CN108179220A - 小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子遗传育种领域，公开一种小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的分子标记。本发明通过分子标记方法确定矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，与分子标记5A‑6774933连锁，遗传距离为0.4cM，可作为小麦矮秆基因Rht12辅助选择的分子标记。本发明还公开了该分子标记对应的引物序列及利用KASP技术检测该标记的流程。利用该分子标记可以在分子水平上快速筛选小麦后代群体中含有矮秆基因Rht12的个体，准确性高，大大提高了矮化育种效率。
Description
技术领域
本发明属于植物分子遗传育种技术领域，特别涉及小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记及其应用，以及筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料的方法。
背景技术
小麦是全球性的重要粮食作物，全世界约有40％的人口以小麦为主食。矮化育种是获得小麦高产的重要途径，20世纪60年代，矮秆基因(Rht1和Rht2)引入小麦生产，显著提高了小麦的抗倒伏性和耐高肥水能力，使世界小麦产量大幅提升，并引发了第一次“绿色革命”，为解决粮食安全问题做出了巨大贡献。然而，当前小麦生产上应用的矮秆基因仍以Rht1、Rht2为主，据统计，世界上推广的小麦品种，约有70％至少携带Rht1或Rht2中的一个(Rebetzke G J,Ellis M H,Bonnett D G,Condon A G,Falk D,Richards R A.2011.TheRht13dwarfing gene reduces peduncle length and plant height to increase grainnumber and yield of wheat.Field Crops Research,124(31):323-331)。我国小麦品种主要含矮秆基因Rht1、Rht2和Rht8，三者分布频率约为23.6～45.0％、18.6～42.6％、41.8～56.6％(张晓科，中国小麦矮秆基因和春化基因分布及小麦品质相关性状多重PCR体系建立，博士后研究工作报告，中国农业科学院，2007；唐娜等，矮秆基因对小麦部分农艺性状的效应，西北植物学报，2010，30(1)：41-49)。矮秆基因在我国小麦品种中的分布特点可能与所用矮源和遗传背景有关。我国小麦中Rht1矮源主要来自农林10和郑引4号；Rht2主要来自农林10号、水源86、辉县红和蚰包麦；Rht8则主要来自阿夫、阿勃、中农28、郑引1号等。小麦矮秆基因的单一性，不仅限制了小麦产量的进一步提升，还使育成品种的遗传基础日益狭窄，遗传多样性降低，不利于小麦的可持续发展。近期研究发现，Rht1和Rht2在降低株高的同时，会缩短胚芽鞘长度和苗期活力，深播时会影响出苗(Ellis M H,Rebetzke G J,Chandler P,Bonnett D,Spielmeyer W,Richards R A.2004.The effect of differentheight reducing genes on the early growth of wheat.Functional Plant Biology,31:583-589)。发掘、应用新的矮秆基因和矮秆种质，对矮化、抗倒伏育种具有重要的意义。
目前，已经报道的小麦矮秆基因有25个，除了Rht1、Rht2、Rht8在生产应用之外，其它矮秆基因尚未成功应用。研究发现，矮秆基因Rht12在降低株高的同时，不影响胚芽鞘长度和苗期活力，且可显著提高穗粒数和收获系数，具有较高的应用价值。然而，矮秆基因Rht12尚未有准确、高效的分子标记，不利于分子标记辅助选择育种。KASP(KompetitiveAllele Specific PCR；竞争性等位基因特异性PCR)，可对广泛存在于基因组DNA中的SNPs或InDels进行精准的判断，是一种高通量、经济、有效的SNP分型技术。开发矮秆基因Rht12的KASP标记，有助于实现Rht12的分子标记辅助育种。
发明内容
本发明要解决的技术问题：小麦生产上应用的矮秆基因单一，目前主要依赖Rht1、Rht2等少数矮秆基因，遗传基础狭窄，遗传多样性低。
为了促进小麦矮化、抗倒伏育种的可持续发展，本发明提供的解决上述技术问题的思路是在生产上需要引入新的矮秆基因，比如Rht12等。具体而言，本发明给出小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，所述矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，与其紧密连锁的KASP标记为5A-6774933，小麦矮秆基因Rht12与5A-6774933的遗传距离为0.4cM。
