CN114134247B - 与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物序列和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物序列和应用。本发明提供了检测谷子基因组中Si5G271900C的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定谷子株高或谷子辅助育种中的应用，所述Si5G271900C为含有SNP位点的谷子株高分子标记，所述SNP位点为序列表中序列1第234位核苷酸，其核苷酸种类为C或T。通过基因组学分析以及相关的分子生物学验证确定所述Si5G271900C是和株高性状紧密相关的分子标记。进一步通过基因与表型性状关联分析结果说明该标记与株高性状紧密关联，是可用于株高性状检测的分子标记，在谷子矮化育种中具有重要的应用价值。

Description

与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物序列和应用

技术领域

本发明属于分子标记辅助育种领域，具体涉及与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物和应用。

背景技术

株高是影响作物产量的重要因素，在上世纪六七十年代的“绿色革命”期间，世界大部分地区的小麦和水稻产量增加了一倍，这得益于半矮秆品种的育种应用。半矮秆品种能够有效利用肥料，且抗倒伏，具有更好的分蘖和收获指数因此挖掘株高调控基因进行矮化育种是提高作物产量的有效措施。谷子是大约10000年前在中国北方驯化的最古老的二倍体C4黍亚科作物之一，其二倍体基因组小、生长期短、自花授粉、种子量大等优点正被用作黍亚科作物功能基因组学的模式植物，也是亚洲、北非、南美和北美国家重要的粮食和饲料作物。谷子在我国农业种植结构调整、产业结构优化和人们膳食结构改良中发挥重要作用，但其相对高密度的种植习惯和较高的株高容易倒伏，特别是在灌浆阶段，导致产量和品质严重下降。因此降低株高是谷子育种的重点，挖掘控制株高性状的重要QTL和基因是谷子矮化育种的重要研究手段。

分子标记辅助选择(MAS Marker-Assisted Selection)是在1990年由LANDE和THOMPSON提出的一种重要的育种手段，是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标基因的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点，较常规育种能够大大缩短育种年限，加快育种进程，提高了育种效率，目前分子标记辅助育种已在主要农作物育种中得到广泛应用。株高作为一个重要的农艺性状，直接关系到作物高产和稳产，但是株高是一个相对复杂的农艺性状，利用传统的植物育种方法研究是非常困难的。我国虽然长期种植谷子，但由于谷子遗传或基因组信息的相对缺乏，严重制约了谷子矮化育种的进展，因此迫切需要开发与谷子株高基因紧密连锁的分子标记。

在植物育种中，常用的分子标记方法有RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism)，RAPD(Random Amplified Polymorphisms DNA)，AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphism)，SSR(Simple Sequence Repeat)，InDel(Insertion-Deletion)，CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)和SNP(Single NucleotidePolymorphism)等。CAPS是在其它分子标记技术的基础上发展起来的，例如水稻著名的半矮秆基因SD1就是利用CAPS等标记进行的定位。由于CAPS标记使用的引物序列特异性强，所以可以重复使用，在基因定位等实验分析中，效果大大强于其它分子标记引物，被得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供与谷子株高性状紧密连锁的分子标记Si5G271900C及其引物序列和应用，例如：如何快速有效的鉴定调控株高QTL位点以及谷子的矮化育种。

为实现上述目的，本发明第一个方面是提供检测谷子基因组中Si5G271900C的多态性或基因型的物质在如下1)-4)中任一种中的应用：

1)鉴定或辅助鉴定谷子株高基因；

2)制备鉴定或辅助鉴定谷子株高的产品；

3)谷子育种；

4)制备谷子育种的产品；

所述Si5G271900C为含有SNP位点的谷子株高分子标记，SNP位点为序列表中序列1第234位核苷酸，其核苷酸种类为C或T。

所述检测谷子基因组中所述Si5G271900C的多态性或基因型(即等位基因)具体可为检测所述Si5G271900C的SNP位点的核苷酸种类。谷子基因组中所述Si5G271900C的SNP位点的基因型可为T/T、C/C或C/T。所述T/T是谷子基因组中所述Si5G271900C的SNP位点为T的纯合型，所述C/C是谷子基因组中所述Si5G271900C的SNP位点为C的纯合型，所述C/T是谷子基因组中所述Si5G271900C的SNP位点为T和C的杂合型。

其中，所述检测谷子基因组中所述Si5G271900C的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定Si5G271900C的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

