CN116064903B - 水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记及其专用引物 - Google Patents

水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记及其专用引物 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物技术领域，公布一种水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记及其专用引物。该分子标记是水稻抗稻瘟病基因Pi69(t)的共分离、共显性标记Pi69(t)‑InDel，Pi69(t)‑InDel‑FW正向引物和Pi69(t)InDel‑RV反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；该共分离分子标记能够准确筛选出含有抗性基因Pi69(t)的水稻材料(包括含有该抗病基因的纯合和杂合材料)，能有效预测水稻植株中是否含有该基因，可用于水稻稻瘟病抗性育种中Pi69(t)的分子标记辅助选择，从而大大加快抗稻瘟病水稻材料筛选进程，减少田间鉴定工作量。

Description

水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记及其专用 引物
技术领域
本发明属于水稻抗病性分子生物技术领域，具体涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi69(t)的共分离分子标记及其专用引物。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食，水稻也是我国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。由真菌Magnaporthe oryzae1引起的稻瘟病是世界水稻生产区危害最为严重的病害之一，全球每年因稻瘟病危害所造成的经济损失超过70亿美元；发病田块通常可造成10-30％的水稻减产，严重的田块甚至绝收2-5。该病既可降低水稻产量，也可降低水稻品质，已成为限制水稻生产的重要因素。由于稻瘟病菌和水稻品种之间的特异性互作符合Flor“基因对基因”假说，持有特定抗病基因的水稻品种与病原菌互作时，只有病原菌持有与该特定基因相对应的无毒基因时，品种才表现出抗性，其它任何一种情况品种均表现感病6。如果水稻品种所携带的抗病基因对稻瘟病菌的抗谱狭窄，品种单一化，集中化种植现象普遍，一旦稻瘟病菌流行小种发生变异，水稻品种对稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，利用抗病基因的分子标记辅助选择抗病个体是广大育种家采用的高效技术手段，特别是广谱抗病基因用于抗病育种以解决品种的抗病性，已成为当前抗病育种中最为紧迫的问题。
独立起源和驯化的非洲栽培稻(O.glaberrima)有许多抗生物胁迫和非生物胁迫的优异种质资源，与亚洲栽培稻(O.sativa)相比，其特殊的驯化和栽培环境，使得非洲栽培稻具有优良的抗病虫的特性，是改良亚洲栽培稻的重要基因库7-9。滇粳优1号为云南典型的主栽粳稻品种，具有许多优良的农艺性状，为挖掘和利用非洲栽培稻中的抗稻瘟病基因，本申请人项目组利用前期构建的一套以滇粳优1号(感稻瘟病粳稻品种)为背景的非洲栽培稻基因组渗入系BC5F4代不同株系开展研究，通过田间病圃鉴定及采集自不同稻区的53个优势稻瘟病菌单孢菌株对水稻渗入系BC5F4不同株系及滇粳优1号苗期室内接种鉴定，发现非洲栽培稻渗入系IL106高抗稻瘟病，而滇粳优1号感稻瘟病，表明IL106携带的抗性基因可能来自非洲栽培稻所持的基因，具有广谱抗稻瘟病的特点；利用稻瘟病菌菌株(09BSH-10-5A)接种IL106与感稻瘟病粳稻品种滇粳优1号杂交获得的F2代群体(BC6F2)，发现该材料中持有1个显性抗稻瘟病基因，命名为Pi69(t)，并将该基因精细定位在水稻第6染色体长臂上，通过基因所在区域候选基因的注释分析、遗传转化载体的构建以及农杆菌介导的遗传转化功能互补验证实验，最终克隆了Pi69(t)基因(待发表)。由于该基因广谱抗稻瘟病，在抗病育种中具有广阔的利用前景，因此有必要开发Pi69(t)基因的共分离分子标记及其专用引物，为利用该基因培育水稻新品种具有重要意义，同时已扩大了水稻品种的抗源材料。
参考文献：
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9.Wang M，Yu Y，Haberer G，Marri PR，Fan C，Goicoechea JL，Zuccolo A，SongX，Kudrna D，Ammiraju JSS，Cossu RM，Maldonado C，Chen J，ee S，Sisneros N，BaynastK，Golser W，Wissotski M，Kim W，Sanchez P，Ndjiondjop MN，Sanni K，Long M，Carney J，Panaud O，Wicker T，Machado CA，Chen M，Mayer KFX，Rounsley S，Wing RA.The genomesequence of African rice(Oryza glaberrima)and evidence for independentdomestication.Nature Genetics，2014，46:982-991.
