CN115873972A - 一种与燕麦株高相关的kasp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种与燕麦株高相关的KASP分子标记及其应用，通过对WAOAT2132×Carcas的F8，三分三×Caracas的F2群体进行分析，证实该标记可准确找到含Dw6的矮秆品种，本发明核苷酸序列为SEQ ID NO:4‑6的KASP标记引物是燕麦6D染色体上矮秆基因Dw6基因共分离的分子标记，连锁程度高，在燕麦选育中对其亲本进行有目的地选择，实现快速筛选具有该位点的植株，进而应用于燕麦育种中，不仅筛选快速精准，不受环境影响，有助于提高育种工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和分子育种技术领域，尤其涉及一种与燕麦株高相关的KASP分子标记及其应用。
背景技术
燕麦(AvenasativaL.)隶属于禾本科，早熟禾亚科，燕麦属，是世界第六大粮饲兼用型作物，广泛种植于世界各地，具有耐瘠薄、耐寒抗旱、不与水稻小麦等其他禾谷类作物争夺耕地以及农业风险系数低等优点，在保障我国粮食安全生产中占据着重要的作用，然而目前燕麦的生产实践中仍面临诸多问题，其中植株过高，易倒伏，从而导致产量降低、品质变差和不易机械收割是燕麦生产中最主要的限制因素；
分子标记辅助选择育种技术，是利用控制目标性状位点/基因连锁的分子标记，通过分子生物学检测基因分型，达到对目标性状选择的目的，其优点是简单快速，不受环境互作的影响，能够快速且高速的选育出目标资源材料；
目前部分学者已对燕麦矮杆基因Dw6进行了基因定位，发现Dw6 在燕麦育种中具有重要的应用价值，然而与燕麦矮秆相关且用于实际分子育种的分子标记却并不多，，因此，本发明提出一种与燕麦株高相关的KASP分子标记及其应用以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种与燕麦株高相关的KASP分子标记及其应用，该与燕麦株高相关的KASP分子标记中核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6的KASP标记引物是燕麦6D染色体上矮秆基因Dw6基因共分离的分子标记，连锁程度高，在燕麦选育中对其亲本进行有目的地选择，显著提高不同遗传背景中筛选含Dw6基因的材料的选择鉴定效率；
该标记可用于检测Dw6基因，快速筛选具有该位点的植株，进而应用于燕麦育种中，不仅筛选快速精准，不受环境影响，提高育种工作效率。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种与燕麦株高相关的KASP引物组，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示的特异性KASP引物组，该引物组可特意性扩增检测标记6-1906。
一种KASP引物组在燕麦Dw6矮杆基因检测中的应用，权利要求 1所述的KASP引物组中核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6引物分子标记与Dw6基因共分离，所述核苷酸序列为SEQID NO:4-6引物分子标记为SNP分子标记，多态性为C/A，通过核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6引物组合扩增得到。
进一步改进在于：所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6引物中核苷酸序列为SEQ IDNO:4-5两端添加了不同的荧光修饰基团FAM和HEX。
一种KASP引物组在筛选具有燕麦株高基因Dw6燕麦材料方法中的应用，以待测燕麦样本基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的扩增引物组进行荧光定量PCR扩增，对扩增结果进行基因型分型：检测到6-1906F1对应的碱基C且未检测到6-1906F2对应的碱基A，则待测燕麦材料不含有的Dw6基因；
若同时检测到6-1906F1对应的碱基C和6-1906F2对应的碱基 A，则待测燕麦材料含有杂合的Dw6基因；
若未检测到6-1906F1对应的碱基C而检测到6-1906F2对应的碱基A，则待测燕麦材料含有纯合Dw6基因。
一种KASP引物组在矮秆燕麦品种选育方法中的应用，使用权利要求1中所述的KASP分子标记引物组。
本发明的有益效果为：本发明核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6的 KASP标记引物是燕麦6D染色体上矮秆基因Dw6基因共分离的分子标记，连锁程度高，在燕麦选育中对其亲本进行有目的地选择，显著提高不同遗传背景中筛选含Dw6基因的材料的选择鉴定效率；
该标记可用于检测Dw6基因，快速筛选具有该位点的植株，进而应用于燕麦育种中，不仅筛选快速精准，不受环境影响，有助于提高育种工作效率。
附图说明
图1为本发明实施例1燕麦矮秆基因Dw6在6D染色体上的定位图。
