CN111270000B

CN111270000B - 与小麦赤霉病抗性相关的kasp引物组及其应用

Info

Publication number: CN111270000B
Application number: CN202010120196.3A
Authority: CN
Inventors: 张平平; 郭程瑾; 宋桂成; 姜朋; 马鸿翔
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2040-02-26
Also published as: CN111270000A

Abstract

本发明公开了一种与小麦赤霉病抗性相关的KASP引物组及其应用，属作物育种领域；该引物组包含核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的特异性引物；该KASP引物组可针对分子标记Qfhb.3AL17928进行基因型鉴定，实验表明，SNP位点基因型为g的小麦样品赤霉病抗性统计学上优于基因型为a小麦样品；该KSAP引物组可用于分子标记辅助选择育种，提高抗赤霉病育种效率。

Description

与小麦赤霉病抗性相关的KASP引物组及其应用

技术领域

本发明涉及作物育种和分子生物学领域，特别是一种与小麦赤霉病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)引起的世界性小麦病害，常发于温暖的湿润、半湿润小麦生产区域，一直是我国长江中下游麦区和东北春麦区最主要的病害，严重影响小麦产量与质量(程顺和,郭文善,王龙俊,姜东,马鸿翔,张伯桥,中国南方小麦,南京:江苏科学技术出版社,2012,pp 281–282)。更为严重的是，因感病导致的小麦籽粒毒素超标直接危及人畜健康(史建荣,刘馨,仇剑波,祭芳,徐剑宏,董飞,殷宪超,冉军舰,小麦中镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染现状与防控研究进展,中国农业科学,47(2014)3641–3654),造成经济产量的隐形损失。近年随着气候变化和耕作制度的变化，如秸秆还田、免耕栽培等，赤霉病发病范围逐渐向干旱半干旱地区扩展，赤霉病已迅速扩展至我国黄淮小麦主产区，严重威胁粮食安全(曾娟,姜玉英,2012年我国小麦赤霉病暴发原因分析及持续监控与治理对策,中国植保导刊,2013,33(4):37–41；张爱民,阳文龙,李欣,孙家柱,小麦抗赤霉病研究现状与展望,遗传,40(2018)858–873；金艳,刘付领,朱统泉,陈杰,赵立尚,河南省小麦赤霉病的发生情况分析与防治对策,河南科技学院学报(自然科学版),2016,44(6):1–4)。

通过耕作栽培措施如深耕、降渍或使用化学防控可有效减轻赤霉病发病程度，但已有的研究表明，小麦品种(基因型)间存在显著的赤霉病抗性差异(L.Wu,Y.Zhang,Y.He,P.Jiang,X.Zhang,H.Ma,Genome-wide association mapping of resistance toFusarium head blight spread and DON accumulation in Chinese elite wheatgermplasm,Phytopathology,2019,109,DOI:10.1094/PHYTO-12-18-0484-R)，因此通过培育抗赤霉病新品种是最经济有效和环境友好型的方法(Z.Su,S.J.Jin,D.D.Zhang,G.H.Bai,Development and validation of diagnostic markers for Fhb1 region,amajor QTL for Fusarium headblight resistance in wheat,Theor.Appl.Genet.131(2018)2371-2380)。分子标记辅助选择育种可在DNA水平对目标性状进行选择，具有结果稳定、高效低成本的突出特征。

分子标记分为质量性状分子标记和数量性状分子标记两大类。质量性状是指同一种性状的不同表现型之间不存在连续性的数量变化，而呈现质的中断性变化的那些性状，由少数起决定作用的遗传基因所支配，比如小麦的糯性由Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三个基因控制，因此通过这三个基因的分子标记可以容易选择到不同糯性的小麦品种(系)或对含有不同糯性基因等位变异的品种(系)的糯性进行判定(穆培源,何中虎,徐兆华,王德森,张艳,夏先春,CIMMYT普通小麦品系Waxy蛋白类型及淀粉糊化特性研究,作物学报,32(2006)1071-1075)。然而，绝大多数的产量、品质和病虫害抗性都属于数量性状，赤霉病抗性就属于典型的数量性状。开展数量性状相关的QTL定位、基因克隆和分子标记开发，进而开展有利基因聚合是提高数量性状的育种效率的必需(A.Distelfeld,C.Uauy,T.Fahima,J.Dubcovsky,Physical map ofthe wheat high-grain protein content geneGpc-B1and development of a high-throughput molecular marker,New Phytol.169(2006)753–763；L.L.Dong,F.M.Wang,T.Liu,Z.Y.Dong,A.L.Li,R.L.Jing,L.Mao,Y.W.Li,X.Liu,K.P.Zhang,D.W.Wang,Natural variation of TaGASR7-A1 affects grain length incommon wheat under multiple cultivation conditions,Mol.Breed 34(2014)937–947)，显然也是培育抗赤霉病新品种的最重要的工作之一(J.Cai,S.Wang,T.Li,G.Zhang,G.Bai,Multiple Minor QTLs are responsible for Fusarium head blight resistancein Chinese wheat landrace Haiyanzhong,PLoS ONE 11(2016)e0163292)。

