する。
　本発明の一態様に係る判定方法において、被検体であるコムギ植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物である。被検体であるコムギ植物は、例えば、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物同士の交雑植物、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物とそれ以外のコムギ植物、及び子実タンパク質の含有率が高い及び穂数が低い植物同士の交雑植物、並びにこれらの後代系統であり得る。また、被検体である込むイ植物は、子実タンパク質の含有率及び穂数が不明なコムギ植物同士を交雑した交雑植物及びその後代系統であり得る。
　また、本発明の一態様に係る判定方法において、被検体であるコムギ植物には、遺伝子組換え技術を利用した分子育種に用いられるコムギ植物、分子育種により得られたコムギ植物、半数体育種に用いられるコムギ植物、及び半数体育種により得られたコムギ植物が含まれる。
　本発明の一態様に係る判定方法は、検出する工程において、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域に、前記分子マーカーの塩基配列を検出したときに、当該コムギ植物は、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であると判定する。一方、本発明の一態様に係る判定方法は、検出する工程において、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域に、前記分子マーカーの塩基配列を検出しないときに、当該コムギ植物は、子実タンパク質の含有率が高い及び穂数が少ない、の少なくとも一方であると判定する。
　本発明の一態様に係る判定方法において用いる分子マーカーの詳細については、上述した本発明の一態様に係る分子マーカーの説明を援用する。
　本発明の一態様に係る判定方法の検出する工程において、分子マーカーを用いてコムギ植物における分子マーカーを検出する方法としては特に限定されず、公知の分析方法を用いることができ、例えば、コムギ植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中の分子マーカーの領域を検出することにより分析する方法が挙げられる。本発明の一態様に係る判定方法は、分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、コムギ植物のＤＮＡにおける当該領域を増幅してもよい。すなわち、分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットは、コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定するための判定キットであり得る。
　コムギ植物の被検体のＤＮＡにおける前記領域の増幅は、コムギ植物の被検体から抽出したＤＮＡを鋳型にして、前記領域を増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。そして、得られた増幅断片における塩基配列（遺伝子型）を決定し、決定された塩基配列（遺伝子型）とコムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方との関係を示すデータに基づいて、コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する。増幅断片における遺伝子型の決定方法については、従来公知の方法を用いることができ、一例として、ＤＮＡシーケンス解析、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、リアルタイムＰＣＲを用いたＴａｑＭａｎ解析等である。
　ＰＣＲおいて用いるプライマーセットは、標的の分子マーカーを含む領域のＤＮＡ断片を増幅することができるものである限り、特に限定されず、増幅断片の長さが短くなるようにプライマーセットを設計してもよい。例えば、プライマー増幅断片の長さが、好ましくは、２００塩基対（ｂｐ）以下、１６０ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、１４０ｂｐ以下、１３０ｂｐ以下、１２０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計する。プライマーセットは、フォワードプライマーと、リバースプライマーとが含まれる。これらのプライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、１９ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、又は２５ｂｐ以上であってもよく、５０塩基ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、又は３０ｂｐ以下であってもよい。
　分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットは、コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定するための判定キットである。分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むフォワードプライマーを含む。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、上記のフォワードプライマーを用いることで、品種間の配列同一性が高いＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域を、好適に増幅できることを見出した。上記のフォワードプライマーと組み合わせて用いるリバースプライマーは、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域を増幅させることができるものであれば、特に限定されない。上記のフォワードプライマーと組み合わせて用いるリバースプライマーは、配列番号３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むリバースプライマーであってもよい。
　分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットは、配列番号２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むフォワードプライマーと、配列番号３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むリバースプライマーとを含むプライマーセットであり得る。このようなプライマーセットを用いることで、子実タンパク質含有率が少なく、穂数の多いコムギ植物においては、配列番号４に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、分子マーカーに相当する塩基配列を検出することができる。また、当該プライマーセットを用いれば、分子マーカーを含む領域を特異的に増幅し、アガロース電気泳動により遺伝子型を決定することができる。
　検出する工程におけるＰＣＲは、単独のプライマーセットを含む反応系でＤＮＡ断片を増幅するシングルプレックスＰＣＲ、又は、複数のプライマーセットを含む反応系で遺伝子増幅するマルチプレックスＰＣＲ、のいずれであってもよい。マルチプレックスＰＣＲの場合は、異なる波長を有する蛍光物質（例えば、ＮＥＤ、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＰＥＴ）により標識したプライマーセットを混合してもよい。
