CN110241248B

CN110241248B - 与盐胁迫条件下小麦粒重相关的kasp标记及其应用

Info

Publication number: CN110241248B
Application number: CN201910643027.5A
Authority: CN
Inventors: 郑琪; 罗巧玲; 胡盼; 杨国堂; 李滨; 李宏伟; 李振声
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110241248A

Abstract

本发明公开了一种与盐胁迫条件下小麦粒重相关的KASP标记及其应用。本发明提供了检测SNP标记AX‑109277923的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦粒重中的应用；所述SNP标记AX‑109277923为位于小麦2D染色体上的第569361770位核苷酸，其为C或G。本发明基于QTL定位获得与盐胁迫条件下小麦粒重相关的SNP标记AX‑109277923。进一步开发出与SNP标记AX‑109277923相关联的KASP标记，为选育高产稳产品质优良的耐盐小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

Description

与盐胁迫条件下小麦粒重相关的KASP标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及与盐胁迫条件下小麦粒重相关的KASP标记及其应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，也是中国北方人民最重要的主食。有研究指出，预计到2050年世界人口将超过90亿，小麦总产量需要增加70％才能满足未来的需求，科学家、育种家和农民都面临着巨大的挑战。中国盐渍化土壤分布广泛，面积达14.87亿亩，约合1亿公顷。培育耐盐小麦新品种，有效利用盐碱地等中低产田，是提高粮食总产量的有效途径。小麦产量由亩穗数、穗粒数和千粒重三个因素决定。千粒重较另外两个产量要素受环境影响较小，并主要受加性效应基因控制，遗传力高达59％-80％。研究表明，千粒重是现代育种中遗传改进最为显著的产量性状。因此，定位和克隆盐胁迫条件下与小麦千粒重稳定相关的基因或QTL对小麦总产量的提高具有重要意义。综合以前连锁分析和关联分析的结果发现，小麦21条染色体上均检测到千粒重相关的QTL，且主效位点定位在2A、2D、4A、5A、6A和7D染色体上。然而，在盐胁迫条件下与小麦千粒重稳定相关的QTL却鲜有报道。

分子标记辅助选择育种技术可以通过选择与目标性状紧密连锁的分子标记，达到选择目标性状的目的。它简单快速且不受环境影响，对小麦千粒重等性状的选择可以在植株生长早期甚至种子状态时实现，节省了大量人力物力。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可以稳定遗传，并且分布广泛，多态性丰富，易于实现自动化分析。目前SNP检测的方法主要有两种：简化基因组测序和SNP芯片。但是当通过连锁分析或关联分析获得与目标性状连锁的SNP标记后，检测其他材料是否含有该优良位点时，简化基因组测序或高密度SNP芯片技术成本显然太高，且没有必要。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)技术可以基于引物末端碱基的特异匹配实现SNP分型及插入、缺失的检测(Insertions and Deletions，InDels)。与Taqman探针相比，KASP方法可以通过通用荧光探针来替代针对位点的荧光探针，大大节约成本。

因此，筛选出与盐胁迫环境下千粒重相关的标记，并利用该标记筛选粒重性状优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的耐盐小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何开发与小麦粒重相关的KASP标记，尤其是盐胁迫条件下小麦粒重相关的KASP标记，以选育出高产的耐盐小麦品种。

为解决上述问题，本发明提供了检测SNP标记AX-109277923的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦粒重中的应用；

所述SNP标记AX-109277923为位于小麦2D染色体上的第569361770位核苷酸，其为C或G。

上述应用中，所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重中的应用为鉴定或辅助鉴定盐胁迫条件下小麦粒重中的应用。

上述检测SNP标记AX-109277923的多态性或基因型的物质在小麦育种尤其是耐盐小麦育种中的应用也在本发明的保护范围之内。

上述应用中，所述小麦育种为培育高粒重的耐盐小麦品种。

上述应用中，所述SNP标记AX-109277923对应序列表中序列1的第145位核苷酸。

上述应用中，所述检测SNP标记AX-109277923的多态性或基因型具体可为检测小麦基因组中SNP标记AX-109277923的核苷酸种类。SNP标记AX-109277923的基因型是CC、GG或CG。所述CC基因型是小麦基因组中所述SNP标记AX-109277923为C的纯合型，GG基因型是小麦基因组中所述AX-109277923为G的纯合型，CG基因型是小麦基因组中所述SNP标记AX-109277923为C和G的杂合型。