到目前为止，已报道超过100个赤霉病抗性QTL并报道了连锁的分子标记(S.Liu,M.D.Hall,C.A.Griffey,A.L.McKendry,Meta-analysis ofQTL associated withfusarium headblight resistance in wheat,Crop Sci.49(2009)955-1968)，但在利用这些位点连锁的分子标记时普遍存在两个个问题：(一)抗源农艺性状较差，杂交转育抗性QTL位点时常连锁有不良农艺性状，抗病位点难以利用。(二)这些标记以早前报道的SSR标记为主，标记间遗传距离和物理距离大，预测效果差，需要开发新的分子标记(W.C.Zhou,F.L.Kolb,G.H.Bai,L.L.Dromie,L.K.Boze,N.J.Smith,Validation of a major QTL forscab resistance with SSR markers and use of marker-assisted selection inwheat,Plant Breed.122(2003)40-46)；多数分子标记与抗病基因或QTL连锁不紧密，某一群体内开发的标记在其他遗传背景群体或自然群体内的预测效果较差。总体而言，作为数量性状分子标记，遗传背景的影响是必然存在的，亦是无法避免的，只能通过抗性多基因聚合。

目前已命名的赤霉病抗性基因或QTL有7个，分别为Fhb1～Fhb7，Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5来源于小麦，其中位于3BS上的Fhb1抗病效应最大、最稳定，该抗病基因最近已被克隆，其功能分子标记已经开发(Z.Su,S.J.Jin,D.D.Zhang,G.H.Bai,Development andvalidation of diagnostic markers for Fhb1 region,a major QTL for Fusariumhead blight resistance in wheat,Theor.Appl.Genet.131(2018)2371-2380)。Fhb1在赤霉病抗病品种培育中亦被广泛利用(Y.Hao,A.Rasheed,Z.Zhu,B.B.H.Wulff,Z.He,Harnessing Wheat Fhb1 for Fusarium Resistance,Trends in Plant Science(2019),https://doi.org/10.1016/j.tplants.2019.10.006)，但Fhb1仅能解释小麦赤霉病抗性表型变异的20-50％，仅具有基因的小麦品种无法在病害流行年份达到足够的抗病性，需要与其他抗性位点或基因进行累加(G.Bai,Z.Q.Su,J.Cai,Wheat resistance to Fusariumhead blight,Can.J.Plant Pathol.40(2018)336-346)。另外，作为数量性状的分子标记，Fhb1分子标记仍不可避免的受遗传背景或其他抗性位点或基因的影响(A.N.Bernardo,H.Ma,D.Zhang,G Bai,Single nucleotide polymorphism in wheat chromosome regionharboring Fhb1 for Fusarium head blight resistance,Mol.Breed 29(2012)477-488；朱展望,徐登安,程顺和,高春保,夏先春,郝元峰,何中虎，中国小麦品种抗赤霉病基因Fhb1的鉴定与溯源，作物学报44(2018)473-482)。此外，利用Fhb2、Fhb4和Fhb5连锁标记开展分子标记辅助选择育种也有报道(许峰,李文阳,闫素辉,张从宇,郑甲成,杜军丽,张子学,时侠清,小麦抗赤霉病主效QTL的聚合效应分析,麦类作物学报,5(2017)585-593)。因此，在具有优良农艺性状的大面积推广商业品种中定位抗性QTL，筛选和开发紧密连锁的分子标记是开展分子标记辅助选择聚合育种的重要和必要工作，具有重要的理论和应用价值。