　また、分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットは、Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットであってもよい。Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットは、一例として、配列番号５に示されるフォワードプライマーと配列番号６に示されるリバースプライマーとを含む第１プライマーセット；配列番号７に示されるフォワードプライマーと配列番号８に示されるリバースプライマーとを含む第２プライマーセット；配列番号９に示されるフォワードプライマーと配列番号１０に示されるリバースプライマーとを含む第３プライマーセット；及び配列番号９に示されるフォワードプライマーと配列番号１１に示されるリバースプライマーとを含む第４プライマーセット；を含む。第１プライマーセット及び第２プライマーセットを用いたＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲにより、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域及び第１エクソンを増幅することができる。第３プライマーセット及び第４プライマーセットを用いたＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲにより、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子の第１エクソンから第３エクソンまでを増幅することができる。
　このようなＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットを用いることで、子実タンパク質含有率が少なく、穂数の多いコムギ植物においては、配列番号１２に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、分子マーカーに相当する塩基配列を検出することができる。また、当該プライマーセットを用いれば、分子マーカーを含む領域を特異的に増幅し、アガロース電気泳動により遺伝子型を決定することができる。このようなＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットを含む、コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定するための判定キットについても、本発明の範疇に含まれる。
　ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ装置の種類、増幅断片の長さ等に応じて適宜に設定され得る。サイクル条件としては、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程の３工程を１サイクルとする３ステップＰＣＲ法、及び、変性工程とアニーリング及び伸長工程との２工程を１サイクルとする２ステップＰＣＲ法を適用することができる。３ステップＰＣＲにおける反応条件の一例としては、９０～１００℃で４０～６０秒（例えば、９５℃で３０秒）の変性工程、１０～６０秒（例えば、６０秒）のアニーリング工程、及び６５～８０℃で１０～１５０秒（例えば、７２℃で１５０秒）の伸長工程を、１０～４０サイクル（例えば３５サイクル）行う。アニーリング温度は、一例として、５５～７０℃（例えば、６１℃）の初期アニーリング温度から４０～６０℃（例えば、４５℃）の最終アニーリング温度まで、所定サイクル毎に段階的に低下させる条件（例えば、１サイクル毎に１℃低下）が挙げられる。鋳型となるＤＮＡの状態に応じて、分子マーカーを安定的に検出するために、ＰＣＲ反応条件を調整してもよい。
　検出する工程におけるＰＣＲとして、ＰＣＲによる増幅及び分子マーカーの特定を行うＴａｑＭａｎ（登録商標）－ＰＣＲ法のようなリアルタイムＰＣＲを用いてもよい。すなわち、プライマーセットを用いて増幅した増幅断片に含まれる分子マーカーを検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをさらに用いてもよい。リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより、高処理能力の判別方法を提供することができる。なお、ＰＣＲにより増幅した増幅断片において分子マーカーを特定する方法としては、自動ＤＮＡシークエンサー等を用いて増幅断片の塩基配列を決定することにより、解析してもよい。
　コムギ植物の被検体から、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡ抽出方法を用いることができる。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて、ＤＮＡを抽出してもよい。被検体の種類及び夾雑物の量等に応じて、ＤＮＡ抽出工程の前に、適宜に前処理を行ってもよい。また、被検体から抽出されたＤＮＡは、ＰＣＲ反応において鋳型として用いるために、必要に応じて洗浄又は精製してもよい。さらに、被検体から抽出されたＤＮＡを２種類の制限酵素で消化した制限酵素切断断片をＰＣＲにより増幅してもよい。
　本発明の一態様に係るコムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する判定方法によれば、分子マーカーにより、被検コムギ植物の、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度を判定することができる。したがって、判定結果に基づき、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度が所望の程度であるコムギ植物及びその後代系統を選抜することができる。
　本発明の一態様に係る判定方法によれば、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度が所望の程度であるコムギ植物を選抜することが可能であり、育種選抜のための期間を大幅に短縮することができる。また、幼苗の段階で選抜された子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度が所望の程度である実生のみを栽植して生育することで、圃場の利用効率を向上させることができる。
　〔子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物を製造する製造方法〕
　本発明の一態様に係る製造方法は、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を製造する製造方法である。本発明の一態様に係る製造方法は、育種により得られたコムギ植物又はその後代系統のコムギ植物から、本発明の一態様に係る判定方法によって、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を判別する工程を包含する。
　したがって、本発明の一態様に係る分子マーカー、本発明の一態様に係る子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物、及び、本発明の一態様に係る判定方法に関する説明を、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物を製造する方法の説明に援用する。
　本発明の一態様に係る製造方法は、判別する工程の前に、コムギ植物を育種する工程を包含してもよい。育種に用いる親植物としてのコムギ植物は、例えば、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物、子実タンパク質の含有率が高い及び穂数が少ない植物、子実タンパク質の含有率の程度及び穂数の程度が不明なコムギ植物、並びにこれらの後代系統であり得る。
　また、育種に用いる親植物としてのコムギ植物は、本発明の一態様に係る子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物であってもよい。また、育種に用いる親植物としてのコムギ植物は、本発明の一態様に係る判定方法により選抜された子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物であってもよい。すなわち、本発明の一態様に係る製造方法は、育種する工程の前に、本発明の一態様に係る判定方法により、被検コムギ植物から子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物を判別する判別工程をさらに含み得る。
　本発明の一態様に係る製造方法によれば、分子マーカーによりコムギ植物において子実タンパク質の含有率の程度及び穂数の程度を判定し、判定結果に基づき選抜した子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多いコムギ植物を製造することができる。
