CN112680537B - 水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记及其应用 - Google Patents

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刘树芳
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Abstract

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记及其应用。包括共分离分子标记Pi57‑InDel‑1、Pi57‑InDel‑2，以及Pi57‑InDel‑1FW引物、Pi57‑InDel‑1RV引物、Pi57‑InDel‑2FW引物、Pi57‑InDel‑2RV引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6所示。本发明能够准确选出含有水稻稻瘟病抗性基因Pi57的水稻材料，有效预测水稻植株对稻瘟病的抗性与否，可用于水稻稻瘟病抗性育种中基因Pi57的分子标记辅助选择，从而大大加快水稻抗病育种中抗稻瘟病水稻材料筛选进程。

Description

水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记及其应用
技术领域
本发明属于水稻抗病性分子生物技术领域，具体涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi57的2个共分离分子标记及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食，水稻也是我国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源；由真菌Magnaporthe oryzae1引起的稻瘟病是世界水稻生产区为害最为严重的病害之一，全球每年因稻瘟病危害所造成的经济损失超过70亿美元；发病田块通常可造成10-30％的水稻减产，严重的田块甚至绝收2-5。该病既可降低水稻产量，也可降低水稻品质，已成为限制水稻生产的重要因素。由于稻瘟病菌和水稻品种之间的特异性互作符合Flor“基因对基因”假说，持有特定抗病基因的水稻品种与病原菌互作时，只有病原菌持有与该特定基因相对应的无毒基因时，品种才表现出抗性，其它任何一种情况品种均表现感病6。因此，抗病品种的利用、选育和推广是水稻生产上控制该病最经济、有效和环境友好的防治措施，特别是广谱抗病基因用于抗病育种以解决品种的抗病性，已成为当前抗病育种中最为紧迫的问题。
长雄野生稻(O.longistaminata)是野生稻中抗生物胁迫和非生物胁迫的优异种质资源，其广泛分布于热带非洲的一个多年生野生种，与亚洲栽培稻(O.sativa)具有相同的AA基因组。国内外通过长期研究发现，该种质资源耐冷性强、抗水稻东革鲁病毒病、抗根结线虫、抗稻瘟病和抗白叶枯病等，高抗白叶枯病的Xa21基因就来源于长雄野生稻7-10。为鉴定和研究长雄野生稻中的抗稻瘟病基因，本申请人项目组利用前期构建的一套以RD23(RD23感病籼稻品种)为背景的长雄野生稻基因组渗入系开展研究，通过田间病圃鉴定及采集自云南不同稻区的75个稻瘟病菌单孢菌株室内接种鉴定，发现水稻渗入系IL-E1454高抗稻瘟病，表明IL-E1454所持的基因可能具有广谱抗稻瘟病的特点；利用稻瘟病菌HN09-1C-7菌株接种水稻渗入系IL-E1454与感病籼稻品种RD23杂交获得的F2群体，发现该材料中持有1个显性抗稻瘟病基因。本项目组采用图位克隆策略分离克隆了该基因，命名为Pi57基因，为了明确水稻渗入系IL-E1454中抗性基因Pi57对稻瘟病的抗性水平，实验室利用来源于中国、柬埔寨、老挝、缅甸、泰国和越南的322个稻瘟病菌单孢菌株接种水稻渗入系IL-E1454，抗谱测定结果表明，水稻渗入系IL-E1454对前述6个国家采集的322分菌株的抗谱达到91％以上，说明Pi57基因具有广谱抗稻瘟病的特性，可以作为抗病育种的抗源在这些地方利用11。因此，有必要开发出与其共分离的分子标记用于水稻抗稻瘟病的辅助选择。
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发明内容
为了选育广谱抗稻瘟病水稻品种，有针对性地选择含有Pi57基因的水稻后代材料，根据上述研究背景，本发明提供水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记及其应用，该共分离分子标记为Pi57-InDel-1和Pi57-InDel-2两个分子标记，本发明采取以下技术方案：
一种水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1，所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1的片段长度为132bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
一种水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2，所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2的片段长度为143bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
所述共分离分子标Pi57-InDel-1在水稻第12染色体上的物理距离为10.8313Mb,共分离分子标Pi57-InDel-2在水稻第12染色体上的物理距离为10.8316Mb。
本发明还提供了所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
本发明还提供了所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
本发明还提供了用于扩增所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1的引物对为Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物，所述Pi57-InDel-1FW引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，Pi57-InDel-1RV引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