上述应用中，所述检测SNP标记AX-109277923的多态性或基因型的物质如下1)或2)或3)：

1)成套引物，所述成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；

2)含有所述成套引物的PCR试剂；

3)含有1)或2)的试剂盒。

上述成套引物中，

所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为序列2所示的单链DNA分子的5′端连接一种荧光标签得到的；

其中，所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物中所述荧光标签可为FAM或HEX；

在本发明具体实施方式中，所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物具体为FAM-KASP-F1，其核苷酸序列是5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTGCAAGTAGTCCCTTTTTGTTACAG-3′(带下划线的序列为荧光标签FAM)。

所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物为序列3所示的单链DNA分子的5′端连接另一种荧光标签得到的。

所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物中所述荧光标签可为HEX或FAM。

在本发明具体实施方式中，所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物具体为HEX-KASP-F2，其核苷酸序列是5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTGCAAGTAGTCCCTTTTTGTTACAC-3′(带下划线的序列为荧光标签HEX)

本发明还提供了一种产品。

上述产品为上述检测SNP标记AX-109277923的多态性或基因型的物质；

其具有如下1)或2)或3)或4)或5)或6)至少一种功能：

1)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重；

2)鉴定或辅助鉴定盐胁迫条件下小麦的粒重；

3)高粒重小麦的育种；

4)高粒重耐盐小麦的育种；

5)选育高粒重的小麦；

6)选育高粒重的耐盐小麦。

本发明还进一步提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦粒重的方法。

一种鉴定或辅助鉴定盐胁迫条件下小麦粒重的方法为检测待测小麦的SNP标记AX-109277923的基因型，根据基因型确定所述待测小麦的粒重；

SNP标记AX-109277923的基因型为CC的待测小麦的粒重高于SNP标记AX-109277923的基因型为GG的待测小麦；

其中，所述CC基因型是小麦基因组中所述SNP标记AX-109277923为C的纯合型，GG基因型是小麦基因组中所述AX-109277923为G的纯合型。

一种耐盐小麦的育种方法，包括：检测待测小麦基因组中SNP标记AX-109277923的基因型，选择待测小麦基因组中SNP标记AX-109277923的基因型为CC的小麦进行育种。

上述方法中，检测待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为GG还是CC的方法为如下A)或B)：

A)通过SNP芯片检测小麦SNP标记AX-109277923的基因型；

B)用上述检测SNP标记AX-109277923的基因型的物质对所述待测小麦基因组DNA进行PCR反应，对产物进行基因分型。

上述方法中，所述基因分型的方法如下：将所述产物进行荧光信号扫描，若所述产物仅显示序列2所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色，则所述待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为CC；若所述产物仅显示序列3所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色，则所述待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为GG；若所述产物显示序列2所示DNA分子和序列3所示DNA分子5′端连接荧光标签的叠加颜色，则所述待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为CG。

本发明中所述粒重可以为千粒重也可以为百粒重。在本发明具体实施方式中，统计的是千粒重。

本发明中所述盐胁迫条件为土壤中盐的质量百分含量为0.18％-0.3％。

本发明基于QTL定位获得与盐胁迫条件下小麦粒重相关的SNP标记AX-109277923。进一步开发出与SNP标记AX-109277923相关联的KASP标记，并证明该KASP标记在121份小麦品种(系)组成的自然群体中也与盐胁迫条件下千粒重性状显著相关，说明本发明中开发的KASP标记可以对小麦千粒重实现辅助选择作用，为选育高产稳产品质优良的耐盐小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

附图说明

图1为本发明实施例1中获得总长度为300bp的DNA序列；其中，下划线部分为SNP标记AX-109277923的序列。

图2为本发明实施例1中KASP标记分型结果。

图3为6个环境下不同基因型小麦品种(系)的千粒重情况；**表示T检验达到极显著水平即P＜0.01；15LS、16LS、17LS分别代表2014-2015、2015-2016和2016-2017三个年度的大田低盐条件；15HS、16HS、17HS分别代表2014-2015、2015-2016和2016-2017三个年度的盐池高盐条件。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中麦175记载在如下文献：王德森，等小麦新品种中麦175的选育.作物杂志，2007.3；由中国农业科学院作物科学研究所育成。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例小偃60记载在如下文献：Qiaoling Luo，et al.Transcriptomeanalysis of salt-stress response in three seedling tissues of commonwheat.The Crop Journal，2019.1；由中国科学院遗传与发育生物学研究所郑琪副研究员保存。公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例1盐胁迫条件下小麦粒重相关SNP标记的发现与KASP标记开发及检测方法的建立