　また、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、コムギ植物において子実タンパク質の含有率の程度及び穂数の程度を判定し、判定結果に基づき子実タンパク質の含有率が高い及び穂数が少ないコムギ植物を選抜することにより、子実タンパク質の含有率が高い及び穂数が少ないコムギ植物を製造する製造方法についても、本発明の範疇に含まれる。本発明の一態様に係る製造方法は、一例として、ゆめちからのような高タンパク質系統のコムギ植物を製造するとき、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、子実タンパク質の含有率が高いコムギ植物を選抜する。また、風が強い地域においては、穂数が多いコムギ植物では風の影響を受けやすく、穂数の少ない系統が望まれる場合がある。このような場合に、本発明の一態様に係る製造方法は、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、穂数の少ないコムギ植物を選抜する。
　〔コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子〕
　本発明の一態様に係るコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与する遺伝子である。コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子が存在すれば、コムギ植物における、子実タンパク質の含有率が低い、及び、穂数が多い、の少なくとも一方である。
　本発明の一態様に係るコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は：
　（１）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（２）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチド；又は、
　（３）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に対して、１２０個以下の塩基が置換、欠損、付加、又は挿入された塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチド；を含む。
　上記（１）のポリヌクレオチドは、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を含み、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチドである。
　上記（２）のポリヌクレオチドに関して、塩基配列の配列同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であり得る。このような塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、２つの塩基配列をアライメントとすることによって決定することができる。例えば、コムギ植物に由来する変異遺伝子又は相同遺伝子（オーソログを含む）が、上記（２）のポリヌクレオチドの範疇に含まれる。これらの変異遺伝子や相同遺伝子は、コムギ植物の内在性（endogenous）の遺伝子である。本発明の一態様に係る分子マーカーは、これらの変異遺伝子や相同遺伝子上の分子マーカーでありうる。
　上記（３）のポリヌクレオチドに関して、配列番号１の塩基配列において、置換、欠失、付加又は挿入された塩基の個数は、例えば、１２０個以下、１００個以下、８０個以下、６０個以下、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個であり得る。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、上述したコムギのゲノム配列を参照することにより、又は、子実タンパク質含有率が少なく、穂数の多いコムギ植物のゲノム上におけるＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。
　なお、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子が人工的に変異を導入した遺伝子を指す場合、上記「塩基の置換、欠失、付加又は挿入」は、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA, 82: 488-492, 1985）等の部位特異的突然変異誘発法、薬剤を用いた変異原処理、放射線（γ線、重イオンビーム等）の照射による変異誘発手法、部位特異的ヌクレアーゼを利用したゲノム編集等を用いて人工的に変異を導入してもよいし、天然に存在する同様の変異ポリペプチドに由来するものであってもよい。
　コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、又は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の一例は、配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列からなるＤＮＡである。コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子のＣＤＳと共に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の塩基配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。
　コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子を取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではないが、例えば、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリ又はｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする方法が挙げられる。
　また、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子のＤＮＡのうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
　なお、単離されたコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の候補遺伝子が、所望するコムギ子実タンパク質含有率及び穂数を調節する活性を有するか否かは、由来する植物における当該候補遺伝子の発現によって、所望するコムギ子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度が誘導されるかを観察することによって評価することができる。
　コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子として、コムギ品種である「きたほなみ」由来のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の塩基配列である配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
　コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は、コムギ植物における、子実タンパク質含有率及び穂数の調節機構の解明に利用することができる。また、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は、その配列を発現ベクターに組み込む等して、コムギ植物の植物体又は細胞に導入することによって、形質転換体を作製するために用いることができる。コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子が導入されたコムギ植物を栽培することで、コムギ子実タンパク質含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を得ることができる。
　〔コムギ植物における穂数の程度を判定する方法〕
　本発明の一態様に係るコムギ植物における穂数の程度を判定する判定方法（以下、穂数判定方法ともいう）は、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の変異を検出する工程を包含する。穂数が多いことが知られているコムギ品種「きたほなみ」は、「ゆめちから」や基準植物であるＣｈｉｎｅｓｅ　ｓｐｒｉｎｇと比較して、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域に変異が存在している。したがって、本発明の一態様に係る穂数判定方法において、当該変異の有無を検出することによって、コムギ植物における穂数の程度を判定することができる。