发明内容
为了选育广谱抗稻瘟病的水稻新品种，有针对性地、特异地选择含有Pi69(t)基因的水稻后代材料，扩大水稻品种的新抗源材料，根据上述研究背景，以抗稻瘟病基因Pi69(t)的基因组系列为参考，本发明设计一种与Pi69(t)基因共分离的分子标记Pi69(t)-InDel及其专用引物，该分子标记可将基因Pi69(t)准确地锚定在水稻第6染色体长臂上，通过检测与Pi69(t)共分离的分子标记Pi69(t)-InDel，就可以检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)以及杂交后代中是否存在纯合或杂合抗稻瘟病基因Pi69(t)，不仅操作简单，且准确率100％，可高效用于Pi69(t)基因的辅助选择，进而能加快抗稻瘟病品种的选育效率。
本发明采取以下技术方案：
本发明提供水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记Pi69(t)-InDel，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种用于检测上述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记Pi69(t)-InDel的专用引物，所述专用引物由Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物组成，所述Pi69(t)-InDel-FW正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1所示，Pi69(t)-InDel-RV反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供一种检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，其特征在于，用上述Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物对待检测水稻亲本基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离，获得长度为201bp片段的水稻亲本为含有抗稻瘟病基因Pi69(t)；扩增出长度为164bp片段的水稻亲本为不含有抗稻瘟病基因Pi69(t)而含有其感病等位基因。
进一步，上述检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，所述经琼脂糖凝胶电泳分离为经3％琼脂糖凝胶电泳分离。
本发明还提供一种检测水稻杂交后代中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，其特征在于，用上述Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi6(t)-InDel-RV反向引物对待检测水稻杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离，只获得长度为201bp片段的水稻杂交后代为含有纯合抗稻瘟病基因Pi69(t)的水稻杂交后代材料；只扩增出长度为164bp片段的水稻杂交后代为不含有抗稻瘟病基因Pi69(t)而含有其感病等位基因的水稻杂交后代材料；获得片段长度为201bp和164bp两条片段的水稻杂交后代为含有杂合抗稻瘟病基因Pi69(t)的水稻杂交后代材料。
进一步，上述检测水稻杂交后代中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，所述经琼脂糖凝胶电泳分离为经3％琼脂糖凝胶电泳分离。
进一步，上述检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，或检测水稻杂交后代中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，所述的PCR扩增反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM Pi69(t)-InDel-FW正向引物1μL、10μM Pi69(t)-InDel-RV反向引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；循环内95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min。
本发明提供的抗稻瘟病基因Pi69(t)的共分离分子标记Pi69(t)-InDel是该目的基因上的一个特异标记，位于水稻第6染色体上的物理距离为29.89Mb，可以将抗稻瘟病基因Pi69(t)准确锚定在水稻第6染色体长臂上。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.非洲栽培稻(O.glaberrima)有许多抗生物胁迫和非生物胁迫的优异种质资源，其特殊的驯化和栽培环境，使得非洲栽培稻具有优良的抗病虫的特性，是改良亚洲栽培稻的重要基因库，抗稻瘟病基因Pi69(t)基因就来源于非洲栽培稻。