进一步地，上述的应用中，所述物质包括引物对，所述引物对为扩增包括所述Si5G271900C的谷子基因组DNA片段的PCR引物。

所述物质可为含有所述PCR引物的PCR试剂，也可为含有所述PCR引物或所述PCR试剂的试剂盒。

进一步地，上述的应用中，所述物质包括所述引物对和限制性内切酶Dde I。

进一步地，上述的应用中，所述引物对由引物F和引物R组成；

所述引物F为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子，

所述引物R为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA分子。

第二个方面，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定谷子株高的方法，所述方法包括检测待测谷子的基因型，根据所述待测谷子的基因型鉴定或辅助鉴定谷子的株高；所述基因型为谷子基因组中Si5G271900C的SNP位点的基因型；所述Si5G271900C的SNP位点的核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1第234位核苷酸。

上述方法中，根据所述待测谷子的基因型鉴定或辅助鉴定谷子的株高可为：(1)基因型为T/T的待测谷子株高高于或候选高于基因型为C/C和C/T的待测谷子的株高，(2)基因型为C/T的待测谷子株高高于或候选高于基因型为C/C的待测谷子的株高。

进一步地，上述的方法中，所述检测待测谷子的基因型的方法包括A)或B)：

A)测序；

B)用上述引物对对所述待测谷子基因组DNA进行PCR扩增，再用限制性内切酶DdeI酶切扩增产物，检测酶切产物：根据所述酶切产物确定所述待测谷子的基因型。

根据所述酶切产物确定所述待测谷子的基因型可为：

(1)若酶切产物为233bp，97bp，64bp大小的DNA片段，则待测谷子基因组中Si5G271900C的SNP位点的基因型为T/T；

(2)若酶切产物为330bp和64bp大小的两个DNA片段，则待测谷子基因组中Si5G271900C的SNP位点的基因型为C/C；

(3)若酶切产物为330bp，233bp，97bp和64bp大小的四个DNA片段，则待测谷子基因组中Si5G271900C的SNP位点的基因型为C/T。

第三个方面，本发明提供上述的方法在谷子育种中的应用。

第四个方面，本发明提供一种谷子育种的方法，所述方法包括如下步骤：选择Si5G271900C的SNP位点的基因型为C/C的谷子作为亲本进行育种，所述Si5G271900C的SNP位点为序列表中序列1第234位核苷酸，其核苷酸种类为C或T，所述基因型为C/C是谷子基因组中所述Si5G271900C多态位点为C的纯合型。

本文中，所述待测谷子可选自中矮秆263A(♀)和高秆育成品种创29(♂)的杂交后代，如F2代或其以上后代。

第五个方面，本发明提供鉴定或辅助鉴定谷子株高的产品，其包括上述检测谷子基因组中Si5G271900C的多态性或基因型的物质。

本发明中，所述谷子育种的目的是筛选目的株高的谷子。

本发明中，所述谷子育种具体可为谷子矮化育种。

本发明中，所述谷子育种可为谷子辅助育种。

本发明中，所述产品可为试剂或试剂盒。

我们以优良中矮秆263A和高秆育成品种创29为研究对象，通过组学分析以及相关的分子生物学验证最终确定Si5G271900基因是和株高性状紧密相关的关键候选基因。我们设计了分子标记Si5G271900C，CAPS检测验证实验表明这个标记在F2代分离群体单株以及两个亲本的基因型与株高性状偶联，进一步用R语言AOV函数对Si5G271900C标记在两个亲本以及F2群体各单株的基因型进行单因素方差分析(把呈现263A亲本基因型标记为C/C，呈现创29亲本基因型标记为T/T，把二者的杂合基因型标记为C/T，用TukeyHSD函数对C/C，T/T，C/T基因型进行多重比较分析。通过方差分析明确基因型存在显著差异，通过多重比较分析进一步明确C/C和T/T，C/C和C/T以及T/T和C/T之间均存在显著差异，说明该标记与株高性状紧密关联，是可用于株高性状检测的分子标记，在谷子矮化育种中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为263A和创29及其F2群体的株高表型分析；其中，图中A为♀263A和♂创29及F2群体不同株高单株照片；图中B为双亲263A和创29的株高数据统计；图中C为F2群体不同株高植株的分布频率。

图2为Si5G271900C标记的CAPS验证酶切产物电泳图。其中：A为Si5G271900C在两个亲本以及40个极端高的F2单株的Dde I酶切电泳图；B为Si5G271900C在两个亲本以及40个极端矮的F2单株的Dde I酶切电泳图；C为Si5G271900C在部分中间高F2单株以及两个亲本的Dde I酶切电泳图。