本发明还提供了用于扩增所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2的引物对为Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物，所述Pi57-InDel-2FW引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，Pi57-InDel-2RV引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明还提供了用于扩增水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
本发明还提供了用于扩增水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57共分离分子标记Pi57-InDel-2的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
进一步，在用于扩增水稻广谱抗稻瘟病基因Pi5的共分离分子标记Pi57-InDel-1的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用中，用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出132bp的片段，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出129bp的片段，则目标水稻材料不含抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中同时扩增出132bp和129bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi57位点的杂合水稻材料。
进一步，在用于扩增水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用中，用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物扩增的PCR扩增反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM Pi57-InDel-1FW引物1μL、10μM Pi57-InDel-1RV引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min。
进一步，用于扩增水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用，用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出143bp的片段，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出185bp的片段，则目标水稻材料不含抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中同时扩增出143bp和185bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi57位点的杂合水稻材料。
进一步，用于水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用，用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物扩增的PCR扩增反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM Pi57-InDel-2FW引物1μL、10μM Pi57-InDel-2RV引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.抗病品种传统选育的方法主要依赖于抗性鉴定和表型选择，不仅周期长，选拔效率低，而且受环境等诸多条件的限制，因而制约了抗病新品种的选育；本发明建立在PCR扩增基础上的分子标记辅助选择(mark-assisted selection，MAS)技术其具有操作简便、稳定性好、选拔效率高和对抗性基因的选择不受环境因素影响等特点。
2.长雄野生稻(O.longistaminata)是野生稻中抗生物胁迫和非生物胁迫的优异种质资源，是有效扩宽现有栽培稻遗传基础的重要途径之一。本申请人项目组前期在长雄野生稻渗入系中克隆了新的广谱抗稻瘟病基因Pi57，为拓宽亚洲栽培稻的抗性遗传基础提供了重要的抗源。
3.本发明所用的对稻瘟病抗病的亲本水稻渗入系IL-E1454和对稻瘟病感病的轮回亲本RD23分别来自于长雄野生稻渗入系和亚洲籼稻品种，属于远源杂交，双亲间差异明显，在双亲多态性选择上更具有特异性，而且扩增的目标片段单一，容易检测。
4.本发明的两个分子标记在水稻整个生育期的任何阶段都可以对其DNA进行PCR扩增检测抗稻瘟病基因Pi57，检测时间安排灵活，通过检测与抗稻瘟病基因Pi57共分离的分子标记，即可预测水稻稻瘟病的抗性。
5.由于Pi57基因共分离分子标记Pi57-InDel-1和Pi57-InDel-2位于该基因内部，可将Pi57基因精确地锚定在水稻第12染色体上，通过检测与Pi57基因的共分离分子标记Pi57-InDel-1或Pi57-InDel-2，可以检测水稻材料是否持有Pi57抗性基因，不仅操作简单，而且检测准确率达100％，能够准确、有效筛选出含有目标基因的水稻材料，可有效加快选择抗稻瘟病水稻品种的育种进度。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是Pi57-InDel-1FW引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是Pi57-InDel-1RV引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是Pi57-InDel-2FW引物的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：6所示的是Pi57-InDel-2RV引物的核苷酸序列。