单核苷多态性(SNP)标记是目前最具发展潜力的分子标记，在基因组中具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点(陈秋玲,高建明,罗峰,魏进招,裴忠有,孙守钧,分子标记技术在禾本科作物基因定位上的研究进展,中国农学通报,2010,26(9):42–48)。GBS(Genotyping-by-Sequencing)是近年发展起来的一种简化基因组测序技术，利用酶切加标签的方法，通过测序可获得酶切位点附近的基因组序列信息，进而检测大量高准确性的SNP变异信息，具有方法简单、快速、特异性强的特点，所获得的SNP位点通常在目标群体中多态性较好，而不像高密度SNP芯片那样只能固定地检测特定的位点(R.J.Elshire,J.C.Glaubitz,Q.Sun,J.A.Poland,K.Kawamoto,E.S.Buckler,S.E.Mitchell.A Robust,Simple Genotyping-by-Sequencing(GBS)Approach for High DiversitySpecies.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019379)。

KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过使用荧光探针、标签序列和基因组特异性引物，可在广泛的基因组DNA样品中对SNP不同等位变异区分，具有共显性、高通量、稳定的显著特征，已被用于开发小麦赤霉病抗性QTL分子标记(J.Cai,S.Wang,T.Li,G.Zhang,G.Bai,Multiple Minor QTLs are responsible forFusarium head blight resistance in Chinese wheat landrace Haiyanzhong,PLoSONE 11(2016)e0163292；Z.Su,S.J.Jin,D.D.Zhang,G.H.Bai,Development andvalidation of diagnostic markers for Fhb1 region,a major QTL for Fusariumhead blight resistance in wheat,Theor.Appl.Genet.131(2018)2371-2380)。

扬麦158曾是长江中下游麦区推广面积最大的品种，不仅具有农艺性状优良、广适、优质的特性，而且赤霉病抗性较好，定位其抗病QTL并开发可供利用的分子标记，对于开展抗性聚合育种，提高新品种的赤霉病抗性具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，以及小麦抗赤霉病育种领域的技术需求，本发明提供一种检测小麦基因组是否携带扬麦158赤霉病抗性QTL的KASP引物组，预测小麦样品的赤霉病抗性，提高赤霉病抗病育种效率。本发明是通过如下技术方案实现的。

首先，本申请提供了一组KASP特异性引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的通用反向引物。

其次，本申请还提供了上述KASP特异性引物组在制备用于检测分子标记Qfhb.3AL17982基因型的试剂盒中的应用；所述分子标记Qfhb.3AL17982位于小麦基因组3A染色体的第565574169bp处的SNP位点。具体而言，以PCR第一正向引物、PCR第二正向引物、通用反向引物构成的PCR引物组，对小麦样本进行PCR扩增，同时以小麦样品扬麦158和郑麦9023作为对照；如PCR扩增产物的荧光信号与扬麦158荧光信号一致，则表明该小麦样品于Qfhb.3AL17982分子标记等位变异基因型为g，如小麦样品PCR扩增产物的荧光信号与郑麦9023荧光信号一致，则表明该小麦样品于Qfhb.3AL17982分子标记等位变异基因型为a；所述PCR第一正向引物是以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物的5’端与核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的3’端链接构成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PCR第二正向引物是以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物的5’端与核苷酸序列如SEQID NO.5所示的3’端链接构成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述通用反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第三，本申请还提供了上述KASP特异性引物组在检测小麦赤霉病抗性中的应用；具体而言，以第一正向引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的5’端与核苷酸序列如SEQID NO.4所示引物的3’端链接构成PCR第一正向引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所述)；以上述第二正向引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的5’端与核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示引物的3’端链接构成PCR第二正向引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述的通用反向引物为PCR反向引物，共同构成PCR引物组；

利用上述PCR引物组对小麦样本进行PCR扩增，同时以小麦样品扬麦158和郑麦9023作为对照；如PCR扩增产物的荧光信号与扬麦158荧光信号一致，则表明该小麦样品于Qfhb.3AL17982分子标记等位变异基因型为g，如小麦样品PCR扩增产物的荧光信号与郑麦9023荧光信号一致，则表明该小麦样品于Qfhb.3AL17982分子标记等位变异基因型为a，等位变异基因型为g的小麦样品赤霉病抗性统计学上优于等位变异基因型为a的小麦样品。