图3为与株高关联的Si5G271900C分子标记在F2群体单株基因型间的多重比较分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

中矮秆263A申请自国家农作物种质保存中心(国家粮食作物中期库)(https://cgris.net/query/do.php#粮食作物,谷子,00029712)，其保藏编号为：00029712，公众可从国家种质资源库申请获得。

中矮秆品种263A的优良性状如下：

263A是中国农业科学院作物科学研究所培育的中矮秆高度雄性不育系，该不育系属于禾本科(Gramineae)狗尾草属(Setaria)，学名Setaria italica(L.)Beauv.(谷子)。原产地北京，幼苗绿色，苗期长势壮，分蘖数为2，一株茎数为3，茎秆矮粗壮，抗倒性突出，主茎长度为87厘米，主茎直径为0.77厘米，主茎节数为14，单株秆重17.63g。抽穗期和早熟性中等，花期较为集中，不育度94％左右，育性稳定性好。单株穗重4.62g，单株粒重2.33g，千粒重2.96g，主穗长度16厘米，穗型为纺锤形，刺毛长度为中，穗松紧度为中，粒色为红褐色，米色为淡黄，生育期为86天，对谷瘟病、谷锈病高抗，白发病抗性为中抗。263A在谷子杂交种测配中，配合力高，配制出中杂谷5等优良杂交种。

高秆育成品种创29申请自国家农作物种质保存中心(国家粮食作物中期库)(https://cgris.net/query/do.php#粮食作物,谷子,00029711)，其保藏编号为：00029711，公众可从国家种质资源库申请获得。

高秆育成品种创29的优良性状如下：

创29是中国农业科学院作物科学研究所培育的高配合力恢复系。属于禾本科(Gramineae)，狗尾草属(Setaria)，学名(Setaria italica(L.)Beauv.(谷子)，原产地北京，幼苗叶色绿色，幼苗鞘色绿色，分蘖数为0，一株茎数为1，主茎长度为139厘米，主茎直径为0.82厘米，主茎节数为16，单株秆重24.9g，单株穗重22.3g，单株粒重18.21g,千粒重2.88g，主穗长度22.6厘米，穗型为纺锤形，刺毛长度为中，穗松紧度为中，粒色为黄色，米色为淡黄，生育期为89天。创29全生育期长势强，抽穗期中等，结实丰产性好。创29茎秆柔韧，抗倒伏性突出，对谷瘟病抗性为高中抗，谷锈严重度为高抗，白发病抗性为中抗。在杂交种测配中创29配合力好，是测配的数百份恢复系中表现突出。

实施例1、亲本及F2分离群体单株株高表型测量及统计分析

将中矮秆品种263A(母本，♀)和高秆育成品种创29(父本，♂)种植于北京昌平试验田内，田间管理同当地大田管理，在成熟期测量株高。测量株高为人工测量：将立尺置于植株附近，拉直其主茎后测量由基部(分蘖品种为分蘖节)到穗顶部的垂直高度。263A株高较矮，创29植株高度显著高于263A(图1中A)。分别测量了20株263A和创29植株株高，263A平均株高为86.8cm，最低株高为84.2cm，最高株高为99.0cm；创29平均株高为138.5cm，最低株高为124.0cm，最高株高为146.0cm(表1)。♀263A和♂创29平均株高相差51.7cm(图1中B)。测量♀263A×♂创29的F2杂交群体的399株植株的株高表型，发现株高呈现出性状分离的现象(图1中A和图1中C)，株高主要分布于130.0-140.3cm区间范围内，植株的最高茎秆高度为162.0cm，植株的最矮茎秆高度为57.0cm，其中植株的平均株高茎秆高度为127.6cm(图1中C)。♀263A×♂创29F2群体的株高性状的表型变异系数(CV)为0.2，偏度为-0.9，峰度为0.6(表1)，说明调控263A和创29的株高性状为数量性状。