　本発明の一態様に係る穂数判定方法において、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の変異を検出する方法としては、一例として、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、本発明の一態様に係る判定方法を実行する方法である。したがって、本発明の一態様に係る分子マーカー、及び、本発明の一態様に係る判定方法に関する説明を、本発明の一態様に係る穂数判定方法の説明に援用する。
　〔コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現を評価する評価方法〕
　本発明の一態様に係る評価方法は、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現を評価する評価方法である。本発明の一態様に係る評価方法は、コムギ植物において、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２２６９番目、２４２６番目、２６７５番目、２７４７番目、２９６４番目、３２１５番目、３３５１番目、３５８５番目、３５９９番目、３６１５番目、３８０５番目、および、３８０６番目の塩基に相当する塩基、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２３８９番目、２５４６番目、２７９５番目、２８６７番目、３０８４番目、３３３５番目、３４７１番目、３７０５番目、３７１９番目、３７３５番目、３９２５番目、３９２６番目、４１３９番目、４１４０番目、４１５３番目、４１５５番目、および、４２３３番目の塩基に相当する塩基、ならびに、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１７７４番目、１９３１番目、２１８０番目、２２５２番目、２４６９番目、２７２０番目、２８５６番目、３０９０番目、３１０４番目、３１２０番目、３３１０番目、３３１１番目、３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、３５４０番目、および、３６１８番目の塩基に相当する塩基を、少なくとも１つ含む領域を増幅するプライマーを用いて、前記コムギ植物のＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡにおける当該領域を増幅することによって、コムギ植物における、本発明の一態様に係るコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現を評価する工程を包含する。コムギ植物において、当該プライマーを含むプライマーセットを含む、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現を評価するための評価キットについても、本発明の範疇に含まれる。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子であるＧｐｃ－Ｂ２遺伝子に特異的な多型領域を複数見出し、これらを含む領域を増幅するプライマーを用いることにより、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子を特異的に増幅できることを見出した。本発明者らが見出したＧｐｃ－Ｂ２遺伝子に特異的な多型の例は、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２２６９番目、２４２６番目、２６７５番目、２７４７番目、２９６４番目、３２１５番目、３３５１番目、３５８５番目、３５９９番目、３６１５番目、３８０５番目、および、３８０６番目の塩基に相当する塩基、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２３８９番目、２５４６番目、２７９５番目、２８６７番目、３０８４番目、３３３５番目、３４７１番目、３７０５番目、３７１９番目、３７３５番目、３９２５番目、３９２６番目、４１３９番目、４１４０番目、４１５３番目、４１５５番目、および、４２３３番目の塩基に相当する塩基、ならびに、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１７７４番目、１９３１番目、２１８０番目、２２５２番目、２４６９番目、２７２０番目、２８５６番目、３０９０番目、３１０４番目、３１２０番目、３３１０番目、３３１１番目、３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、３５４０番目、および、３６１８番目の塩基に相当する塩基である。
　本評価方法において用いられるプライマーは、上述したＧｐｃ－Ｂ２遺伝子に特異的な多型の少なくとも１つを含む領域を増幅するプライマーであればよいが、上述したＧｐｃ－Ｂ２遺伝子に特異的な多型の複数を含む領域を増幅するプライマーであってもよい。本評価方法において用いられるプライマーは、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２６７５番目および２７４７番目の塩基を含む領域を増幅するものであり得る。また、本評価方法において用いられるプライマーは、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４１３９、４１４０番目、４１５３番目、および４１５５番目の塩基を含む領域を増幅するものであってもよい。さらに、本評価方法において用いられるプライマーは、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、および３５４０番目番目の塩基を含む領域を増幅するものであってもよい。また、本評価方法において用いられるプライマーは、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４２３３番目の塩基と、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３６１８番目の塩基とを含む領域を増幅するものであってもよい。
　本発明の一態様に係る評価方法は、コムギ植物において、上述した本発明の一態様に係るコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現の有無、当該遺伝子の発現の程度などを評価する。本発明の一態様に係る評価方法において、発現が評価されたコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子は、本発明の一態様に係る判定方法において、本発明の一態様にかかる分子マーカーの検出に用いることができる。
　コムギ植物のＤＮＡにおける前記領域の増幅は、コムギ植物から抽出したＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡを鋳型にして、前記領域を増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。コムギ植物のＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡにおける前記領域の増幅によるコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現の評価は、一例として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法、Ｃｙｃｌｉｎｇプローブ法等のプローブアッセイ法、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ法等のインターカレーター法等のリアルタイムＰＣＲ解析により行うことができる。配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２２６９番目、２４２６番目、２６７５番目、２７４７番目、２９６４番目、３２１５番目、３３５１番目、３５８５番目、３５９９番目、３６１５番目、３８０５番目、および、３８０６番目の塩基に相当する塩基、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２３８９番目、２５４６番目、２７９５番目、２８６７番目、３０８４番目、３３３５番目、３４７１番目、３７０５番目、３７１９番目、３７３５番目、３９２５番目、３９２６番目、４１３９番目、４１４０番目、４１５３番目、４１５５番目、および、４２３３番目の塩基に相当する塩基、ならびに、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１７７４番目、１９３１番目、２１８０番目、２２５２番目、２４６９番目、２７２０番目、２８５６番目、３０９０番目、３１０４番目、３１２０番目、３３１０番目、３３１１番目、３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、３５４０番目、および、３６１８番目の塩基に相当する塩基を、少なくとも１つ含む領域を増幅させるリアルタイムＰＣＲ解析により、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子の発現の有無、発現の程度などを評価する発現解析を行うことができる。