2.本发明开发的抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记Pi69(t)-InDel，位于该基因内部，是通过基因所在区域候选基因的注释分析、遗传转化载体的构建及农杆菌介导的遗传转化功能互补验证实验完成的基础上，克隆了Pi69(t)基因，并根据该基因组序列的插入缺失多态性设计的，标记特异性高，双亲间差异明显，可操作性强，扩增出的目标片段单一，容易检测，只要通过简单的PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳检测技术，就可以确定目的基因，检测环保、方便、快捷、高效。
3.抗病品种传统选育的方法主要依赖于抗性鉴定和表型选择，不仅周期长，选拔效率低，而且受环境、季节等诸多条件的限制，因而制约了抗病新品种的选育；本发明建立在PCR扩增基础上的分子标记辅助选择(mark-assisted selection，MAS)技术选育目标明确，稳定性好、选拔效率高和对抗性基因的选择不受环境因素影响等特点，从而有效提高了常规育种的辅助选育效率。
4.本发明共分离分子标记及其专用引物在水稻整个生育期的任何阶段都可以通过提取待检水稻材料的DNA进行PCR扩增检测抗稻瘟病基因Pi69(t)，检测时间安排灵活，通过检测与抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离的分子标记，即可预测水稻稻瘟病的抗性。
5.由于本发明提供的共分离分子标记Pi69(t)-InDel位于该抗稻瘟病基因上，准确率可达100％，能够准确、有效筛选出含有目标基因的水稻材料。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是Pi69(t)-InDel-FW正向引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是Pi69(t)-InDel-RV反向引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO:3所示的是水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记Pi69(t)-InDel的核苷酸序列。
附图说明
图1：用Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物在抗稻瘟病基因Pi69(t)供体非洲栽培稻渗入系IL106(抗病亲本)、滇粳优1号(感病亲本)及7个云南审定水稻主栽品种基因组DNA进行PCR扩增的扩增产物在3％琼脂糖凝胶中的水平电泳图。图1中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，编号1-9各表示，1：IL106，2：滇粳优1号，3：丽粳9号，4：凤稻17号，5：楚粳30号，6：靖粳9号，7：轰杂135，8：岫07-33号，9：云粳29号。
图2：用Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物在非洲栽培稻渗入系IL106(抗病亲本)与滇粳优1号(感病亲本)杂交获得的F1代群体基因组DNA进行PCR扩增的部分扩增产物在3％琼脂糖凝胶中的水平电泳图。图2中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，编号1：IL106，编号2：滇粳优1号，编号3-19各表示：抗病亲本与感病亲本杂交后的F1代群体随机取样样本的电泳图。
图3：用Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物在非洲栽培稻渗入系IL106(抗病亲本)与滇粳优1号(感病亲本)杂交获得的F2代分离群体基因组DNA进行PCR扩增的部分扩增产物在3％琼脂糖凝胶中的水平电泳图。图3中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，编号1：IL106，编号2：滇粳优1号，编号3至编号19：抗病亲本与感病亲本杂交后自交的F2代分离群体随机取样样本的电泳图。
具体实施方式
本发明的实施方案，如未特别说明，实施过程中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。
本文中所称“抗病”均是指抗稻瘟病，所称“感病”均是指感稻瘟病；非洲栽培稻渗入系IL106简称：IL106。
实施例涉及的生物材料：
