CN103834647A - 小麦矮杆基因RhtDC20紧密连锁的SSR标记Xgwm537及其用途 - Google Patents

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本发明涉及“小麦矮杆基因RhtDC20紧密连锁的SSR标记Xgwm537及其用途”，属植物分子遗传学领域。本发明对矮杆突变体DC20及杂交分离后代进行分析，确定该突变体的矮杆性状由一对矮杆主效基因控制，通过分子标记方法确定该矮秆基因RhtDC20定位在小麦7BS染色体上，与分子标记Xgwm537连锁，遗传距离为8.0cM，可作为是矮秆基因RhtDC20的辅助选择标记，本发明所涉及的矮秆基因RhtDC20不同于目前定位在小麦7BL染色体上的矮秆基因Rht13，是一个新的小麦矮秆基因；本发明丰富了现有矮秆基因资源，为小麦矮秆育种提供了新矮源，并为这一新矮源提供了辅助选择标记。

Description

小麦矮杆基因RhtDC20紧密连锁的SSR标记Xgwm537及其用途
技术领域：
本发明属于植物分子遗传学领域，特别是涉及小麦矮杆基因RhtDC20紧密连锁的SSR标记Xgwm537及其用途。
背景技术：
小麦（Triticum aestivum L.）作为世界上最重要的粮食和经济作物之一，养活了世界上40%的人口，与玉米、水稻一同提供了超过60%人类所需的营养物质（Gill等.Genetics,2004,168:1087-1096）。矮化育种是获得小麦高产的重要途径，自20世纪60年代“绿色革命”以来，全球小麦产量以每年3.4%的速度递增，同时对小麦矮秆基因的深入研究也产生了很大影响（万平等.麦类作物学报，1998,18(6):9-11）。目前，已经发现并命名了接近30个小麦Rht矮秆基因，其中大部分基因已经进行了定位研究（McIntosh等.Annual Wheat Newsletter,2012,58:259-279;Meng等.Journal of Integrative Agriculture,2013,12:749-755）。Rht-B1b、Rht-B1c和Rht-D1b、Rht-D1c分别定位于4BS和4DS（Boner等,Theoretical and Applied Genetics,1997,95:1133-1137；Ellis等.Theoretical and Applied Genetics,2002,105:1038-1042;Wilhelm等.Theoretical and Applied Genetics,2013,126:1321-1336）。Rht8定位于2DS并与SSR标记Xgwm261紧密连锁（Korzun等.Theoretical and Applied Genetics,1998,96:1104-1109;Korzun等.Plant Breeding,1997,116:227-232）；Rht4、Rht5、Rht9、Rht12和Rht13分别定位于2BL、3BS、5AL、5AL和7BL（Ellis等.Theoretical and Applied Genetics,2005,111:423-430）。这些基因致矮效应和对农艺性状的影响各不相同。半矮秆基因Rht-B1b和Rht-D1b在降低株高提高籽粒数和产量的同时减少α淀粉酶的活性从而影响降落值（Gooding等.Journal of CerealScience,2012,55:305-311;Rebetzke等.Field Crops Research,2012,126:87-96）。Rht5、Rht12、Rht13和Rht4的降矮效应最高可以分别达到55%、45%、34%和17%；Rht8的效应较小，为7%（Rebetzke等.Field Crops Research,2012,126:87-96），其降矮效应还与抗倒性、抽穗期延迟、籽粒数量和干物质增加等其他农艺性状紧密相关（Rebetzke等.Field Crops Research,2011,124:323-331;Rebetzke等.Field Crops Research,2012,126:87-96;Daoura等.Field CropsResearch,2014156:22-29）。
目前，世界范围内约70%的小麦品种其半矮秆性状由Rht-B1、Rht-D1和Rht8基因调控（Guedira等.Crop Science,2010,50:1811-1822）。我国小麦品种中矮秆基因的分布在不同麦区存在一定的差异，平均约42.3%的品种矮秆基因为Rht8，24.3%为Rht-B1，46.9%为Rht-D1（周阳等.作物学报，2003，29：810-814）。其中北部冬麦区和黄淮麦区这2大小麦主产区中69%的品种携带Rht-D1。分子检测结果和系谱分析表明，我国小麦品种(系)携带的Rht-B1b矮秆基因来自St2422/464和农林10，Rht-D1b矮秆基因来自农林10号、水源86、辉县红和蚰包麦（杨松杰等.中国农业科学，2006，39：1680-1688）。
上述分析表明，目前的矮秆育种过渡依赖这几个基因，遗传基础狭窄，遗传变异贫乏，极易造成“遗传脆性”及对不良环境的抵御能力下降等现象，因此急需发掘一批新的矮秆基因。
发明内容
本发明提供一个新的小麦矮秆基因RhtDC20和用于辅助选择该基因的分子标记Xgwm537。本发明提供并请求保护的技术方案如下：
小麦矮杆基因RhtDC20紧密连锁的SSR标记Xgwm537，其上游引物的核苷酸序列为：5’ACA TAA TGC TTC CTG TGC ACC3’；下游引物的核苷酸序列为：5’GCC ACT TTTGTG TCG TTC CT3’，扩增的特征条带的长度为207bp。
一种筛选具有矮杆基因RhtDC20的小麦材料的方法，其步骤如下：
（1）检测：采用所述SSR标记Xgwm537的上、下游引物对待测小麦材料的基因组进行PCR扩增和检测，
（2）结果判断：扩增结果中出现长度为207bp，所示的特征条带的材料为具有矮杆基因RhtDC20的小麦材料，
所述SSR标记Xgwm537的上游引物的核苷酸序列为：5’ACA TAA TGC TTC CTG TGCACC3’；下游引物的核苷酸序列为：5’GCC ACT TTT GTG TCG TTC CT3’。
所述PCR扩增的反应体系为15μL，包括1×PCR Buffer（含Mg2+），0.25mM dNTPs，250nM引物，1U Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，超纯水补足至15μL。
所述扩增的程序为：95℃预变性4min，94℃变性1min；60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