PCR反应体系：总体积为4μL，包含2×KASPMaster Mix 1.9444μL、72x KASPprimer Mix 0.0556μL、浓度为20ng μL^-1的小麦样品基因组DNA 2.0μL；其中，每500uL的72xKASP primer Mix包含核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的PCR第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的PCR第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述的通用反向引物依次为60uL、60uL和150uL；所述PCR第一正向引物、PCR第二正向引物、和通用反向引物的浓度均为100uM；

PCR反应程序，第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s；第三步：65℃，1min，每个循环降低0.8℃，共进行11个循环；第四步：94℃，20s；57℃，1min，共进行39个循环；第五步：16℃，10min。

第四，本申请还提供了一种用于检测小麦赤霉病抗性的试剂盒，该试剂盒包括：PCR第一正向引物、PCR第二正向引物和通用反向引物；

所述PCR第一正向引物是以核苷酸序列如SEQ NO.1所示的第一正向引物的5’端与核苷酸序列如SEQ NO.4所示的3’端链接构成，(PCR第一正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示)；所述PCR第二正向引物是以核苷酸序列如SEQ NO.2所示的第二正向引物的5’端与核苷酸序列如SEQ NO.5所示的3’端链接构成(PCR第二正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示)；所述通用反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步而言，上述试剂盒包括：2×KASP Master Mix 1.9444μL、72x KASP primerMix 0.0556μL；其中，每500uL的72x KASP primer Mix，包含：浓度均为100uM的PCR第一正向引物、PCR第二正向引物和通用反向引物各分别为60uL、60uL和150uL。

本申请采用CTAB法对扬麦158和郑麦9023的重组自交系样本进行简化全基因组测序，并利用Joinmap 4.0软件构建连锁群，利用WinQTLCart 2.5软件进行QTL定位，最终获得了与小麦赤霉病抗性紧密连锁的分子标记Qfhb.3AL17928，用于赤霉病抗性育种中的分子标记辅助选择，开拓路新的基因资源与鉴定位点。

Qfhb.3AL17928分子标记于小麦3A染色体的第565574169bp处，具有单核苷酸多态性(SNP)，两种等位变异的基因型为g/a。同时，本申请针对该分子标记设计特异性KASP引物组，准确鉴定该分子标记的基因型，经过试验证明，具有等位变异g的小麦样品赤霉病抗性优于具有等位变异a的小麦样品。在达到相同育种效果的效果下，通过该KASP引物组的实验室检测，即可减少了田间实验材料和劳务成本，提高育种选择效率。

附图说明

图1为Qfhb.3AL在扬麦158×郑麦9023重组自交系群体中的定位图谱；

图2为KASP分子标记Qfhb.3AL17928在扬麦158×郑麦9023 RIL群体内的分型结果示意图；

图3为KASP分子标记Qfhb.3AL17928在自然群体内的分型结果示意图。

具体实施方式

以下实施例所涉核苷酸序列：

SEQ ID NO.1:5’-TCCGTCCACTCCCACGCg-3’

SEQ ID NO.2:5’-TCCGTCCACTCCCACGCa-3’

SEQ ID NO.3:5’-AGCAGTGCCTCAGTAGCAG-3’

SEQ ID NO.4:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’

SEQ ID NO.5:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’

SEQ ID NO.6:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCGTCCACTCCCACGCg-3’

SEQ ID NO.7:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCGTCCACTCCCACGCa-3’

实施例1，Qfhb.3AL17928分子标记开发：

本实施例利用扬麦158和郑麦9023分别作为母本和父本(江苏省农业科学院实验室留存种子)，通过单籽粒传的方法，获得共计231份的重组自交系F_5:7为材料，2016–2017和2017–2018连续两年度种植于温室。

首先在96孔穴盘中播种小麦种子，种子吸水后将穴盘放入春化室(6℃)春化28天，随后转移至温室并定植于花盆，每盆定植8株，每个系种植2盆，随机排放。定植后首月设置白天温度17±2℃，晚上温度13±2℃，随后设置白天温度22±5℃，晚上温度19±2℃，直至成熟。小麦开花期采用单花滴注法接种麦穗中间小穗的一朵小花，接种液为禾谷镰刀菌GZ3696分生孢子悬浮液(Guihua Bai博士提供，G.Bai,F.L.Kolb,G.Shaner,L.L.Domier,Amplified fragment length polymorphism markers linked to a major quantitativetrait locus controlling scab resistance in wheat,Phytopathology.89(1999)343-348.)，孢子液浓度约为100个/uL，接种量为10uL。接种后放入相对湿度为100％的保湿棚48h，然后移回至温室，接种后15天调查每个小穗的病小穗数和总小穗数并计算病小穗率(％)。