　リアルタイムＰＣＲ解析において用いるプライマーセットは、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２２６９番目、２４２６番目、２６７５番目、２７４７番目、２９６４番目、３２１５番目、３３５１番目、３５８５番目、３５９９番目、３６１５番目、３８０５番目、および、３８０６番目の塩基に相当する塩基、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２３８９番目、２５４６番目、２７９５番目、２８６７番目、３０８４番目、３３３５番目、３４７１番目、３７０５番目、３７１９番目、３７３５番目、３９２５番目、３９２６番目、４１３９番目、４１４０番目、４１５３番目、４１５５番目、および、４２３３番目の塩基に相当する塩基、ならびに、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１７７４番目、１９３１番目、２１８０番目、２２５２番目、２４６９番目、２７２０番目、２８５６番目、３０９０番目、３１０４番目、３１２０番目、３３１０番目、３３１１番目、３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、３５４０番目、および、３６１８番目の塩基に相当する塩基を、少なくとも１つ含む領域を増幅することができるものである限り、特に限定されず、増幅断片の長さが短くなるようにプライマーセットを設計してもよい。例えば、プライマー増幅断片の長さが、好ましくは、２００塩基対（ｂｐ）以下、１６０ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、１４０ｂｐ以下、１３０ｂｐ以下、１２０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計する。プライマーセットは、フォワードプライマーと、リバースプライマーとが含まれる。これらのプライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、１９ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、又は２５ｂｐ以上であってもよく、５０塩基ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、又は３０ｂｐ以下であってもよい。
　リアルタイムＰＣＲ解析において用いるプライマーセットは、一例として、配列番号１４に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むフォワードプライマーと、配列番号１５に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むリバースプライマーとを含む第５プライマーセットである。また、リアルタイムＰＣＲ解析において用いるプライマーセットの他の例は、配列番号１６に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むフォワードプライマーと、配列番号１７に示す塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むリバースプライマーとを含む第６プライマーセットである。
　ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法に用いるプローブは、一例として、上述した第５プライマーセットと用いられるものであり、配列番号１８に示す塩基配列を含む第１プローブである。また、Ｃｙｃｌｉｎｇプローブ法において用いるプローブは、一例として、上述した第５プライマーセットと用いられるものであり、配列番号１９に示す塩基配列（TGCTCrACCG（配列中“rA”はＲＮＡである））を含む第２プローブである。ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ法には、一例として、上述した第６プライマーセットを用いることができる。
　ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法、Ｃｙｃｌｉｎｇプローブ法、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ法などのリアルタイムＰＣＲは、後述する実施例に示す条件にしたがって行うことができる。また、上述したプライマーセットを用いて従来公知の条件にしたがって、リアルタイムＰＣＲを行ってもよい。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　〔植物材料〕
　日本で良く栽培されている冬小麦品種である、「きたみ８１」（「きたほなみ」又は「きたけい１７６４（北系１７６４）」とも言う、低タンパク質含有率親）及び「かちけい６３」（「ゆめちから」又は「ほっかい２６１（北海２６１号）」とも言う、高タンパク質含有率親）を交配した１９４の倍加半数体系統（ＤＨ系統）を用いた（Ito et al. 2011, Kojima et al. 2015）。ＤＨ系統を、コムギ×トウモロコシ属間交雑によるコムギ半数体育種法により作出した（Inagaki and Tahir 1990）。日本及び世界の３２２のコムギ品種の遺伝子型を同定するために実験を行った。
　〔実地実験〕
　ＤＨ系統及び親系統を、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構、北海道農業研究センター（北海道河西郡芽室町、北緯４２．５５°、東経１４３．０３°）の実験圃場において、２０１５年から２０１７年まで３年間栽培した（実験結果は、２０１５年は２０１５～２０１６年、２０１６年は２０１６～２０１７年、２０１７年は２０１７～２０１８年の結果を表す）。
　実験は、年毎に、異なる圃場及び圃場条件に分割して行った。２０１５年、２０１６年、２０１７年のそれぞれの栽培圃場エリアは、２５３ａ、２４７ａ、及び１８９ａであった。前作は大豆であった。実験のための植え付け日は、２０１５年は、２０１５年９月１６日、２０１６年は、２０１６年９月１５日、２０１７年は、２０１７年９月２５日であった。栽培方法は、２０１５年は、７２ｃｍ幅２ｍ長の畝のプロット、２０１６年は７２ｃｍ幅、６ｍ長の畝のプロットを用い、２０１７年は、基準窒素（Ｎ）施肥（４ｋｇ/１０ａ）及び追加のＮ施肥（６ｋｇ/１０ａ）を４月に行った（Ito et al. 2011）。施肥の総量は、毎年、１０ｋｇ／１０ａ（Ｎ）、８ｋｇ／１０ａ（Ｐ２Ｏ５）、及び４．８ｋｇ／１０ａ（Ｋ２Ｏ）であった。
　〔収量構成要素〕
　６つの収量構成要素の形質：茎長（ＣＬ）、穂長（ＳＬ）、単位面積（ｍ２）当たりの穂数（ＮＯＳ）、千粒重（ＴＫＷ）、検査重（ＴＷ）、及び、単位面積当たりの穀物量（ＧＹ）を、３年間測定した。TW was determined using the test weight module ofＴＷを、Ｉｎｆｒａｔｅｃ　１２４１　ｇｒａｉｎ　ａｎａｌｙｚｅｒ（Foss, Denmark）の検査重モジュールを用いて決定した。単一粒硬度（ＳＫＨ）、単一粒重（ＳＫＷ）、及び単一粒径（ＳＫＤ）を、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｋｅｒｎｅｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＫＣＳ）（(SKCS 4100, Perten Instruments, USA）を用いて、５０粒の平均値として決定した。