一、盐胁迫条件下千粒重表型的鉴定

以小麦品种中麦175为母本，小偃60为父本杂交获得F₁，F₁自交产生F₂，采用单粒传法获得含有350个株系的F₇代重组自交系(RIL)群体。在2016-2017和2017-2018两个年度共4个环境下鉴定RIL群体246个株系的千粒重性状。大田试验在中国科学院南皮生态农业试验站(116°40′E，38°00′N，海拔11m)进行，设置大田低盐条件(含盐量0.18％m/m)和盐池高盐条件(含盐量0.3％m/m)两个盐度梯度。实验采用随机区组设计，行距20cm，株距10cm。低盐条件设置3个重复，每个重复中每个株系种植1行共15株。由于盐池面积的限制，高盐条件设置10个重复，每个重复中每份材料只有1株。保证出苗后，生育期无灌溉，田问常规管理，生长期间无严重病虫害和倒伏。低盐条件下每个重复收获行中间长势一致的5个单株，高盐条件下的10个重复全部收获。单株脱粒后，称量每个单株的总粒重，并计数总粒数，千粒重＝总粒重/总粒数*1000。

二、基因型扫描与遗传连锁图谱构建

利用小麦55K SNP芯片获得两个亲本和350个株系的基因型，并利用QTL分析软件IciMapping 4.1构建RIL群体的遗传连锁图谱。

(一)获得两个亲本和350个株系的基因型

采用稍改良的SLS法提取350个RIL株系和2个亲本的DNA。具体步骤如下：

(1)取0.2g新鲜小麦叶片至2mL离心管中(管内提前放入4mm钢珠2颗)，液氮预冷，在组织研磨仪(TissueLyser II，QIAGEN，德国)中研磨至粉末状，加入0.8mL 1％SLS(十二烷基肌氨酸钠)裂解液，剧烈振荡使样品充分混匀，室温静置10min，使细胞充分裂解。

(2)向离心管中加入与裂解液等体积的提取液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24∶1)，缓慢摇匀至乳浊液，室温静置10min，12000rpm离心10min后，将上清液转移至新的离心管。再重复此操作1次。

(3)吸取上清液至另一个新的1.5mL离心管，加入上清液0.6倍体积的预冷异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀30min，如果沉淀很多，则可瞬时离心，去上清后洗涤。

(4)4℃，10000rpm离心10min后，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min后，弃上清，再重复洗涤一次。最后用无水乙醇洗涤，离心后弃上清，倒置，室温干燥DNA；

(5)向干燥的DNA中加入100μL 1×TE缓冲液(含RNase A)，溶解DNA。

利用琼脂糖凝胶检测DNA样品的完整性，利用NanoDrop检测DNA浓度与质量(A_260/280和A_260/230)。检测合格(DNA总量大于1μg，DNA完整，无RNA污染，A_260/280和A_260/230符合要求)后，根据美国昂飞公司操作手册AXIOM Array 2.0的要求，将样品DNA与小麦55K SNP芯片杂交，得到的原始数据经SNP标记质控后，获得两个亲本与350个株系的基因型。

(二)利用QTL分析软件IciMapping 4.1构建RIL群体的遗传连锁图谱

根据芯片获得的基因型信息筛选亲本间表现出多态性的标记，并去除最小等位基因频率小于0.4、缺失率大于1％、杂合度高于10％的标记和杂合度高于3％的株系。剩余的所有标记使用QTL分析软件IciMapping 4.1的BIN功能聚类(Winfield，M.O.，Allen，A.M.，Burridge，A.J.，Barker，G.L.，Benbow，H.R.，Wilkinson，P.A.，Coghill，J.，Waterfall，C.，Davassi，A.，Scopes，G，High-density SNP genotyping array for hexaploid wheat andits secondary and tertiary gene pool，Plant Biotechnology Journal，2016，14(5)：1195-1206.)，具有相同分离类型的标记只保留一个标记代表该BIN标记。利用卡方检验标记分离的显著性。利用IciMapping 4.1中MAP的功能，先将BIN标记分成不同的连锁群(LOD值设置为3.0)，再利用nnTwoOpt算法进行排序，以SARF为标准对标记排序进行调整，根据标记的物理位置矫正染色体的长短臂，最后输出遗传连锁图谱。