所述检测指扩增产物变性后用6.0%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，80W恒功率电泳80min，快速硝酸银染色观察。本发明所述矮秆突变体DC20具有茎杆短租、密穗、综合农艺性状优良等优点，其所携带矮秆基因RhtDC20的降矮效应为16.63%，与目前广泛利用的“绿色革命”矮秆基因Rht-B1b和Rht-D1b的降矮效应类似。本发明对矮杆突变体DC20及杂交分离后代进行分析，发现该突变体体的矮杆性状由一对矮杆主效基因控制，通过分子标记方法确定该矮秆基因RhtDC20定位在小麦7BS染色体上，与分子标记Xgwm537连锁，遗传距离为8.0cM，可作为是矮秆基因RhtDC20的辅助选择标记，本发明所涉及的矮秆基因RhtDC20不同于目前定位在小麦7BL染色体上的矮秆基因Rht13，是一个新的小麦矮秆基因。该基因可用于筛选小麦矮杆材料。
该基因的发现与定位丰富了现有的矮秆基因资源，并将在小麦矮化育种过程中起到重要作用。本发明所述矮秆基因连锁分子标记可实现苗期快速、高通量辅助选择，大幅度缩小田间选择工作量；同时该方法不受环境因素影响，早代鉴定准确度高，可以大幅度提高选择效率，加速育种进程。
本发明所述辅助选择标记类型为SSR标记，该种标记应用范围广，操作简单，成本低廉，易于推广。
附图说明
图1外源赤霉素处理对幼苗的影响，
图2F2群体株高分布图，
图3矮秆基因在7BS染色体上的遗传定位，
图4标记Xgwm537在F2部分群体中进行辅助选择的带型，
其中D、H、h分别代表纯合矮秆、纯合高秆、杂合高秆。
具体实施方式
生物材料来源：
小麦野生型D6-3：已知稳定品系，已经记载在文献“小麦矮秆突变体DC20赤霉素合成及信号转导途径关键基因表达分析”（核农学报，2014，28：208-216）中。
小麦矮秆突变体DC20：已知稳定品系，已经记载在文献“小麦矮秆突变体DC20赤霉素合成及信号转导途径关键基因表达分析”（核农学报，2014，28：208-216）中。
中优9507：中国农业科学院作物所1995年育成，已经通过品种审定的已知品种。
中旱110：中国农业科学院作物所2002年育成，已经通过品种审定的已知品种。
实施例1.DC20幼苗对外源赤霉酸（GA3）反应
1.实验材料与方法
矮秆突变体DC20和其野生型D6-3的种子分别均匀摆放在直径9cm的培养皿中，在21℃条件下用自来水萌动18h至露白，后移入4℃冰箱处理2d，确保发芽整齐一致。然后将培养皿移回温度21℃的恒温箱中GA3进行，GA3浓度分别为0、5、10和15mg/L，实验设3次重复。处理过程中每天光照16h/黑暗8h。10d后，测量苗高，用SAS软件分析差异显著性。
2.实验结果
施加不同浓度外源赤霉酸后，突变体和野生型幼苗叶片逐渐由深绿色转为黄色，叶片转为披垂，极显著促进了苗高和胚芽鞘的生长，但二者增长幅度不同。随GA3浓度的增加，对突变体DC20苗高生长的促进作用逐渐减小，但都达到了极显著水平。野生型D6-3苗高的生长对赤霉酸浓度变化不敏感，3个不同处理浓度间苗高都没有达到显著差异水平。在GA3浓度为5mg/L和10mg/L时，突变体DC20苗高的相对增长率显著高于D6-3（图1）。表明DC20为赤霉酸敏感型，且相对于野生型D6-3对外源赤霉酸更加敏感。
实施例2.DC20株高的遗传与后代群体分离比.
1.实验材料与方法
2010年10月播种中优9507×DC20的F2群体及其亲本和F1，共230个株系，用于矮秆基因遗传分析和基因定位。
材料均种植于中国农业科学院作物科学研究所中圃场试验基地，行长2m，行距30cm，株距10cm，正常田间管理。苗期取叶片以提取DNA备用，单株收获后测量株高。
2.实验结果
高株亲本中优9507的株高都显著高于DC20。其平均株高为94.7cm，而突变体DC20的株高仅为61.8cm。F1代株高为80.9cm，接近中亲值，为高秆表型（图2）。
中优9507×DC20的F2群体株高分布图上出现两个峰值，高秆和矮秆株数分别为170和60（图2），经χ2测验(χ2=0.146<χ20.05)，符合3∶1分离比例，表明DC20应携带有1对主效隐性矮秆基因，命名为RhtDC20。
实施例3.DC20矮秆基因定位与连锁标记分析
采用CTAB法（Murray等.Nuclear Acids Research,1980,8:4321-4325）提取小麦叶片基因组DNA。利用分离池法（Bulked Segregant Analysis,BSA）（Michelmore等.Proceeding of theNational Acadmey of Science,1991,88:9828–9832）鉴定与矮秆基因连锁的标记。从F2分离群体中分别选取10株极端高株和极端矮株，将其DNA等量混合，构建高、矮池。
选用分布于小麦21条染色体的SSR标记在中优9507和DC20间及其高、矮池间进行扩增，选取具有多态性的标记在中优9507×DC20的F2群体中扩增。
实验筛选出分布于小麦21条染色体上且在亲本中优9507和DC20间具有多态性的引物375对，并用这些标记在高矮池间进行扩增，进一步将多态性标记在F2分离群体中进行扩增，其基因型数据用于构建遗传图谱。
其中矮秆基因RhtDC20作为1个标记用于遗传连锁分析。结果显示，RhtDC20基因位于7B染色体上。
进一步以7B染色体上的所有多态性SSR标记在亲本中优9507、DC20和F2分离群体间进行分析，共获得113个多态性标记。用MAPMAKER3.0软件（Lincoln等.Mapping genescontrolling quantitative traits with MAPMAKER/QTL1.1:a tutorial and reference manual,2nd edn.1993）分析标记与矮秆基因间的遗传图距。利用Kosambi作图函数（Kosambi等.Annals ofEugenis,1943,12:172-175），将重组率转化成遗传距离（cM），LOD阈值为3.0，用Map Draw软件在Excel中绘制遗传连锁图谱（刘仁虎等.遗传，2003，25：317-321）。
用QTL Cartographer分析遗传效应
（http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm）。根据区间作图法对RhtDC20基因的遗传效应分析显示，在标记Xgwm537侧翼存在1个主效QTL，并可以解释16.63%的表型变异（表1）。
表1.矮秆基因RhtDC20的遗传效应
Figure BDA0000478026550000051
遗传连锁分析显示矮秆基因位于标记Xgwm537和Xgwm46之间，图距分别为8.0和21.6cM（图3）。
上述扩增采用的PCR扩增体系15μL，包括1×PCR Buffer（含Mg2+），0.25mM dNTPs，250nM引物，1U Taq酶，100ng模板DNA。在BIO-RAD C1000TM基因扩增仪上进行扩增，程序为95℃预变性4min，94℃变性1min；55～60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物用6.0%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，经快速硝酸银染色后统计带型。
实施例4.DC20矮秆基因分子标记辅助选择
用上述DNA提取、PCR扩增和电泳方法在中旱110×DC20的F2群体中进行检测，在矮秆单株中都扩增出同亲本DC20同样的带型，而在高秆单株中则没有该带型（图4）。