图2为本发明实施例1Caracas×WAOAT2132的F8株系中分子标记6-1906检测的荧光读值结果图。
图3为本发明实施例2三分三×Caracas的F2株系中分子标记 6-1906检测的荧光读值结果图。
图4为本发明实施例3流程图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
先利用含Dw6基因的矮杆亲本“WAOAT2132”和高杆亲本“Caracas”杂交构建的F2群体对Dw6进行了初步定位，同时采用单粒传法构建了重组自交系，在F6代对后代表型进行观察，从270个株系中找到两个株高仍然发生分离的株系“09”和“244”，随后通过自交并观察表型的方式筛选出候选近等基因系，利用初步定位获得连锁标记对近等基因系进行检测，确认其为Dw6/dw6近等基因系。对两对近等基因系群体前三节茎进行混样RNA-seq测序。随后利用所获得的转录组数据挖掘SNP标记，筛选在两个近等基因系中具有一致性的差异SNP位点作为候选SNP。结合参考基因组，确定多态性标记染色体上的物理位置。利用JoinMap软件结合株高表型信息与基因型数据构建Dw6 基因目标区间的遗传图谱。利用JasonGen的AQP基因分型系统对亲本及重组自交系F8群体中高杆性状植株和矮杆性状植株进行分型检测，筛选连锁紧密，分型结果较好的KASP标记。
实施例1
根据图1和图2所示，本实施例提供了一种与燕麦株高相关的 KASP分子标记方法，燕麦株高候选位点及其分子标记的获得包括以下步骤：
(1)以含Dw6基因的品种“WAOAT2132”为母本，高杆品种“Caracas”为父本杂交获得杂交种F1，F1自交产生F2，采用单粒传法获得含有270个株系的F8代重组自交系RIL群体。
(2)RIL群体株高性状多年环境下的鉴定
于2018-2019年度种植于成都市温江区和四川省崇州市(四川农业大学现代研发基地)及2019-2020年度种植于成都市温江区。每个株系种植1行，每行2m，行距0.3m，每行20粒种子，常规田间管理，生长期间没有发生严重病虫害和倒伏。燕麦成熟后，每个株系随机选取5株调查株高，从茎基部到燕麦穗顶部(不包括芒长)的距离，取 5株的平均值。
(3)RNA-seq测序及分析
a)构建近等基因系：在F6代对后代表型进行观察，从270个株系中找到两个株高仍然发生分离的株系“09”和“244”，随后通过自交并观察表型的方式筛选出候选近等基因系。
b)近等基因系RNA-seq测序
将两对近等基因系“09”和“244”前三节茎进行混样转录组测序。根据RNA-seq测序数据获取在两对近等基因系之间存在共有差异的SNP位点，转化为KASP标记，利用BIO-RAD实时荧光定量PCR仪进行基因分型。
c)WAOAT2132×Caracas的F8家系群体分析：利用CTAB法提取基因组DNA。利用以上步骤获得的多态性KASP标记为引物对亲本及F8家系群体DNA进行扩增，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本 Caracas基因型记为“A”，与WAOAT2132基因型记为”B”，杂交F1代的基因型记为“H”，群体材料中，分型与Caracas相同的记为“A”，与WAOAT2132基因型记为”B”，与杂交F1代相同的杂合类型记为“H”。
d)连锁图谱的构建：根据标记的分型结果，利用JoinMap软件结合株高表型信息与基因型数据构建Dw6基因目标区间的遗传图谱，并计算Dw6基因与分子标记之间的遗传距离。
表1 5对KASP标记引物
(4)引物检测
以RIL群体的270份燕麦样本基因组DNA为模板，上述KASP标记引物对模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下
所述引物混合液中上游引物F1和上游引物F2和下游引物R按照 10ng/ul的浓度，分别加入60ul，60ul和150ul并添加ddH2O 230ul 进行混合后制成，PCR反应程序如下所示
PCR产物检测使用BIO-RAD iCycler Thermal Cycler w/iQ5Optical Module forRTPCR(Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR 仪)在37℃进行荧光收集，利用生物信息学软件BioRadCFXManager 对PCR产物进行分型，将检测到与Caracas分型结果相同的植株基因型记为“A”，为高秆植株株系，与WAOAT2132一致的基因型记为”B”，为高秆植株株系，绿色三角荧光为杂合株系，基因型记为“H”。结果如图1和图2所示，最终得到6-1906与Dw6共分离，图1为燕麦矮秆基因Dw6在6D染色体上的定位示意图，图2为Caracas× WAOAT2132的F8株系中分子标记6-1906检测的荧光读值结果示意图，其中，FAM(正方形，“WAOAT2132”)荧光为含矮秆基因的株系，HAX (圆形，”Carcas")荧光为高秆的株系，三角形荧光为杂合株系，菱形荧光为空白对照。