附图说明
图1：分子标记Pi57-InDel-1所用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物对水稻渗入系IL-E1454(抗病亲本)、籼稻品种RD23(感病亲本)及11个云南水稻主栽品种的DNA进行PCR扩增的扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中的垂直电泳图。图1中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，编号1至编号13各表示：1：水稻渗入系IL-E1454，2：籼稻品种RD23，3：云粳26号，4：云粳29号，5：楚粳28号，6：楚粳37号，7：楚粳40号，8：凤稻23号，9：靖稻1号，10：丽粳14号，11：丽粳15号，12：岫粳18号，13：滇粳优1号。
图2：分子标记Pi57-InDel-2所用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物对水稻渗入系IL-E1454(抗病亲本)、籼稻品种RD23(感病亲本)及11个云南水稻主栽品种的DNA进行PCR扩增的扩增产物在3％琼脂糖凝胶中的水平电泳图。图2中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，编号1至编号13各表示：1：水稻渗入系IL-E1454，2：籼稻品种RD23，3：云粳26号，4：云粳29号，5：楚粳28号，6：楚粳37号，7：楚粳40号，8：凤稻23号，9：靖稻1号，10：丽粳14号，11：丽粳15号，12：岫粳18号，13：滇粳优1号。
图3：分子标记Pi57-InDel-1所用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物对水稻渗入系IL-E1454(抗病亲本)与籼稻品种RD23(感病亲本)杂交获得的F2代分离群体的DNA进行PCR扩增的部分扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中的垂直电泳图。其中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，图中编号1：水稻渗入系IL-E1454，编号2：籼稻品种RD23，编号3至编号20：随机选取的抗病亲本与感病亲本杂交后自交的F2代分离群体。
图4：分子标记Pi57-InDel-2所用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物对水稻渗入系IL-E1454(抗病亲本)与籼稻品种RD23(感病亲本)杂交获得的F2代分离群体的DNA进行PCR扩增的部分扩增产物在3％琼脂糖凝胶中的水平电泳图。其中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，图中编号1：水稻渗入系IL-E1454，编号2：籼稻品种RD23，编号3至编号20：随机选取的抗病亲本与感病亲本杂交后自交的F2代分离群体。
以上图1至图4中，M：2000bp分子量标记(DL2000)，80ng，片段长度分别为：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。
具体实施方式
本发明的实施方案，如未特别说明，实施过程中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。
实施例涉及的生物材料水稻渗入系IL-E1454在非专利文献“Dong et al.Finemapping of Pi57(t)conferring broad spectrum resistance against Magnaportheoryzae in introgression line IL-E1454 derived from Oryza longistaminata.PLOSONE,2017,12(10):e0186201；Xu et al.Identification and mapping of a novel blastresistance gene Pi57(t)in Oryza longistaminata.Euphytica,2015,205(1):95-102.”公开。稻瘟病菌HN09-1C-7菌株在非专利文献“Dong et al.Fine mapping of Pi57(t)conferring broad spectrum resistance against Magnaporthe oryzae inintrogression line IL-E1454derived from Oryza longistaminata.PLOS ONE,2017,12(10):e0186201.Peng Xu et al.Identification and mapping of a novel blastresistance gene Pi57(t)in Oryza longistaminata.Euphytica.2015,205(1):95-102”公开，水稻渗入系IL-E1454和稻瘟病菌HN09-1C-7菌株申请人有保存，申请人可提供，申请人联系地址：云南省昆明市盘龙区北京路2238号，云南省农业科学院农业环境资源研究所，邮编：650205。
各实施例中所用的籼稻品种RD23，云粳26号，云粳29号，楚粳28号，楚粳37号，楚粳40号，凤稻23号，靖稻1号，丽粳14号，丽粳15号，岫粳18号，滇粳优1号以及所有试剂均可通过商业渠道购买。
实施例1稻瘟病菌接种及表型评价
稻瘟病菌HN09-1C-7菌株进行活化接种于燕麦培养基上，25℃下培养7～9d，待菌丝基本长满培养基后，用灭菌水洗去气生菌丝，在普通日光灯下连续光照培养3d进行产孢。之后，用蒸馏水洗下孢子并加入为0.02％的Tween-20制成孢子悬浮液用于喷雾接种，孢子悬浮液浓度调整到2×105个孢子/mL。