所述KASP标记5A-6774933对应的引物，包括两条正向特异引物F-矮和F-高以及一条共用反向引物R。
所述正向特异引物F-矮的核苷酸序列为5’GGACACACATGCTTTGACATAATTTGT3’。
所述正向特异引物F-高的核苷酸序列为5’GACACACATGCTTTGACATAATTTGC3’。
所述共用反向引物R的核苷酸序列为5’CAATTATCGCTTCAGGTCTTCTTGAAGA3’。
进一步地，在合成KASP标记5A-6774933对应的引物时，所述正向特异引物F-矮的5’端加上HEX荧光接头序列，HEX荧光接头序列为5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’；所述正向特异引物F-高的5’端加上FAM荧光接头序列，FAM接头序列为：5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3’。
基于所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，本发明还给出了一种筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料的方法，筛选步骤如下：
(1)检测：采用所述KASP标记5A-6774933的引物，对待测小麦材料的基因组DNA进行PCR扩增和基因分型。
(2)结果判断：根据基因分型结果判断待测小麦材料是否含有矮秆基因Rht12，以及矮秆基因Rht12的基因型。由于PCR试剂中含有荧光物质，所以PCR产物也会带不同的荧光。酶标仪读取荧光数据后，再用基因分型软件KlusterCaller把颜色归类。根据颜色归类，基因分型结果中显示为红色或绿色的材料为具有矮秆基因Rht12的小麦材料，其中，结果显示红色的材料为纯合矮秆材料，结果显示绿色的材料为杂合矮秆材料。结果显示蓝色的材料为不含矮秆基因Rht12的高秆材料。结果显示黑色的材料为阴性对照，结果显示紫色的材料为分型失败的材料。
作为所述筛选方法的优选，所述PCR扩增反应体系为5μL，包括2.5μL的2×KASPMaster mix，0.056μL的混合引物，100ng的基因组DNA，超纯水补足至5μL。
作为所述筛选方法的优选，所述混合引物包括两条正向特异引物F-矮和F-高以及一条共用反向引物R，正向特异引物F-矮和F-高的浓度各为12mM(毫摩尔/升)，共用反向引物R的浓度为30mM(毫摩尔/升)。
作为所述筛选方法的优选，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s；61℃退火60s，每循环一次降0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，32个循环。
作为所述筛选方法的优选，所述检测指PCR扩增反应后用酶标仪读取终端荧光读数，然后将数据导入软件进行基因分型。进一步优选地，所用酶标仪的型号为FLUOstarOmega，基因分型的数据处理软件为KlusterCaller软件。
若基因分型的检测结果不明显，可通过至少3个补加循环后再进行基因分型，所述补加循环的程序为：94℃变性20s，57℃退火60s。酶标仪读取荧光数据后，再用基因分型软件KlusterCaller把颜色归类。根据颜色归类，基因分型结果中显示为红色或绿色的材料为具有矮秆基因Rht12的小麦材料，其中红色为纯合矮秆材料，绿色为杂合矮秆材料；基因分型结果中显示为蓝色的材料为不含矮秆基因Rht12的高秆材料，黑色为阴性对照，紫色为分型失败的材料。本发明利用KASP标记5A-6774933对矮化小麦材料Karcagi与高秆亲本宁春45杂交获得的F2分离群体进行分析，利用Joinmap4.0作图软件进行统计分析，确定该标记与矮秆基因Rht12连锁，遗传距离为0.4cM，可作为矮秆基因Rht12的辅助选择标记。
另一方面，本发明还给出了所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记在筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料上的应用。利用该分子标记可以在分子水平上快速筛选小麦后代群体中含有矮秆基因Rht12的个体，准确性高，大大提高了矮化育种效率。
本发明的有益效果或优点主要体现在以下方面。
(1)本发明通过分子标记方法确定小麦矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，并与分子标记5A-6774933紧密连锁，小麦矮秆基因Rht12与5A-6774933的遗传距离为0.4cM。