实施例2
根据图3所示，本实施例提供一种核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6 的KASP引物在控制株高基因Dw6的应用，包括以下：
(1)利用含矮秆基因Dw6的燕麦突变体材料WAOAT2132为母本，高秆燕麦品种三分三为父本构建F2群体，在后代中随机选择96个单株，提取DNA。
(2)对获得的96个单株进行6-1906标记检测，具体方法为：在苗期用CTAB法提取96个株系的DNA，以其作为模板，以分子标记 6-1906的特异性引物对为引物进行荧光定量PCR扩增，所述引物为：
FAM标签上引物：(“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”为FAM标签序列)GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAAGATGGCACTCGGATGA(SEQ ID NO:5)
HEX标签上引物：(“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”为HEX标签序列)GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAAGATGGCACTCGGATGC(SEQ ID No:4)
通用下游引物：GCAAAGTGAGACAGTTTCACACC(SEQ ID NO:6)。
上述PCR扩增体系为：5μL Master Mix、混合引物1.4μL、1ul 模板DNA、ddH2O加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。上述混合引物是由三条引物SEQ ID No： 4、SEQ ID No：5和SEQ ID No：6按照10ng/μL的浓度，分别加入 120μL，120μL和300μL并添加ddH2O460μL进行混合后制备而成的。
PCR反应体系包括94℃预变性15min；94℃变性20sec，61℃退火60sec(每一个循环降低0.6℃)，共10个循环；94℃变性20sec， 55℃退火60sec，共30个循环。
荧光读值结果(见图3)，将检测到的与Caracas分型结果相同的植株基因型记“A”，为矮秆植株株系，与三分三一致的基因型记为”B”，为高秆植株株系，绿色三角荧光为杂合株系，基因型记为“H”。单株基因型与田间表型值如表2所示
表2三分三×CaracasF2代单株6-1906分型结果统计
实施例3
根据图4所示，本实施例提供一种KASP引物组在筛选具有燕麦株高基因Dw6燕麦材料方法中的应用，包括以下步骤：
(1)提取待测燕麦样品的DNA；
(2)10uL的反应体系包括样本模板DNA(50-100ng/uL)1uL， KASP Master Mix5uL，混合引物1.4uL,ddH2O 2.6uL。反应体系包括94℃预变性15min；94℃变性20sec，61℃退火60sec(每一个循环降低0.6℃)，共10个循环；94℃变性20sec，55℃退火60sec，共30个循环。
(3)所述荧光定量PCR至少有3个独立的以ddH2O代替DNA模板的空白。
(4)根据分型结果对待测样本DNA基因型进行判断，其中靠近 Y轴的蓝色方块表示携带A等位变异的含Dw6矮秆基因的纯合体，靠近X轴的黄色圆点表示携带C等位的不含Dw6基因的纯和体，X,Y轴之间的绿色小三角表示同时携带C/A等位变异的含Dw6基因的杂合体，黑色菱形表示以ddH2O代替样本模板DNA的空白对照。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种燕麦矮秆基因Dw6在调控燕麦株高上的应用，其特征在于所述矮杆基因位于燕麦6D染色体。
2.一种KASP引物组在燕麦Dw6矮杆基因检测中的应用，其特征在于权利要求1所述的KASP引物组中核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6引物分子标记与Dw6基因共分离，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6引物分子标记为SNP分子标记，多态性为C/A，通过核苷酸序列为SEQ IDNO:4-6引物组合扩增得到。
3.根据权利要求2所述的一种KASP引物组在燕麦Dw6矮杆基因检测中的应用，其特征在于：所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4-6引物中核苷酸序列为SEQ ID NO:4-5两端添加了不同的荧光修饰基团FAM和HEX。
4.一种KASP引物组在筛选具有燕麦株高基因Dw6燕麦材料方法中的应用，其特征在于使用权利要求1中所述的KASP分子标记引物组。
5.一种KASP引物组在矮秆燕麦品种选育方法中的应用，其特征在于使用权利要求1中所述的KASP分子标记引物组。
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