三、盐胁迫条件下千粒重性状的连锁分析

将步骤二中构建的遗传连锁图谱与步骤一中4个环境下的千粒重表型数据相结合，制作输入文件，利用QTL分析软件IciMapping 4.1中的双亲群体QTL定位功能(QTLmapping in biparental populations，BIP)，以基于逐步回归的完备区间作图法(inclusive composite interval mapping，ICIM)进行加性效应QTL定位，参数设置均选择默认值(步长设置为1.0，PIN为0.001，LOD值设定为2.5，方法选用ICIM-ADD)。

在2D染色体长臂129cM位置处检测到一个盐胁迫条件下与粒重相关的稳定主效QTL(QTkw-2D)，可以增加小麦千粒重1.25-1.44g。4个环境下检测该位点的LOD值分别为9.93、4.70、9.00和7.84，它对表型变异的贡献率分别为12.00％、6.04％、7.88％和6.99％。QTkw-2D的置信区间为126.5-129.5cM，两侧的标记分别为AX-110535834(126.79cM)和AX-109277923(129.83cM)，由此可知SNP标记AX-109277923(序列为5′-ACTCTAGGAAAAAATACAAAATTAAAGATGAATGA[C/G]TGTAACAAAAAGGGACTACTTGCACAATTTTGGTA-3′，如图1所示)为QTkw-2D最紧密连锁的标记，故将其开发为KASP标记，方便应用于其它材料。

四、KASP标记开发及验证

(一)KASP标记的开发

为保证SNP标记AX-109277923在基因组上的特异性，将其DNA序列与公布的小麦基因组参考序列(iwgsc_refseqv1.0)进行比对，得到总长度为300bp的DNA序列(如图1所示)，该序列对应于小麦中国春基因组2D染色体上569361626-569361925位核苷酸。SNP标记AX-109277923是小麦基因组的一个SNP位点，SNP标记AX-109277923位于小麦2D染色体上的第569361770位(对应于序列1的第145位)，该核苷酸为C或G(即序列1中s代表C或G)。

SNP标记AX-109277923的基因型是CC、GG或CG。所述CC基因型是小麦基因组中所述SNP标记AX-109277923为C的纯合型，GG基因型是小麦基因组中所述AX-109277923为G的纯合型，CG基因型是小麦基因组中所述SNP标记AX-109277923为C和G的杂合型。

(二)特异引物设计及方法的建立

针对目标SNP标记AX-109277923的两个等位基因，设计成套KASP引物，包含2个上游引物和1个通用下游引物，所述上游引物为5′末端添加荧光标签FAM的DNA分子、5′末端添加荧光标签HEX的DNA分子，通用下游引物为序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；

5′末端添加荧光标签FAM的DNA分子为序列2所示的单链DNA分子的5′末端添加荧光标签FAM得到的，即FAM-KASP-F1；

5′末端添加荧光标签HEX的DNA分子为序列3所示的单链DNA分子的5′末端添加荧光标签HEX得到的，即HEX-KASP-F2；

SNP标记AX-109277923的引物序列为：

KASP-F1：5′-TGTGCAAGTAGTCCCTTTTTGTTACAG-3′(序列2)；

KASP-F2：5′-TGTGCAAGTAGTCCCTTTTTGTTACAC-3′(序列3)；

KASP-R：5′-CCTAACATGCTGAAAATAGTAGAAAATTCA-3′(序列4)；

荧光标签FAM为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′；

荧光标签HEX为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′；

FAM-KASP-F1：′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTGCAAGTAGTCCCTTTTTGTTACAG-3′(带下划线的序列为荧光标签FAM)；

HEX-KASP-F2：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTGCAAGTAGTCCCTTTTTGTTACAC-3′(带下划线的序列为荧光标签HEX)。

上述序列2所示的单链DNA分子的5′端添加荧光标签FAM得到的单链DNA分子(FAM-KASP-F1)与序列4所示的单链DNA分子(KASP-R)扩增SNP标记AX-109277923基因型为CC(即SNP标记AX-109277923为C的纯合型)的片段，PCR扩增后携带FAM序列的产物经荧光照射显示蓝色；

上述序列3所示的单链DNA分子的5′末端添加荧光标签HEX得到的单链DNA分子(HEX-KASP-F2)与序列4所示的单链DNA分子(KASP-R)扩增SNP标记AX-109277923的基因型为GG(即SNP标记AX-109277923为G的纯合型)的片段，PCR扩增后携带HEX序列的产物经荧光照射显示红色。