　〔子実タンパク質含有率分析〕
　２０１５年から２０１７年の３年間の子実タンパク質含有率を、近赤外反射装置Ｉｎｆｒａｍａｔｉｃ　９５００　ＮＩＲ　Ｇｒａｉｎ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Perten Instruments, Germany）を用いて決定した。
　〔Ｇｐｃ－Ｂ２のＤＮＡシークエンシング〕
　すいすい－ＳＤＮＡ抽出キット（株式会社リーゾ、つくば、日本）を用いて、葉組織からＤＮＡを抽出した。遺伝子増幅のためのプライマーを設計するために、Ｇｐｃ－Ｂ２（Uauy et al. 2006）を検索した（http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository）。増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（QIAGEN GmbH, Hiden, Germany）を用いて精製し、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて、直接配列決定した。
　Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ（Yamamori and Guzman 2013）により、Ｇｐｃ－Ｂ２のプロモータ領域と第１エクソンを増幅した（Ｇｐｃ－Ｂ２前半）。まず、プライマーGPCB2F1（配列番号５：CACGAGGAGCTTGTTGCACC）及びGPCB2R1（配列番号６：AGGATAGGTTTGTCCGTGCC）を用い、次に、プライマーPro Gpc-2B F-8 No5（配列番号７：CCGCGTAGAAGTAGCGGAATAC）及びGPCB2R5（配列番号８：TGCACGGTATAAGCATGATGGA）を用いた。第１から第３エクソンまでを、まずはプライマーNAMB2F1（配列番号９：AGCGCCGTATAGGAGCTCC）及びNAMB2R3（配列番号１０：TGATGGAATAGACCCGGCCA）を用いて、次にプライマーNAMB2F1及びNAMB2R1（配列番号１１：CAGTGCTCACTGAATGCGAC）を用いて増幅した（Ｇｐｃ－Ｂ２後半）。
　シークエンス用のＰＣＲは、下記の通り行った。Ｇｐｃ－Ｂ２前半の第１ＰＣＲは、９５℃で５分間の反応後、９５℃で３０秒；６５℃で３０秒；７２℃で１５０秒を２０サイクルした後、７２℃で７分間反応させた。Ｇｐｃ－Ｂ２前半の第２ＰＣＲは、９５℃で５分間の反応後、９５℃で３０秒；６５℃で３０秒；７２℃で１２０秒を３２サイクルした後、７２℃で７分間反応させた。Ｇｐｃ－Ｂ２後半の第１ＰＣＲは、９５℃で５分間の反応後、９５℃で３０秒；６０℃で３０秒；７２℃で１５０秒を２０サイクルした後、７２℃で７分間反応させた。Ｇｐｃ－Ｂ２後半の第２ＰＣＲは、９５℃で５分間の反応後、９５℃で３０秒；６０℃で３０秒；７２℃で１２０秒を３２サイクルした後、７２℃で７分間反応させた。ＰＣＲ反応液の組成は、表１に示す通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　「きたほなみ」の増幅産物の塩基配列は、配列番号１２に示す塩基配列であり、「ゆめちから」の増幅産物の塩基配列は、配列番号１３に示す塩基配列であった。また、それぞれの増幅産物をＢｍｇＢＩI（ＣＡＣＧＴＣ）により制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動を実施した。
　〔分子マーカーによる遺伝子型の特定〕
　上述したＤＮＡシークエンシングと同様に得たＤＮＡを用いて、「きたほなみ」及び「ゆめちから」のＧｐｃ－Ｂ２のプロモータ領域を増幅した。プライマーとして、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３に示す塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。
　ＰＣＲは、９４℃で５分間の反応後、９４℃で３０秒；６１℃で６０秒；７２℃で１５０秒を３５サイクルした後、７２℃で１０分間反応させる条件で実施した。ＰＣＲ反応液の組成は、表２に示す通りとした。得られた増幅産物について、アガロースゲル電気泳動を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　〔結果〕
　結果を図２～６に示す。図２は、実施例における、制限酵素処理した増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図３は、実施例における、増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図４は、実施例の子実タンパク質含有率の測定結果を示す図である。図５は、実施例の穂数の測定結果を示す図である。図６は、実施例において、様々な品種における子実タンパク質含有率の測定結果を示す図である。
　図２に示すように、Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲによる「きたほなみ」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子の増幅産物は制限酵素により２箇所で切断され、Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲによる「ゆめちから」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子は制限酵素により１箇所で切断された。増幅産物を制限酵素処理してアガロースゲル電気泳動することにより、それぞれの遺伝子型が特定可能であることが示された。
　また、図３に示すように、「きたほなみ」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子（Ｇｐｃ－Ｂ２ｂ）及び「ゆめちから」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子（Ｇｐｃ－Ｂ２ａ）の増幅産物をアガロースゲル電気泳動することにより、分子マーカーによりそれぞれの遺伝子型を特定可能であることが示された。Ｇｐｃ－Ｂ２ｂはプロモータ領域に縦列重複が存在し、Ｇｐｃ－Ｂ２ａはプロモータ領域にこのような変異は存在しなかった。
　図４に示すように、２０１５～２０１７年の各年及びその平均において、Ｇｐｃ－Ｂ２ｂ型の「きたほなみ」は、Ｇｐｃ－Ｂ２ａ型の「ゆめちから」よりも子実タンパク質含有率が低かった。また、図５に示すように、２０１５～２０１７年の各年及びその平均において、Ｇｐｃ－Ｂ２ｂ型の「きたほなみ」は、Ｇｐｃ－Ｂ２ａ型の「ゆめちから」よりも穂数が多かった。
　また、図６に示すように、Ｇｐｃ－Ｂ２ａ型の２３９品種と、Ｇｐｃ－Ｂ２ｂ型の１５品種とにおいて、子実タンパク質含有率を比較したところ、Ｇｐｃ－Ｂ２ｂ型が有意に低かった。
　〔Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子の発現解析〕
　Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子を、多数ある類似のコムギ遺伝子と区別して発現動態を観察するために、プローブアッセイ法に用いるプローブ配列及び検出用ＰＣＲプライマー、並びに、インターカレーター法に用いるＰＣＲプライマーを設計した。
　Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子と類似のコムギ内在性遺伝子とを比較し、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子の多型を検出した。図７に、プローブアッセイ法に用いるために検出したＧｐｃ－Ｂ２遺伝子の多型の位置を矢印で示す。図７に示すＧｐｃ－Ｂ２遺伝子の多型は、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２６７５番目の塩基および２７４７番目の塩基に相当する。インターカレーター法に用いるプライマーセットのフォワードプライマーは、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４１３９番目、４１４０番目、４１５３番目、および、４１５５番目の塩基、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、および３５４０番目の塩基を含むように設計した。インターカレーター法に用いるプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４２３３番目の塩基、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３６１８番目の塩基を含むように設計した。