非洲栽培稻渗入系IL106在非专利文献“Identification and Fine Mapping ofPi69(t)，a New Gene Conferring Broad-Spectrum Resistance Against Magnaportheoryzae From Oryza glaberrima Steud”，Frontiers in Plant Science，2020，11:1190.doi:10.3389/fpls.2020.01190”公开。
稻瘟病菌株09BSH-10-5A：在非专利文献“刘树芳等.抗稻瘟病基因Piz-t和Pi9连锁标记开发及在云南粳稻中的应用.西南农业学报，2016，29(4):721-725”公开。
上述非洲栽培稻渗入系IL106和稻瘟病菌株09BSH-10-5A由申请人保存，按中国法律法规相关规定自本专利申请日起20年内申请人可提供，申请人联系地址：云南省昆明市盘龙区北京路2238号，云南省农业科学院农业环境资源研究所，邮编：650205。
各实施例中所用的水稻品种“滇粳优1号，丽粳9号，凤稻17号，楚粳30号，靖粳9号，轰杂135，岫07-33号，云粳29号”以及所有试剂均可通过商业渠道购买。
实施例1DNA提取、PCR扩增和PCR产物检测
采用CTAB的方法提取供试材料的DNA，步骤包括：
(1)取幼嫩的水稻叶片约1g，用液氮研磨后，移入1.5ml离心管，加800μLCTAB混匀后，放入65℃水浴30min(每15min混匀一次)；
(2)加入200μL三氯甲烷混匀后，在12000rpm下离心10min；
(3)取上清液转移至另一新的1.5ml离心管，加入600μL异丙醇，上下颠倒至絮状物出现，在12000rpm下离心10min；
(4)弃上清液，加入75％的乙醇约800μL，上下颠倒混合，进行DNA清洗后，在12000rpm下离心3min；
(5)弃上清液，在室温晾干沉淀物，加200μL 0.1TE溶解，4℃放置，过夜溶解DNA；
(6)用分光光度计测定提取的DNA浓度，并将其配制成浓度为10ng/μL的工作液，放-20℃冰箱保存备用。
PCR扩增反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM正向引物1μL、反向引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；循环内95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min；取PCR扩增产物2μL在3％琼脂糖凝胶上电泳，通过凝胶成像系统成像并保存。
实施例2稻瘟病菌接种及表型评价
稻瘟病菌株09BSH-10-5A进行活化接种于燕麦培养基上(燕麦30g，琼脂粉15g，蔗糖15g，然后加水到1000mL)，25℃下培养7～9d，待菌丝基本长满培养基后，用灭菌水洗去气生菌丝，在普通日光灯下连续光照培养3d进行产孢。之后，用蒸馏水洗下孢子并加入为0.02％(质量分数)的Tween-20制成孢子悬浮液用于喷雾接种，孢子悬浮液浓度调整到2×105个孢子/mL。
水稻种子用自来水浸种催芽后，用镊子播于装有秧田土的塑料育苗盒内，在温室内育苗。用上述稻瘟病菌株09BSH-10-5A孢子悬浮液于水稻苗3.5叶期进行喷雾接种，接种后的苗置于保湿培养箱(日本池田理化产)内黑暗状态下25℃保湿培养24h(相对湿度≥95％)。保湿培养后取出放在温室内，每天进行多次清水喷雾以保持温室的湿度，创造有利发病的条件。接种7～10d后进行稻瘟病发病情况调查。稻瘟病分级标准按6级进行划分(参考董丽英等，云南省稻瘟病菌群体对稻瘟病抗性单基因系的致病性分析，西南农业学报，2012，25(2):467-473)，0级：无病斑；1级：褐点型病斑，直径≤1mm，不具产孢能力；2级：椭圆形病斑，1mm＜直径≤2mm，病斑周围具褐色边缘，中央灰白色，具产孢能力；3级：椭圆形病斑，2mm＜直径≤3mm，病斑周围具褐色边缘，中央灰白色，具产孢能力；4级：典型的梭形或纺锤形病斑，直径>3mm，病斑有融合或无融合；5级：病斑类型与4级相同，但由于病斑间融合，叶片上半部枯死。其中，0～2级归为抗病反应(R)，3～5级归为感病反应(S)。
实施例3利用共分离分子标记Pi69(t)-InDel检测水稻育种亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)
3.1表型验证：分别将非洲栽培稻渗入系IL106(抗病亲本)、滇粳优1号(感病亲本)及7个云南审定的水稻主栽品种(丽粳9号，凤稻17号，楚粳30号，靖粳9号，轰杂135，岫07-33号，云粳29号)浸种催芽后，在温室按顺序用镊子播于装有秧田土的6cm×18cm×10cm塑料育苗盒内，3次重复；当育苗盒的水稻长到3.5叶期时，用稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种水稻植株，7-10天后对其进行表型鉴定，具体稻瘟病菌株培养、接种、调查等与实例2相同。结果显示：除抗病亲本IL106表现抗病外，滇粳优1号(感病亲本)及7个云南水稻主栽品种(丽粳9号，凤稻17号，楚粳30号，靖粳9号，轰杂135，岫07-33号，云粳29号)均表现为感病。