采用CTAB法(常规方法，具体参见T.L.Maguire,G.G.Collins,M.Sedgley,Amodified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the familyproteaceae,Plant Mol.Biol.Rep.12(1994)106-109)提取小麦基因组DNA，利用GBS方法(常规方法，具体参见M.Mascher,S.Wu,P.S.Amand,N.Stein,J.Poland,Application ofgenotyping-by-sequencing on semiconductor sequencing platforms:a comparisonof genetic and reference-based marker ordering in barley.PLoS ONE 8(2013)e76925.doi:10.1371/journal.pone.0076925)，进行简化全基因组测序(利用Ion Proton测序平台，运行3次)获取SNP数据。最终选取1063个小于20％missing的SNP，利用Joinmap4.0软件(参见J.Van Ooijen,JoinMap 4.0,Software for the calculation of geneticlinkage maps in experimental populations,Kyazma BV,Wageningen.2006)构建了42个连锁群，覆盖20条染色体，总遗传距离3674.4cM。采用WinQTLCart 2.5软件的区间作图法(Composite interval mapping，CIM)进行QTL定位，设LOD阈值为2.5(参见S.Wang,C.Basten,Z.Zeng,Windows QTL Cartographer 2.5.Department of Statistics,NorthCarolina State University,Raliegh http://statgenncsuedu/qtlcart/WQTLCarthtm.2005)。最终获得多个赤霉病抗性QTL位点，其中有1个QTL位点Qfhb.3AL在两个年度稳定表达，染色体区间为GBS20758–GBS781。

依据中国春参考基因组IWGSC RefSeq v1.0，该染色体区间位于531.4 Mb–594.5Mb约63Mb内的位置(图1)，期间共有9个SNP位点，对这些SNP位点进行KASP标记开发，经RIL小群体验证有7个标记具有多态性，其中标记Qfhb.3AL17982显示了对赤霉病抗性更好的预测效果。该标记抗病和感病等位变异SNP位点分别为g和a，分别与扬麦158和郑麦9023等位变异相同，染色体物理位置为小麦染色体3A的第565574169bp(参考基因组为中国春IWGSC RefSeq v1.0)。

申请人针对标记Qfhb.3AL17982使用Primer3软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物，首先根据正向序列设计多对未成功，随后根据反向互补序列又设计了多对经筛选后，最终获得的标记引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3。并交于生工生物工程(上海)有限公司合成PCR引物组，其中，PCR第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，由核苷酸序列SEQ ID NO.1的5’端与核苷酸序列SEQ ID NO.4的3’端连接而成；PCR第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，由核苷酸序列SEQ ID NO.2的5’端与核苷酸序列SEQ ID NO.5的3’端连接而成；PCR反向引物即为核苷酸序列SEQ ID NO.3。上述的SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5分别为两个通用标签序列，能分别与FAM荧光探针序列和HEX荧光探针序列互补结合。

PCR反应总体系(4μL)：2×KASP Master Mix 1.9444μL、72x KASP primer Mix0.0556μL、浓度为20ngμL^-1的小麦样品基因组DNA2.0μL；其中，每500μL的72x KASP primerMix，包含：100uM的SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.3分别为60uL、60uL和150uL。

在进行上述KASP样品检测时，同时以小麦样品扬麦158和郑麦9023作为对照。

本实施例中，使用LGC Hydrocycler 16的水浴PCR仪进行PCR扩增，使用BMGFLUOstar Omega KASP荧光分析仪扫描PCR扩增产物。

Qfhb.3AL17982分子标记等位变异SNP判定：如PCR扩增产物的荧光信号与SEQ IDNO.4对应的探针荧光相符且与扬麦158荧光信号一致，则表明该小麦样品具有等位变异g(如SEQ ID NO.1所示下划线)，如小麦样品PCR扩增产物的荧光信号与SEQ ID NO.5对应的探针荧光相符且与郑麦9023荧光信号一致，则表明该小麦样品具有等位变异a(如SEQ IDNO.2所示下划线)。