(三)SNP分型

利用微流控芯片检测系统(为北京博奥晶典生物技术有限公司产品)进行SNP分型。具体步骤如下：

(1)按照前述的SLS方法提取24个RIL株系的DNA；

(2)配置PCR扩增反应体系，用移液器将配置的反应体系从芯片入口注入到微流控芯片里，并密封进出口。

PCR反应体系如下表1所示：

表1 PCR反应体系

其中，引物Mix由FAM-KASP-F1、HEX-KASP-F2和KASP-R组成，FAM-KASP-F1和HEX-KASP-F2的终浓度均为0.6uM，KASP-R的终浓度为1.5uM。

将芯片放入到离心机中4000rpm，离心1min。放入芯片热封仪中进行热封1Sec。放入平板PCR仪上进行扩增反应，PCR扩增程序如表2所示：

表2 PCR扩增程序

(3)反应产物经LuxScan-10K/D扫描仪扫描，生成tif文件，通过软件转换成数据信号值，再通过分型软件SNPTyper进行分型。显示蓝色荧光的基因型为CC，显示红色荧光的基因型为GG。结果如图2所示，图中左上方为SNP标记AX-109277923基因型为GG的株系，右下方为SNP标记AX-109277923基因型为CC的株系；表明该标记可以区分SNP标记AX-109277923不同的基因型。经检测，KASP标记分型结果(表3)与小麦55K SNP芯片获得的基因型结果一致，证明开发的KASP标记可以实现SNP标记AX-109277923的成功分型。

表3 KASP标记在24个重细自交系中扩增的荧光信号值与分型结果

实施例2自然群体中的验证

收集St2422/464衍生品种(系)、小偃衍生品种(系)和环渤海地区的推广品种共121份(详见表4)构成一个自然群体。2014-2015、2015-2016和2016-2017连续3个年度在中国科学院南皮生态农业试验站种植并鉴定其千粒重性状。实验采用随机区组设计，行距23cm，穴距15cm，每穴播种3粒种子。大田低盐条件(含盐量0.18％m/m)和盐池高盐条件(含盐量0.3％m/m)两个盐度梯度下分别设置5个重复，每个重复中每个材料播种1穴。保证出苗后，生育期无灌溉，田间常规管理，生长期间无严重病虫害和倒伏。按穴全部收获5个重复。脱粒后，称量每穴的总粒重，并计数总粒数，千粒重＝总粒重/总粒数*1000。

按照实施例1中步骤二SLS方法提取121个品种的DNA，利用实施例1中步骤四对121个DNA样品进行SNP分型。

KASP标记分型与盐胁迫条件下的千粒重表型结果如表4、5和图3所示：71个品种(系)(58.7％)的基因型为CC，与小偃60相同；50个品种(系)(41.3％)基因型为GG，与中麦175相同。根据分型结果结合其千粒重表型数据分析发现，SNP标记AX-109277923基因型为CC的小麦品种(系)的千粒重在6个环境下均高于基因型为GG的品种(系)，并且在5个环境下达到极显著水平。

表4 121个品种(系)的基因型与6个环境下的千粒重情况

注：15LS、16LS、17LS分别代表2014-2015、2015-2016和2016-2017三个年度的大田低盐条件；15HS、16HS、17HS分别代表2014-2015、2015-2016和2016-2017三个年度的盐池高盐条件，NA代表缺失。