水稻种子在浸种催芽后，用镊子播于装有秧田土的塑料育苗盒内，在温室内育苗。2叶期开始追施尿素0.5g/盒，共2～3次(每次间隔5～7d施一次尿素)。用上述稻瘟病菌HN09-1C-7孢子悬浮液于3.5叶期进行喷雾接种，接种后的苗置于保湿培养箱(日本池田理化产)内黑暗状态下25℃保湿培养24h(相对湿度≥95％)。保湿培养后取出放在温室内，每天进行多次清水喷雾以保持温室的湿度，创造有利发病的条件。接种7～10d后进行稻瘟病发病情况调查。稻瘟病分级标准按6级进行划分(参考董丽英等,云南省稻瘟病菌群体对稻瘟病抗性单基因系的致病性分析,西南农业学报,2012,25(2)：467-473)，0级：无病斑；1级：褐点型病斑，直径≤1mm，不具产孢能力；2级：椭圆形病斑，1mm＜直径≤2mm，病斑周围具褐色边缘，中央灰白色，具产孢能力；3级：椭圆形病斑，2mm＜直径≤3mm，病斑周围具褐色边缘，中央灰白色，具产孢能力；4级：典型的梭形或纺锤形病斑，直径>3mm，病斑有融合或无融合；5级：病斑类型与4级相同，但由于病斑间融合，叶片上半部枯死。其中，0～2级归为抗病反应(R)，3～5级归为感病反应(S)。
实施例2水稻抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记引物设计
从水稻渗入系IL-E1454中克隆的稻瘟病抗性基因Pi57位于水稻第12染色体上，其物理距离在10.822540～10.833731Mb之间，以抗性基因Pi57的基因组系列为参考，设计扩增分子标记Pi57-InDel-1所用引物为Pi57-InDel-1FW引物(正向引物)和Pi57-InDel-1RV引物(反向引物)，Pi57-InDel-1FW引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，Pi57-InDel-1RV引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。设计扩增分子标记Pi57-InDel-2所用引物为Pi57-InDel-2FW引物(正向引物)和Pi57-InDel-2RV引物(反向引物)，Pi57-InDel-2FW引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，Pi57-InDel-2RV引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
上述两对引物对分别进行PCR均采用如下PCR扩增的反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM正向引物1μL、10μM反向引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。在PCR扩增前需要对PCR管中需加入一滴石蜡油，防止PCR反应体系中液体的蒸发。
以分子标记Pi57-InDel-1所用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min，PCR扩增产物放4℃保存。
以分子标记Pi57-InDel-2所用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min，PCR扩增产物放4℃保存。
分子标记Pi57-InDel-1所用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物进行PCR扩增的扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳，分子标记Pi57-InDel-1所用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物在水稻渗入系IL-E1454(抗病亲本)和籼稻品种RD23(感病亲本)中分别可以扩增出132bp、129bp条带，如图1所示，图1中编号1(水稻渗入系IL-E1454)的条带为132bp，编号2至编号13的条带均为129bp。如果是杂合单株就会同时扩增出132bp和129bp两条带，如图3所示。
分子标记Pi57-InDel-2所用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物进行PCR扩增的扩增产物在3％琼脂糖凝胶中水平电泳，分子标记Pi57-InDel-2所用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物在水稻渗入系IL-E1454(抗病亲本)和籼稻品种RD23(感病亲本)中分别可以扩增出143bp、185bp的条带，如图2所示，图2中编号1(水稻渗入系IL-E1454)的条带为143bp，编号2至编号13的条带均为185bp。如果是杂合单株就会同时扩增出143bp和185bp两条带，如图4所示。
实施例3本发明水稻抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记的验证实验
3.1表型验证：分别对水稻渗入系IL-E1454(抗病亲本)、籼稻品种RD23(感病亲本)及11个云南水稻主栽品种(云粳26号，云粳29号，楚粳28号，楚粳37号，楚粳40号，凤稻23号，靖稻1号，丽粳14号，丽粳15号，岫粳18号，滇粳优1号)浸种催芽后，在温室按顺序用镊子播于装有秧田土的6cm×18cm×10cm塑料育苗盒内，每行播种13粒，重复播种3行；当育苗盒的水稻长到3.5叶期时，用克隆抗稻瘟病基因Pi57的稻瘟病菌HN09-1C-7菌株接种水稻植株，7-10天后对其进行表型鉴定，具体稻瘟病菌株培养、接种、调查等与实例1相同；接种后，调查结束后显示：除抗病亲本水稻渗入系IL-E1454表现抗病外，籼稻品种RD23及11个水稻主栽品种(云粳26号，云粳29号，楚粳28号，楚粳37号，楚粳40号，凤稻23号，靖稻1号，丽粳14号，丽粳15号，岫粳18号，滇粳优1号)均表现为感病。
3.2PCR扩增验证：采用CTAB法按3.1表型验证中的调查顺序提取各水稻材料的水稻叶片DNA，分别用实例2中的两对引物对提取的水稻叶片DNA分别进行PCR扩增，扩增反应体系及条件同实例2。