3.2PCR扩增验证：采用实施例1中的CTAB法按3.1水稻表型验证中的调查顺序提取各水稻材料的水稻叶片DNA，分别用Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物对提取的水稻叶片DNA进行PCR扩增，扩增反应体系及条件同实施例1。取2μL扩增产物在3％琼脂糖凝胶中水平电泳后，通过凝胶成像系统成像观察，出现共分离分子标记Pi69(t)-InDel所用引物对(Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物)扩增的条带(如图1所示)，图1中扩增子长度为201bp的片段是含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的抗病亲本非洲栽培稻渗入系IL106(图1中编号1)，而扩增子长度为164bp的片段是感病亲本滇粳优1号(图1中编号2)和7个云南审定水稻主栽品种(图1中编号3至编号9，依次是：丽粳9号，凤稻17号，楚粳30号，靖粳9号，轰杂135，岫07-33号，云粳29号)。
接种鉴定结合基因扩增验证实验显示：非洲栽培稻渗入系IL106、滇粳优1号及7个云南审定水稻主栽品种(丽粳9号，凤稻17号，楚粳30号，靖粳9号，轰杂135，岫07-33号，云粳29号)分别通过分子标记Pi69(t)-InDel所用的引物对(Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物)进行PCR扩增分析结果与接种表型鉴定的结果一致，即含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的非洲栽培稻渗入系IL106的植株表现抗病，不含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的亲本滇粳优1号及丽粳9号等上述7个云南审定水稻主栽品种植株表现感病。
实施例4利用共分离分子标记Pi69(t)-InDel在杂交后代中筛选携带Pi69(t)基因的纯合个体。
4.1表型验证：将所述的抗病亲本IL106，感病亲本滇粳优1号及抗病亲本IL106与感病亲本滇粳优1号杂交后的F1代以及杂交后自交的F2代群体的种子浸种催芽后，在温室分别用镊子播于装有秧田土的12cm×18cm×5cm的2个塑料育苗盒内(第一个育苗盒：水稻编号1为抗病亲本IL106，编号2为感病亲本滇粳优1号，后面编号3-90为随机播种的F1代水稻种子；第二个育苗盒：编号1为抗病亲本IL106，编号2为感病亲本滇粳优1号，后面编号3-90为随机播种的F2代水稻种子)，每行播种10粒，共播种9行；待育苗盒内的水稻长到3.5叶期时，用稻瘟病菌株09BSH-10-5A接种2个育苗盒内的水稻植株，7-10天后进行表型鉴定，具体稻瘟病菌株培养、接种、调查与实施例2相同。按顺序分别对这两个育苗盒中的水稻植株进行表型调查。调查结果显示：第一个育苗盒除编号为2的水稻植株表现为感病外，其余水稻植株均为抗病；第二个育苗盒中有抗病和感病植株，但以抗病植株居多。
4.2PCR扩增验证：同时对4.1表型调查后的2个育苗盒分别将编号为1-19的水稻植株采用实施例1中的CTAB法提取水稻基因组的DNA，分别利用Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物对提取的水稻基因组的DNA进行PCR扩增，扩增反应体系及条件同实施例1；分别取2μL第一个育苗盒和第二育苗盒中水稻DNA的扩增产物在3％琼脂糖凝胶中水平电泳后，通过凝胶成像系统成像观察，出现分子标记Pi69(t)-InDel所用引物对(Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物)扩增的条带，第一个育苗盒：编号1的条带201bp，编号2的条带为164bp，编号3-19的条带为201bp和164bp两条条带(如图2所示)；第二个育苗盒：编号1、5、10、14的条带为201bp，编号2、9、11、16、18的条带长度均为164bp，编号3、4、6、7、8、12、13、15、17、19均出现两条条带，其两条条带长度分别为201bp、164bp(如图3所示)。
接种鉴定及分子标记扩增的结果表明：图2中F1代杂合群体中扩增子为1条长度的201bp片段的纯合个体及扩增子为2条长度的201bp和164bp片段的杂合个体均对稻瘟病抗病；图3中F2代分离群体中扩增子为1条长度的201bp片段的纯合个体以及扩增子为2条长度的201bp和164bp片段的杂合个体均对稻瘟病抗病；F2代分离群体中扩增子为1条长度的164bp片段的纯合个体均对稻瘟病感病。