Claims (5)

1.小麦矮杆基因RhtDC20紧密连锁的SSR标记Xgwm537，其上游引物的核苷酸序列为：5’ACATAA TGC TTC CTG TGC ACC3’；下游引物的核苷酸序列为：5’GCC ACT TTT GTG TCGTTC CT3’，扩增的特征条带的长度为207bp。
2.一种筛选具有矮杆基因RhtDC20的小麦材料的方法，其步骤如下：
（1）检测：采用所述SSR标记Xgwm537的上、下游引物对待测小麦材料的基因组进行PCR扩增和检测，
（2）结果判断：扩增结果中出现长度为207bp所示的特征条带的材料为具有矮杆基因RhtDC20的小麦材料，
所述SSR标记Xgwm537的上游引物的核苷酸序列为：5’ACA TAA TGC TTC CTG TGCACC3’；下游引物的核苷酸序列为：5’GCC ACT TTT GTG TCG TTC CT3’。
3.根据权利要求2所述的方法，所述PCR扩增的反应体系为15μL，包括1×PCR Buffer（含Mg2+），0.25mM dNTPs，250nM引物，1U Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，超纯水补足至15μL。
4.根据权利要求2或3所述的方法，所述扩增的程序为：95℃预变性4min，94℃变性1min；60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
5.根据权利要求2～4任一所述的方法，所述检测指扩增产物变性后用6.0%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，80W恒功率电泳80min，快速硝酸银染色观察。
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