实施例2，Qfhb.3AL17928在重组自交系内验证：

对实施例1中的重组自交系群体231份重组自交系F_5:7小麦样品按实施例1方法，利用Qfhb.3AL17928进行KASP标记扩增检测，检测结果如图2所示。图2中，空白对照N、抗病SNP等位变异g、感病SNP等位变异a三者分型良好，并且与实施例1中GBS测序SNP等位变异符合率100％。表明KASP标记开发成功，Qfhb.3AL17928可进一步应用于小麦样品的赤霉病抗性预测。

实施例3，Qfhb.3AL17928在自然群体内验证：

为了验证Qfhb.3AL17928的有效性，选取长江中下游麦区74份育成品种或高代品系，进行了连续2个年度3点次进行赤霉病接种鉴定。接种方法与实施例1相似，选用禾谷镰刀菌强致病力小种F0609分生孢子悬浮液接种10个麦穗，接种后套袋保湿72h，接种后14天调查每个麦穗的病小穗数，计算每个品种(品系)的病小穗数为10个麦穗的平均值，如表1。

表1 74个小麦品种(系)的Qfhb.3AL17928 SNP等位变异及病小穗数

基因组DNA提取与实施例1相同。利用实施例1获得的KASP分子标记Qfhb.3AL17928对74份小麦样品进行基因分型鉴定，检测结果如图3所示。图3中，空白对照N、抗病SNP等位变异g、感病SNP等位变异a三者分型良好。使用SAS 9.0，对不同SNP等位变异间的赤霉病表型数据的差异进行显著性比较，结果如表2。

表2具有Qfhb.3AL17928 SNP不同等位变异小麦品种(系)间平均病小穗数的显著性比较

注：同列中不同的小写字母表示差异显著水平为0.05，同列中不同的大写字母表示差异显著水平为0.01。

该实施例表明，使用分子标记Qfhb.3AL17928对74份随机选取品种(系)鉴定，在3个点次，以及3点次平均值中，具有SNP等位变异g的基因型比具有SNP等位变异a的基因型平均病小穗数降低分别为1.48、2.40、1.47和1.78个，平均病小穗数降低率分别为23.9％、37.4％、38.7％和32.8％。除2018年六合区外，等位变异g对病小穗数的降幅作用均达到1％的显著水平。可见，具有等位变异g的小麦样品赤霉病抗性优于具有等位变异a的小麦样品，具有统计学意义。

实施例1-3表明，分子标记Qfhb.3AL17928及检测该分子标记基因型的KASP引物组可以用于赤霉病抗性育种中的分子标记辅助选择，预测小麦赤霉病抗性，提高育种选择效率。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 与小麦赤霉病抗性相关的KASP引物组及其应用

<141> 2020-02-26

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccgtccact cccacgcg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtccact cccacgca 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcagtgcct cagtagcag 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtgacc aagttcatgc ttccgtccac tcccacgcg 39

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaggtcgga gtcaacggat ttccgtccac tcccacgca 39

Claims

1.与小麦赤霉病抗性相关的KASP引物组在检测小麦赤霉病抗性中的应用，其特征在于，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用反向引物；具有等位变异g的小麦样品赤霉病抗性优于具有等位变异a的小麦样品；

所述小麦为长江中下游麦区小麦。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述在检测小麦赤霉病抗性中的应用是指：以所述第一正向引物、第二正向引物、通用反向引物构成的KASP引物组对小麦样品进行PCR扩增，同时以扬麦158和郑麦9023作为对照；如获得的小麦样品PCR扩增产物的荧光信号与扬麦158荧光信号一致，则小麦样品具有等位变异基因型g；如获得的小麦样品PCR扩增产物的荧光信号与郑麦9023荧光信号一致，则小麦样品具有等位变异基因型a；具有等位变异g的小麦样品赤霉病抗性优于具有等位变异a的小麦样品。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增是指：

PCR反应体系：总体积为4μL，包含2×KASP Master Mix 1.9444 μL、72x KASP primerMix 0.0556 μL、浓度为20 ng/μL的小麦样品基因组DNA 2.0 μL；其中，每500 uL的72xKASP primer Mix，包含：浓度均为100 uM的所述第一正向引物、第二正向引物和通用反向引物各60 uL、60 uL和150 uL；

PCR反应程序，第一步：94℃，15 min；第二步：94℃，20 s；第三步：65℃，1 min，每个循环降低0.8℃，共进行11个循环；第四步：94℃，20 s；57℃，1 min，共进行39个循环；第五步：16℃，10 min。