结果表明：含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的非洲栽培稻渗入系IL106及其杂合个体表现抗病，不含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的植株表现感病。
结论：分别对上述水稻材料以及抗病亲本和感病亲本杂交后的88个F1代杂合群体和88个F2代分离群体进行苗期表型接种鉴定和分别按顺序提取各个水稻单株基因组DNA进行PCR扩增电泳检测，其表型鉴定结果与扩增出的相应片段大小一致，抗病基因检测率达100％。因此，抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记Pi69(t)-InDel，可以用于检测水稻品种或水稻材料中抗稻瘟病基因Pi69(t)是否存在，还可以检测含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的纯合亲本以及筛选杂合群体中含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的纯合个体的标记，不仅节约生产成本、选拔的准确率达到100％、不受环境影响，大大提高了选择的效率，提供了含有抗稻瘟病基因Pi69(t)的新抗源水稻育种材料，加速了筛选抗稻瘟病新品种的育种进程。

Claims (7)

1.水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记Pi69(t)-InDel，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种用于检测权利要求1所述的水稻广谱抗稻瘟病基因Pi69(t)共分离分子标记Pi69(t)-InDel的专用引物，所述专用引物由Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物组成，所述Pi69(t)-InDel-FW正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，Pi69(t)-InDel-RV反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，其特征在于，用权利要求2所述的Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物对待检测水稻亲本基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离，获得长度为201bp片段的水稻亲本为含有抗稻瘟病基因Pi69(t)；扩增出长度为164bp片段的水稻亲本为不含有抗稻瘟病基因Pi69(t)而含有其感病等位基因。
4.如权利要求书3所述的检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，其特征在于，所述经琼脂糖凝胶电泳分离为经3％琼脂糖凝胶电泳分离。
5.一种检测水稻杂交后代中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，其特征在于，用权利要求2所述的Pi69(t)-InDel-FW正向引物和Pi69(t)-InDel-RV反向引物对待检测水稻杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离，只获得长度为201bp片段的水稻杂交后代为含有纯合抗稻瘟病基因Pi69(t)的水稻杂交后代材料；只扩增出长度为164bp片段的水稻杂交后代为不含有抗稻瘟病基因Pi69(t)而含有其感病等位基因的水稻杂交后代材料；获得片段长度为201bp和164bp两条片段的水稻杂交后代为含有杂合抗稻瘟病基因Pi69(t)的水稻杂交后代材料。
6.如权利要求书5所述的检测水稻杂交后代中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，其特征在于，所述经琼脂糖凝胶电泳分离为经3％琼脂糖凝胶电泳分离。
7.如权利要求3至4任一权利要求所述的检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，或如权利要求5至6任一权利要求所述的检测水稻杂交后代中是否存在抗稻瘟病基因Pi69(t)的方法，其特征在于：PCR扩增反应体系20μL，其中含有2×ES Taq MasterMix 10μL、10μM Pi69(t)-InDel-FW正向引物1μL、10μM Pi69(t)-InDel-RV反向引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；循环内95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min。
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