　検出した多型を含む配列を増幅するプライマーセットを設計することで、Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子の特異的な発現解析を行った。なお、発現解析に用いるプローブアッセイ法に用いるプライマーセットのフォワードプライマーは、ゲノム増幅を抑制するためにエクソンを跨ぐように設計した。設計したプライマーおよびプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲ解析によりＧｐｃ－Ｂ２遺伝子の発現解析を行った。
　Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブおよびＣｙｃｌｉｎｇプローブを用いた発現解析には、プライマー220307Gpc-B2 F1（配列番号１４：CATGGGAGCTGCCCGAGAAG）及び220307Gpc-B2 R1（配列番号１５：CGACGTAGCCGCCCTGTT）を用いた。また、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブとして220307Gpc-B2 1-2（配列番号１８：CGACCTTCGGTGAGCAGGAGTGGTACTTCT）を用いた。さらに、Ｃｙｃｌｉｎｇプローブとして、キメラプローブ220307Gpc-B2chimera1（配列番号１９：TGCTCrACCG（配列中“rA”はＲＮＡである））を用いた。
　Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブを用いたプローブアッセイを、以下に示す条件で行った。ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて葉組織から抽出したＲＮＡを用い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）にてｃＤＮＡを合成した。合成は、逆転写反応を３７℃で１５分、酵素失活を８５℃で５秒行った。なお、ｃＤＮＡの合成の反応液の組成は以下の通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　合成したｃＤＮＡ、Ｔａｑｍａｎプローブ、プライマー、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ＩＩＩ　Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ　ＱＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　Ｌｏｗ　ＲＯＸ（アジレント社）を用いて反応液を調整し、リアルタイムＰＣＲ装置ＡｒｉａＭＸ（アジレント社）を用いてＰＣＲ反応およびＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現を検出した。なお、リアルタイムＰＣＲは、９５℃で３分間の反応後、９５℃で５秒；６０℃で１０秒を４０サイクルさせる条件で実施した。リアルタイムＰＣＲ反応液の組成は、以下に示す通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　Ｃｙｃｌｉｎｇプローブを用いたプローブアッセイを、以下に示す条件で行った。ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて葉組織から抽出したＲＮＡを用い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ（タカラバイオ）にてｃＤＮＡを合成した。合成は、逆転写反応を３７℃で１５分、酵素失活を８５℃で５秒行った。なお、ｃＤＮＡの合成の反応液の組成は以下の通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　合成したｃＤＮＡ、Ｃｙｃｌｉｎｇプローブ、プライマー、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（タカラバイオ）を用いて反応液を調整し、リアルタイムＰＣＲ装置ＡｒｉａＭＸ（アジレント社）を用いてＰＣＲ反応およびＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現を検出した。なお、リアルタイムＰＣＲは、９５℃で３０秒間の反応後、９５℃で５秒；５５℃で１０秒、７２℃で２５秒を４５サイクルさせる条件で実施した。リアルタイムＰＣＲ反応液の組成は、以下に示す通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎによるインターカレーター法には、プライマー221124Gpc-B2RTF2（配列番号１６：GAGAGCATATATGCAGCTGATTGCG）及びプライマー221124Gpc-B2RTR2（配列番号１７：ATGAAACTAATATCATACTGTGTTGTGACTCGT）のプライマーセットを用いた。
　ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎによるアッセイを、以下に示す条件で行った。ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて葉組織から抽出したＲＮＡを用い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）にてｃＤＮＡを合成した。合成は、逆転写反応を３７℃で１５分、酵素失活を８５℃で５秒行った。なお、ｃＤＮＡの合成の反応液の組成は以下の通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　合成したｃＤＮＡ、プライマー、ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用いて反応液を調整し、リアルタイムＰＣＲ装置ＡｒｉａＭＸ（アジレント社）を用いてＰＣＲ反応およびＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現を検出した。なお、リアルタイムＰＣＲは、９５℃で３０秒間の反応後、９５℃で５秒；６１℃で３０秒を４５サイクルさせる条件で実施した。リアルタイムＰＣＲ反応液の組成は、以下に示す通りとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　各アッセイの結果を、図８～１０に示す。図８～１０において、ＫＨは「きたほなみ」、ＹＣは「ゆめちから」、ＫＨＢＣは「きたほなみ」ＢＣ系統、ＹＣＢＣは「ゆめちから」ＢＣ系統の結果を示している。
　図８は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブを用いたプローブアッセイの結果を示す。図８中、グラフ１００１は、各系統のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示し、グラフ１００２は、「きたほなみ」および「ゆめちから」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示している。また、図８中、グラフ１００３は、ゲノムバックグラウンドの発現量を示し、グラフ１００４は、「ユメシホウ」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示している。
　図９は、Ｃｙｃｌｉｎｇプローブを用いたプローブアッセイの結果を示す。図９中、グラフ１００５は、各系統のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示し、グラフ１００６は「きたほなみ」および「ゆめちから」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示し、グラフ１００７は、ゲノムバックグラウンドの発現量を示す。