表1.谷子F₂群体株高性状的分布统计

注：^a指主穗或主茎的性状。

实施例2、与株高性状关联的CAPS标记开发及验证

通过转录组和基因组学分析我们明确了和株高性状紧密相关的候选基因为Si5G271900。和谷子品种豫谷1号基因组(参考基因组)相比，Si5G271900基因在高秆育成品种创29的5号染色体33,321,911bp处的碱基C变异成碱基T，而中矮秆品种263A基因组未发生变异，于是我们在变异位点附近设计分子标记进行CAPS验证。我们首先使用网页在线工具dCAPS Finder 2.0进行CAPS标记、标记序列扩增引物以及最佳酶切位点(Dde I)筛选，选取如下Si5G271900CF和Si5G271900CR扩增引物对，：Si5G271900CF：5'-TGCTGCACTGCTTTGATGGTTG-3'(SEQ ID No.2)；Si5G271900CR：5'-CCACAACACCGAAGCTGAATAG-3'(SEQ ID No.3)。该引物对扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，即为Si5G271900C分子标记序列，SNP位点位于SEQ ID No.1所示序列的第234位，为C或T。SEQ ID No.1中的第234位Y表示T或C。

分别以亲本中矮秆品种263A(♀)和高秆育成品种创29(♂)以及399株F2单株基因组DNA为模板，用Si271900C分子标记的扩增引物对Si271900CF和Si271900CR进行PCR扩增。由于高秆品种创29中C/T碱基的变异，导致产生一个新的Dde I酶切位点，基因组DNA经DdeI酶切后会出现233bp，97bp，64bp三种带型，而矮秆品种263A中没有碱基变化，酶切后出现330bp和64bp两种带型，与创29的带型不同，这些带型的变化会直接反应株高性状的变化。之后酶切产物跑琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并作带型统计分析，结果见图2。PCR扩增反应体系见表2。酶切反应体系见表3。

表2.PCR反应体系

PCR反应温度程序：先94℃4min(预变性)；然后进行36个如下循环：先94℃30s(变性)，然后60℃30s(引物退火)，最后72℃1min(引物延伸)；最后72℃5min。

表3.酶切反应体系

反应条件：37℃，3h。

图2为Si5G271900C标记的CAPS验证酶切产物电泳图。其中：A为Si5G271900C在两个亲本以及40个极端高(F2群体最高的40株)的F2单株的Dde I酶切电泳图；B为Si5G271900C在两个亲本以及40个极端矮(F2群体最矮的40株)的F2单株的Dde I酶切电泳图；C为Si5G271900C在部分中间高F2单株以及两个亲本的Dde I酶切电泳图。在图A和B中，1表示D5000 DNAmarker，2和3分别代表以263A和创29基因组DNA为模板，Si5G271900CF和Si5G271900CR引物对的PCR扩增产物；4和5号代表Dde I酶切后的263A扩增产物和创29扩增产物。红色星号(*)表示杂合带型。在图C中，数字1和2表示经过Dde I酶切的263A和创29扩增产物。其它数字为F2单株编号。圆符号表示F2单株表现出与创29相同的带型(16株)。菱形符号表示F2单株表现出与263A相同的带型(11株)，其它均显示杂合带型。

酶切带型统计分析结果：40株极端高秆中20株带型与高秆育成品种创29表现一致，16株带型表现出杂合，4株带型与矮秆不育系263A表现一致(图2中A)；40株极端矮秆24株带型与矮秆不育系263A表现一致，11株带型表现出杂合，5株带型与高秆育成品种创29表现一致(图2中B)，在319株中间高度单株中，杂合带型241株，263A带型47株，创29带型31株(图2中C)，这些结果说明Si5G271900C基因型与株高性状存在相关性。

实施例3、Si5G271900C标记基因型与株高性状的关联度分析

根据酶切产物带型确定待测谷子的基因型：由于高秆品种创29中C/T碱基的变异，对于Si5G271900C分子标记的基因型为T/T，即谷子基因组中所述Si5G271900C的SNP位点为T的纯合型，导致产生一个新的Dde I酶切位点，基因组DNA经Dde I酶切后会出现233bp，97bp，64bp三种带型，而矮秆品种263A中没有碱基变化，对于Si5G271900C分子标记的基因型为C/C，即谷子基因组中所述Si5G271900C的SNP位点为C的纯合型，引物扩增的DNA片段只有一个Dde I酶切位点，酶切后出现330bp和64bp两种带型。F2群体除出现上述两个亲本带型外，还会出现杂合带型，即对于Si5G271900C分子标记的基因型为C/T，即谷子基因组中所述Si5G271900C的SNP位点为T和C的杂合型，基因组DNA经Dde I酶切后会出现330bp，233bp，97bp和64bp四种带型。