分子标记Pi57-InDel-1所用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物进行PCR扩增的扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中垂直电泳后，采用硝酸银染色法进行DNA染色并进行观察，出现分子标记Pi57-InDel-1所用引物对扩增的条带(如图1所示)，图1中扩增子长度132bp片段是含有抗稻瘟病基因Pi57的抗病亲本水稻渗入系IL-E1454(图1中编号1)，而扩增子长度129bp片段的品种是籼稻品种RD23(图1中编号2)和11个云南水稻主栽品种(图1中编号3至编号13)(云粳26号，云粳29号，楚粳28号，楚粳37号，楚粳40号，凤稻23号，靖稻1号，丽粳14号，丽粳15号，岫粳18号，滇粳优1号)。
分子标记Pi57-InDel-2所用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物进行PCR扩增的扩增产物在含有核酸染料的3％琼脂糖凝胶中的电泳并进行观察，出现分子标记Pi57-InDel-2所用引物对扩增的条带(如图2所示)，图2中扩增子长度143bp片段是含有抗稻瘟病基因Pi57的抗病亲本水稻渗入系IL-E1454(图2中编号1)，而扩增子长度185bp片段的品种是籼稻品种RD23(图2中编号2)和11个云南水稻主栽品种(图2中编号3至编号13)(云粳26号，云粳29号，楚粳28号，楚粳37号，楚粳40号，凤稻23号，靖稻1号，丽粳14号，丽粳15号，岫粳18号，滇粳优1号)；而且抗病亲本水稻渗入系IL-E1454、籼稻品种RD23及11个云南水稻主栽品种(云粳26号，云粳29号，楚粳28号，楚粳37号，楚粳40号，凤稻23号，靖稻1号，丽粳14号，丽粳15号，岫粳18号，滇粳优1号)分别通过上述两个分子标记Pi57-InDel-1和分子标记Pi57-InDel-2所用的引物对进行PCR扩增分析结果与接种表型鉴定的结果一致，即含有抗稻瘟病基因Pi57的水稻渗入系IL-E1454的植株表现抗病，不含有抗稻瘟病基因Pi57的籼稻品种RD23及云粳26号等11个云南水稻主栽品种植株表现感病。
实施例4利用共分离分子标记在杂交后代中筛选携带Pi57基因的纯合个体
4.1表型验证：用所述的抗病亲本水稻渗入系IL-E1454，感病亲本籼稻品种RD23及抗病亲本水稻渗入系IL-E1454与感病亲本籼稻品种RD23杂交后自交的F2代群体的种子浸种催芽后，在温室分别用镊子播于装有秧田土的12cm×18cm×5cm塑料育苗盒内(编号1为抗病亲本水稻渗入系IL-E1454，编号2为感病亲本籼稻品种RD23，后面编号为随机播种的F2种子)，每行播种10粒，共播种5行；待育苗盒内的水稻长到3.5叶期时，用稻瘟病菌HN09-1C-7菌株接种育苗盒内水稻植株，7-10天后进行表型鉴定，具体稻瘟病菌株培养、接种、调查与实例1相同。按顺序对编号1-20的水稻植株进行表型调查(其中编号1为抗病亲本水稻渗入系IL-E1454，编号2为感病亲本籼稻品种RD23、编号3-20为随机播种的F2代群体)，调查结果显示：编号为2、8、9、11、12和20的水稻植株表现为感病，其余水稻植株鉴定表现为抗病。
4.2PCR扩增验证：同时对4.1表型验证中编号为1-20的水稻植株采用CTAB法提取这20株水稻植株的DNA，分别利用实例2中的两对引物对提取的水稻DNA进行PCR扩增(扩增反应体系及条件同实例2)，PCR扩增产物分别在8％聚丙烯酰胺凝胶或3％琼脂糖凝胶中电泳后，分别出现分子标记Pi57-InDel-1所用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物扩增的条带(如图3所示)和分子标记Pi57-InDel-2所用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物扩增的条带(如图4所示)。
图3中：编号1、4、10、15、18的条带为132bp，编号2、8、9、11、12、20的条带长度均为129bp，编号3、5、6、7、13、14、16、17、19均出现两条条带，其两条条带长度分别为132bp、129bp。
图4中：编号1、4、10、15、18的条带为143bp，编号2、8、9、11、12、20的条带长度均为185bp，编号3、5、6、7、13、14、16、17、19均出现两条条带，其两条条带长度分别为143bp、185bp。
接种鉴定及基因扩增的结果表明：
图3中F2代分离群体中扩增子为1条长度132bp片段的纯合个体及扩增子为2条长度为129bp和132bp片段的杂合个体均对稻瘟病抗病，F2代分离群体中扩增子为1条长度129bp片段的纯合个体均对稻瘟病感病；
图4中F2代分离群体中扩增子为1条长度143bp片段的纯合个体以及扩增子为2条长度为143bp和185bp片段的杂合个体均对稻瘟病抗病；F2代分离群体中扩增子为1条长度185bp片段的纯合个体均对稻瘟病感病。
结果表明：含有抗稻瘟病基因Pi57的水稻渗入系IL-E1454及其杂合个体表现抗病，不含有抗稻瘟病基因Pi57的植株表现感病。
结论：与抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1和分子标记Pi57-InDel-2，可以作为检测水稻品种或水稻材料中抗稻瘟病基因Pi57是否存在的标记，可有效预测水稻材料对稻瘟病的抗性，可以准确、高效地用于杂交后代中携带抗稻瘟病基因Pi57纯合个体的筛选，不仅节约生产成本、准确度高、不受环境影响，而且大大提高了选择效率，加速了育种进程。
序列表
<110> 云南省农业科学院农业环境资源研究所
<120> 水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> DNA
<213> 水稻渗入系IL-E1454(Oryza sativa)
<400> 1
tcaggtgcac ggattcttga cacactcatc aagtttaata gggatgctga tgcatcgggg 60
agcgaattcc cggggcagag tatgcagatt tacaatatga ttggatccgc aacctccagt 120
cccatactcc ac 132
<210> 2
<211> 143
<212> DNA
<213> 水稻渗入系IL-E1454( Oryza sativa)
<400> 2