　図１０は、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎアッセイの結果を示す。図１０中、グラフ１００８は、各系統のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示し、グラフ１００９は、キタホナミおよび「ゆめちから」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示している。また、図１０中、グラフ１０１０は、ゲノムバックグラウンドの発現量を示し、グラフ１０１１は、「ユメシホウ」のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子発現量を示している。
　図８～１０に示すように、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２６７５番目および２７４７番目の塩基を含む配列を増幅するプライマーセット、並びに配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４１３９番目、４１４０番目、４１５３番目、４１５５番目、および、４２３３番目の塩基、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、３５４０番目、および、３６１８番目の塩基を含む配列を増幅するプライマーセットを用いることにより、プローブアッセイ法及びインターカレーター法のそれぞれのアッセイにおいてＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のみを特異的に発現させることが可能であることが示された。
　本発明は、農業分野、植物育種分野等に利用することができる。

Claims (11)

  1. 　コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定する判定方法であって、
    　Ｇｐｃ－Ｂ２遺伝子を表す配列番号１に示す塩基配列の、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列を、コムギ植物における、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する分子マーカーとして検出する工程を包含する、判定方法。
  2. 　前記検出する工程において、コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域に、前記分子マーカーの塩基配列を検出したときに、当該コムギ植物は、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であると判定する、請求項１に記載の判定方法。
  3. 　前記検出する工程において、前記分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、前記コムギ植物のＤＮＡにおける当該領域を増幅する、請求項２に記載の判定方法。
  4. 　子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を製造する製造方法であって、
    　育種により得られたコムギ植物又はその後代系統のコムギ植物から、請求項１から３のいずれか１項に記載された判定方法によって、子実タンパク質の含有率が低い及び穂数が多い、の少なくとも一方であるコムギ植物を判別する工程
    を包含する、製造方法。
  5. 　コムギ植物における、子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方に関する分子マーカーであって、
    　配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの、１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に相当する塩基配列からなるポリヌクレオチド
    である、分子マーカー。
  6. 　コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定するための判定キットであって、
    　配列番号２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むフォワードプライマーを含む、判定キット。
  7. 　配列番号３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むリバースプライマーをさらに包含する、請求項６に記載の判定キット。
  8. 　コムギ植物における、子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方を判定するための判定キットであって：
    　配列番号５に示されるフォワードプライマーと配列番号６に示されるリバースプライマーとを含む第１プライマーセット；
    　配列番号７に示されるフォワードプライマーと配列番号８に示されるリバースプライマーとを含む第２プライマーセット；
    　配列番号９に示されるフォワードプライマーと配列番号１０に示されるリバースプライマーとを含む第３プライマーセット；及び
    　配列番号９に示されるフォワードプライマーと配列番号１１に示されるリバースプライマーとを含む第４プライマーセット；
    を含む、判定キット。
  9. 　コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子であって：
    　（１）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（２）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に対して、８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチド；又は、
    　（３）配列番号１に示す塩基配列の１６１４番目から２２２８番目までの塩基配列に対して、１２０個以下の塩基が置換、欠損、付加、又は挿入された塩基配列からなり、コムギ植物における子実タンパク質含有率及び穂数の少なくとも一方の調節に関与するポリヌクレオチド；
    を含む、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子。
  10. 　コムギ植物における、穂数の程度を判定する判定方法であって、
    　コムギ植物のＧｐｃ－Ｂ２遺伝子のプロモータ領域の変異を検出する工程を包含する、判定方法。
  11. 　コムギ植物において、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２２６９番目、２４２６番目、２６７５番目、２７４７番目、２９６４番目、３２１５番目、３３５１番目、３５８５番目、３５９９番目、３６１５番目、３８０５番目、および、３８０６番目の塩基に相当する塩基、配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２３８９番目、２５４６番目、２７９５番目、２８６７番目、３０８４番目、３３３５番目、３４７１番目、３７０５番目、３７１９番目、３７３５番目、３９２５番目、３９２６番目、４１３９番目、４１４０番目、４１５３番目、４１５５番目、および、４２３３番目の塩基に相当する塩基、ならびに、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１７７４番目、１９３１番目、２１８０番目、２２５２番目、２４６９番目、２７２０番目、２８５６番目、３０９０番目、３１０４番目、３１２０番目、３３１０番目、３３１１番目、３５２４番目、３５２５番目、３５３８番目、３５４０番目、および、３６１８番目の塩基に相当する塩基を、少なくとも１つ含む領域を増幅するプライマーを用いて、前記コムギ植物のＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡにおける当該領域を増幅することによって、前記コムギ植物における請求項９に記載のコムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現を評価する工程を包含する、コムギ子実タンパク質含有率及び穂数調節遺伝子の発現を評価する評価方法。
PCT/JP2023/010818 2022-03-18 2023-03-20 コムギ植物における子実タンパク質含有率の程度及び穂数の程度の少なくとも一方に関する分子マーカー、及びその利用 WO2023176983A1 (ja)

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