为了进一步明确Si5G271900C标记基因型与株高性状的关联度，我们用R语言AOV函数对Si5G271900C标记在两个亲本以及F2群体各单株的基因型进行单因素方差分析，在方差分析的基础上进一步用TukeyHSD函数进行多重比较分析，结果见图3。从图3结果看出：C/C基因型有75株，T/T基因型为72株，C/T基因型有249株，有效基因型单株共计396株。其中C/C的平均高度为113.50cm，T/T基因型的平均高度为136.55cm，C/T的平均高度129.04cm。基因型C/C和T/T之间的P值均为0，C/T的P值为0.006，均小于0.01，说明基因型两两之间的差异均为显著，表明Si5G271900C分子标记与株高性状紧密关联。F2代Si5G271900C标记基因型与株高的具体数据及统计数据分别见表4和表5。

表4.F2代Si5G271900C标记基因型与株高的具体数据

表5.F2代Si5G271900C标记基因型与株高的统计数据

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 394

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 1

tgctgcactg ctttgatggt tgtactcgtt tccttaaatg tgaattgaat tgcatatttc 60

acgagagaag tgcaattttt tagtggctta attgtctgat tagggatgtc taaaagtctg 120

ccgtagctat gcatgcatga ttagtggtaa cagtaataac ttttttgaag gtcaaaactg 180

atagactcac ttttacagcc ctagtgagga aggagattgc agatgaaact gacygagcga 240

ctggccgcac aaagcaaata tcaactgtgc ccatttattt gagcatatat tccccaaatg 300

gtatgaataa aatcctggca atatgttggc tcagttcata ctgtttgctg ttattgcttt 360

accacgtccc tactattcag cttcggtgtt gtgg 394

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 2

tgctgcactg ctttgatggt tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 3

ccacaacacc gaagctgaat ag 22

Claims (4)

1.检测谷子基因组中Si5G271900C的多态性或基因型的物质在如下1）-4）中任一种中的应用：

1）鉴定或辅助鉴定谷子株高基因；

2）制备鉴定或辅助鉴定谷子株高的产品；

3）谷子育种；

4）制备谷子育种的产品；

所述Si5G271900C为谷子基因组中的一个SNP，其核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1第234位核苷酸；

所述物质包括引物对，所述引物对为扩增包括所述Si5G271900C的谷子基因组DNA片段的PCR引物；

所述物质还包括限制性内切酶Dde I；

所述引物对由引物F和引物R组成；

所述引物F为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA分子，

所述引物R为核苷酸序列是SEQ ID No. 3的单链DNA分子；

所述谷子为矮秆263A和高秆育成品种创29的杂交后代。

2.一种鉴定或辅助鉴定谷子株高的方法，其特征在于：所述方法包括检测待测谷子的基因型，根据所述待测谷子的基因型鉴定或辅助鉴定谷子的株高；所述基因型为谷子基因组中Si5G271900C的基因型；所述Si5G271900C为谷子基因组中的一个SNP，其核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1第234位核苷酸；

根据所述待测谷子的基因型鉴定或辅助鉴定谷子的株高为：基因型为T/T的待测谷子株高高于或候选高于基因型为C/C和C/T的待测谷子的株高；基因型为C/T的待测谷子株高高于或候选高于基因型为C/C的待测谷子的株高；所述T/T是谷子基因组中所述Si5G271900C为T的纯合型；所述C/C是谷子基因组中所述Si5G271900C为C的纯合型；所述C/T是谷子基因组中所述Si5G271900C为T和C的杂合型；

所述检测待测谷子的基因型的方法包括A）或B）：

A）测序；

B）用权利要求1中的所述引物对对所述待测谷子基因组DNA进行PCR扩增，再用限制性内切酶Dde I酶切扩增产物，检测酶切产物：根据所述酶切产物确定所述待测谷子的基因型；

所述待测谷子为矮秆263A和高秆育成品种创29的杂交后代。

3.权利要求2所述的方法在谷子育种中的应用。

4.一种谷子育种的方法，包括如下步骤：选择Si5G271900C 的基因型为C/C的谷子作为亲本进行育种，所述Si5G271900C为谷子基因组中的一个SNP，其核苷酸种类为C或T，为序列表中序列1第234位核苷酸，所述C/C是谷子基因组中所述Si5G271900C为C的纯合型；

所述Si5G271900C 的基因型为C/C的谷子为矮秆263A为母本和高秆育成品种创29为父本的杂交F2代或其以上后代。