文献1为：陈桂玲等，2012，小偃6号及其衍生后代品质相关性状基因的分子检测；

文献2为：孙果忠等，2013，小麦品种耐寒性与春化VRN-1等位基因的关系研究；

文献3为：梁超等，2006，‘德抗961’小麦耐盐生理特性研究；

文献4为：易腾飞等，2018，261份小麦品种基于农艺性状的遗传多样性分析；

文献5为：肖宇等，2017，河北省10个小麦主栽品种耐盐性鉴定；

文献6为：孙果忠等，2010，我国小麦主推品种穗发芽抗性鉴定及相关分子标记的评价；

文献7为：彭芹等，2012，1950年以来山东省主推小麦品种的遗传多样性演变；

文献8为：王步云等，2014，河南省小麦品种(系)遗传多样性和抗条锈性分析；

文献9为：杜佳林等，2016，2014-2015年天津市小麦新品种比较试验；

文献10为：张德强等，2016，小麦周8425B及其衍生品种与黄淮麦区主栽品种的遗传解析；

文献11为：徐晓丹等，2011，河南小麦主栽品种亲缘系数分析；

文献12为：康苏花等，2010，小麦矮杆基因的研究进展；

文献13为：安成立等，2005，强筋小麦陕优225系谱及性状遗传分析；

文献14为：许云峰等，2008，EMS诱导小麦品种烟农15突变体的鉴定和EST-SSR分析；

文献15为：党红凯等，2012，超高产栽培条件下冬小麦对磷的吸收、积累和分配；

文献16为：方正和翟冬风，2014，小麦育种工作60年回顾；

文献17为：关二旗等，2012，黄淮冬麦区部分区域小麦品种构成及品质性状分析；

文献18为：李焕章等，1964，冬小麦农大183分蘖、叶片发生规律与穗部关系的初步研究；

文献19为：李琼等，2008，小偃6号及其衍生品种(系)遗传多样性的SSR分析；

文献20为：刘旭等，2001，小麦耐盐种质的筛选鉴定和耐盐基因的标记；

文献21为：马瑞昆等，2007，石新733小麦的水分生理特点及节水灌溉效应；

文献22为：孙欣欣等，2016，北方冬麦区新育成优质小麦品种面条品质相关性状分析；

文献23为：唐玉婧等，2014，干旱胁迫下小麦抗旱能力与其根系特征间的关系；

文献24为：徐鑫等，2010，小麦骨干亲本“洛夫林10号”1BL/1RS在衍生品种中的遗传分析；

文献25为：张怀刚和杨生荣，2005，高原号春小麦品种的培育与推广；

文献26为：张林等，2017，山东省12个主栽小麦品种(系)抗叶锈性分析；

文献27为：张善勇等，2012，小麦品种烟农23号的选育与育种思路、策略分析。

表5 6个环境下不同基因型小麦千粒重的统计分析结果

注：15LS、16LS、17LS分别代表2014-2015、2015-2016和2016-2017三个年度的大田低盐条件；15HS、16HS、17HS分别代表2014-2015、2015-2016和2016-2017三个年度的盐池高盐条件。

综合以上结果，本发明KASP标记在121份小麦品种(系)组成的自然群体中也与盐胁迫条件下的千粒重性状显著相关。这表明从RIL群体中鉴定得到的与盐胁迫条件下千粒重相关的SNP标记AX-109277923在收集的121份小麦品种(系)构成的自然群体中同样适用，实验结果与预期一致。说明本发明中开发成功的KASP标记可以对盐胁迫条件下的千粒重实现辅助选择作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 与盐胁迫条件下小麦粒重相关的KASP标记及其应用

<130> GNCFY191302

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 1

ccaaacattt tttaaatagt tttgatgatt cttttgctgt tcataaactg tgcaactttt 60

ttagtcacat gagaatgaaa gtgttttatc ttctgtgtat tttatttttt accaaaattg 120

tgcaagtagt ccctttttgt tacastcatt catctttaat tttgtatttt ttcctagagt 180

agtgaccatc tgctaaatga ctaactgaat gctgaatttt ctactatttt cagcatgtta 240

ggttagttgg tttgcacatt cttctatagt gcattttttt atccatcttt gatgagtgtt 300

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgcaagta gtcccttttt gttacag 27

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgcaagta gtcccttttt gttacac 27

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctaacatgc tgaaaatagt agaaaattca 30

Claims

1.一种鉴定或辅助盐胁迫条件下鉴定小麦的粒重的方法，其特征在于：所述方法为检测待测小麦的SNP标记AX-109277923的基因型，根据基因型确定所述待测小麦的粒重；

2.一种耐盐小麦的育种方法，包括：检测待测小麦基因组中权利要求1中所述SNP标记AX-109277923的基因型，选择待测小麦基因组中权利要求1中所述SNP标记AX-109277923的基因型为CC的小麦进行育种；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

检测待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为GG还是CC的方法为如下A）或B）：

A）通过SNP芯片检测小麦SNP标记AX-109277923的基因型；

B）用检测SNP标记AX-109277923的基因型的物质对所述待测小麦基因组DNA进行PCR反应，对产物进行基因分型；

所述检测SNP标记AX-109277923的多态性或基因型的物质如下1）或2）或3）：

1）成套引物，所述成套引物由序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；

所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物为序列3所示的单链DNA分子的5′端连接另一种荧光标签得到的；

2）含有1）所述成套引物的PCR试剂；

3）含有1）或2）的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述基因分型的方法如下：将所述产物进行荧光信号扫描，若所述产物仅显示序列2所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色，则所述待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为CC；若所述产物仅显示序列3所示DNA分子5′端连接荧光标签的颜色，则所述待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为GG；若所述产物显示序列2所示DNA分子和序列3所示DNA分子5′端连接荧光标签的叠加颜色，则所述待测小麦SNP标记AX-109277923的基因型为CG。