(2)本发明通过检测与小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记5A-6774933可快速筛选出含有矮秆基因Rht12的材料，在已知的分子标记中，5A-6774933与矮秆基因Rht12连锁最为紧密，遗传距离仅为0.4cM。本发明所述筛选方法不受环境因素影响，可大幅度降低田间选择工作量，提高选择效率，加速育种进程。
(3)通过矮秆基因Rht12的连锁遗传图谱，为后续该基因的进一步精细定位及克隆研究提供了便利。
(4)本发明所述小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，分布广泛，适于快速、规模化操作，基因分型便捷，大大提高了矮化育种效率。
附图说明
图1是小麦矮秆基因Rht12的供体亲本Karcagi、高秆亲本宁春45及其杂交后代F1表型。
图2是供体亲本Karcagi、高秆亲本宁春45杂交后代F2群体株高分布图。
图3是KASP标记5A-6774933在F2群体中的分型图。
图4是小麦矮秆基因Rht12的连锁遗传图。
图5是KASP标记5A-6774933在部分矮秆系后代及96个小麦品种中的分型图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明作进一步详细阐述。
实施例1
Karcagi株高的遗传与后代分离比实验。实验生物材料来源为：矮秆基因Rht12供体亲本小麦品种Karcagi，以及高秆亲本宁春45。
1.1实验材料与方法
2015年10月于陕西杨凌西北农林科技大学旱区节水农业研究院试验农场，播种Karcagi与宁春45的杂交后代F1及亲本；2016年10月播种F2(共301个单株)及亲本，共计20行，行长1.5m，用于矮秆基因Rht12的遗传分析和基因定位。
正常进行田间管理，苗期按单株取幼嫩叶片以提取各F2单株的DNA备用，2017年5月底株高定型时测量F2单株的株高。
1.2实验结果
图1给出了小麦矮秆基因Rht12的供体亲本Karcagi、高秆亲本宁春45及其杂交后代F1表型。从图1看出，高秆亲本宁春45的株高显著高于Kacagi，其平均株高为126cm；而Rht12供体亲本Kacagi株高约为69cm，F1株高为85cm，为矮秆表型。
图2是供体亲本Karcagi、高秆亲本宁春45杂交后代F2群体株高分布图。从图2看出，Karcagi×宁春45的F2群体株高分布图上出现两个峰值，矮秆和高秆株数分别为221和80，经χ2测验(χ2＝0.39；P＝0.53)，符合3︰1分离比例，表明该矮秆性状受一对显性基因控制。由于小麦矮秆基因Rht12降秆效应较强，可作为质量性质分析。
实施例2
矮秆基因Rht12的基因定位与连锁标记分析。利用CTAB法提取Karcagi×宁春45的F2单株及两亲本的DNA，备用。
2.1KASP标记的开发
结合小麦矮秆基因的Rht12的遗传图谱(Rht12与SSR标记Xgwm291相距5.4cM)以及已公布的小麦90K SNP标记信息，挑选Xgwm291附近的SNP，使用在线平台PolyMaker网站(http://poly marker.tgac.ac.uk./)对所有候选SNP进行KASP设计，然后从中挑选出染色体特异的标记。对于设计好的KSAP标记序列，需要在两条正向特异引物的5’端加上FAM或者HEX荧光的接头序列，其中FAM接头序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，HEX接头序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。本实施例所用引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
2.2分子标记的筛选
从上述提取的F2各单株DNA中挑选极高、极矮个体各13个以及两亲本，进行标记筛选。
PCR扩增反应体系(5μL)：选用的PCR试剂组成为2×KASP Master mix体积为2.5μL，引物mix(两条正向引物各12mM，反向引物30mM)体积为0.056μL，基因组DNA为100ng左右，超纯水补足至5μL。
PCR反应程序为Touchdown反应程序：94℃预变性15min，94℃变性20s；61℃退火60s，每循环一次降0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，32个循环。
PCR反应完毕后放在酶标仪FLUOstar Omega中读取终端荧光读数，然后将数据导入KlusterCaller软件进行基因分型。如果分型不明显，一般需要补加3个循环再分型。所述补加循环的程序为：94℃变性20s，57℃退火60s。
如果某标记能将被检测的F2按基因型分为三类，且高秆个体与高秆亲本一类，矮秆个体与矮秆亲本或者F1(杂合类型)一类，则说明该标记可能与矮秆基因Rht12紧密连锁，通过标记筛选，最终获得了可能与Rht12紧密连锁的KASP标记5A-6774933。
2.3紧密连锁分子标记的验证