tcttccttgc ttgaactcga gcagaaatta tttcaggatt cttctgaaga agaggatgat 60
caccagattt ctgtcaaaga aaaggattat taccccaaag actatgaaca gatgcaactt 120
ataggcatgc agatcctttt aaa 143
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaggtgcac ggattcttga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggagtatg ggactggagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcttccttgc ttgaactcga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttaaaagga tctgcatgcc 20

Claims (10)

1.一种水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1，其特征在于，所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1的片段长度为132bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
2.一种水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2，其特征在于，所述水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2的片段长度为143bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求要求1所述的水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
4.权利要求要求2所述的水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
5.用于扩增权利要求1所述的水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-1的引物对，其特征在于，所述引物对为Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物，所述Pi57-InDel-1FW引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，Pi57-InDel-1RV引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
6.用于扩增权利要求2所述的水稻广谱抗稻瘟病基因Pi57的共分离分子标记Pi57-InDel-2的引物对，其特征在于，所述引物对为Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物，所述Pi57-InDel-2FW引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，Pi57-InDel-2RV引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
7.权利要求5所述的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
8.权利要求6所述的引物对在水稻抗稻瘟病育种中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，
(1)当用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出132bp的片段，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出129bp的片段，则目标水稻材料不含有抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中同时扩增出132bp和129bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi57位点的杂合水稻材料；
或(2)用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出143bp的片段，则目标水稻材料含有抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中扩增出185bp的片段，则目标水稻材料不含有抗稻瘟病基因Pi57位点；用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物通过PCR扩增目标水稻材料，目标水稻材料中同时扩增出143bp和185bp两个片段，则目标水稻材料为含有抗稻瘟病基因Pi57位点的杂合水稻材料。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
用Pi57-InDel-1FW引物和Pi57-InDel-1RV引物的PCR扩增反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM Pi57-InDel-1FW引物1μL、10μM Pi57-InDel-1RV引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min；
用Pi57-InDel-2FW引物和Pi57-InDel-2RV引物的PCR扩增反应体系20μL，其中含有2×ES Taq Master Mix 10μL、10μM Pi57-InDel-2FW引物1μL、10μM Pi57-InDel-2RV引物1μL、10ng/μL模板DNA 1μL，ddH2O 7μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；最终72℃延伸5min。
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