利用筛选获得的KASP标记5A-6774933对F2分离群体(301个单株)进行检测，获得各单株的基因型，见图3。并结合各单株的株高表型，利用Joinmap4.0作图软件进行连锁遗传分析，获得Rht12的连锁遗传图谱，见图4。最终确定Rht12与KASP标记5A-6774933的遗传距离为0.4cM。
实施例3
分子标记辅助选择及验证。选择22个Rht12的矮秆后代以及西农979、小偃22，丰产3号、郑麦9023、淮麦21、绵阳11、京411、普冰201、晋麦47、周麦16、偃展4110、豫农211等96个普通小麦品种，利用KASP标记5A-6774933对这些材料进行检测。
图5示出了KASP标记5A-6774933在部分矮秆系后代及96个小麦品种中的分型。在矮秆材料中都检测到Rht12的存在(颜色分类为红色或绿色)，而在96个普通小麦品种都没检测到Rht12的存在(颜色分类全部为蓝色)，这与各材料所含矮秆基因的情况一致。本实施例也表明标记5A-6774933具有很好的通用性和准确性。
Claims (10)
1.小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，所述矮秆基因Rht12位于小麦5AL染色体末端，与其紧密连锁的KASP标记为5A-6774933，Rht12与5A-6774933的遗传距离为0.4cM。
2.根据权利要求1所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，其特征在于，所述KASP标记5A-6774933对应的引物，包括两条正向特异引物F-矮和F-高以及一条共用反向引物R；
所述正向特异引物F-矮的核苷酸序列为5’GGACACACATGCTTTGACATAATTTGT 3’；
所述正向特异引物F-高的核苷酸序列为5’GACACACATGCTTTGACATAATTTGC 3’；
所述共用反向引物R的核苷酸序列为5’CAATTATCGCTTCAGGTCTTCTTGAAGA 3’。
3.根据权利要求2所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，其特征在于，在合成KASP标记5A-6774933对应的引物时，所述正向特异引物F-矮的5’端加上HEX荧光接头序列，HEX荧光接头序列为5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’；所述正向特异引物F-高的5’端加上FAM荧光接头序列，FAM接头序列为：5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’。
4.一种筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料的方法，其利用权利要求1至3中任一项所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记，筛选步骤如下：
(1)检测：采用所述KASP标记5A-6774933的引物，对待测小麦材料的基因组DNA进行PCR扩增和基因分型；
(2)结果判断：根据基因分型结果判断待测小麦材料是否含有矮秆基因Rht12。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为5μL，包括2.5μL的2×KASP Master mix，0.056μL的混合引物，100ng的基因组DNA，超纯水补足至5μL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合引物包括两条正向特异引物F-矮和F-高以及一条共用反向引物R，正向特异引物F-矮和F-高的浓度各为12mM，共用反向引物R的浓度为30mM。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min，94℃变性20s；61℃退火60s，每循环一次降0.6℃，10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，32个循环。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测指PCR扩增反应后用酶标仪读取终端荧光读数，然后将数据导入软件进行基因分型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，若基因分型的检测结果不明显，可通过至少3个补加循环后再进行基因分型，所述补加循环的程序为：94℃变性20s，57℃退火60s。
10.权利要求1至3中任一项所述的小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记在筛选具有矮秆基因Rht12的小麦材料上的应用。
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