CN103796508A - 具有有用性状的植物和相关方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过瞬时抑制植物的MSH1基因获得呈现出有用性状的植物的方法。还提供了用于鉴定植物中提供有用性状的遗传基因座的方法以及用那些基因座产生的植物。此外，提供了呈现出有用性状的植物、包括种子的植物部分和植物产品，以及使用所述植物的方法。

Description

具有有用性状的植物和相关方法

相关申请的交叉参考

依据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2011年9月28日提交的U.S.临时申请No.61/540236的权益（按引用将其全部并入本文中）和2011年5月2日提交的U.S.临时申请No.61/481519的权益（按引用将其全部并入本文中）。

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关于联邦政府资助研究或开发的声明

依据能源部（DE-FG02-07ER15564和DE-FG02-10ER16189）和国家科学基金（IOS0820668和IOS1126935）的授权，通过政府支持完成了本发明。政府对本发明具有特定的权利。

发明背景

MSH1基因表示陆生植物内的基因结构中经历了至少两个重要变化的MutS同源物（Abdelnoor等，2003）。MutS是参与错配修复和抑制同源重组的原核基因。与直接的蛋白-DNA相互作用模型一致，MSH1不仅编码DNA结合结构域（结构域I）和ATP酶结构域（结构域V），而且在其进化早期经历了基因融合以获取羧基端GIY-YIG型核酸内切酶结构域（结构域VI）（Abdelnoor等，2006）。该蛋白质也已经获得了结构域II、III和IV，显示为在所有陆生植物中是非常保守的。这种基因结构的复杂性表明MSH1已经在植物中获得了新的功能。尽管在真核生物世系中鉴定了众多MutS同源物，但没有发现陆生植物以外的基因展示出MSH1的不寻常特征。

已经使用MSH1无效（EMS和T-DNA插入）突变体（即，msh1突变体）通过MSH1RNAi抑制在拟南芥属（Arabidopsis）中和在其他植物物种中研究了MSH1功能（Sandhu等，2007；Xu等，2011）。从这些研究显露的是RNAi抑制的表型结果在物种之间是非常相似的，包括叶杂色性、细胞质雄性不育（CMS）、降低的生长速率表型、延迟开花或不开花表型和增强的对病原体的易感性。暴露于热（Shedge等，2010）、高光应激（Xu等，2011）和其他环境应激条件（Hruz等，2008）导致显著降低的MSH1转录产物水平。

最初的MSH1研究表明了其对植物线粒体基因组稳定性的直接影响。拟南芥属中的无效msh1突变体在47个线粒体重复片段处呈现出增强的重组活性，其经过多代形成了显著的基因组重排。MSH1破坏的基因组结果是亚化学计量转移(substoichiometric shifting)（SSS）过程（Arrieta-Montiel等，2009）。SSS活性产生了线粒体基因组的部分的相对拷贝数的剧烈变化，引起存在于受影响的亚基因组上的基因的选择性扩增或抑制。对于这些基因组变化存在表型后果；SSS过程参与细胞质雄性不育的表达（Sandhu等，2007）以及其在自然群体中自发回复成可育的（Janska等，1998；Bellaoui等，1998；Davila等，2011；Mackenzie，2011）。实际上，作为植物中的繁殖策略，MSH1可以在雌全异体(gynodioecy)的演化中起作用（McCauley和Olson，2008）。

在克隆和鉴定为MutS同源物之前，MSH1基因首先被G.Redei命名为叶绿体突变基因（CHM），因为其突变导致似乎由叶绿体功能障碍引起的杂色性和改变的生长（Redei1973）。实际上，MSH1编码双重靶向的蛋白质。MSH1-GFP转基因融合蛋白定位在线粒体和质体类核中（Xu等，2011）。类核是小的、致密的蛋白质-RNA-DNA复合物，其包封细胞器（organellar）基因组。然而，与线粒体不同，在重组普遍的情况中，在msh1突变体中没有观察到增强的叶绿体重复片段介导的重组的证据。可能MSH1破坏影响了质体基因组的复制特征。

总之，上述参考文献中已经公开的MSH1抑制的效应限于对植物线粒体和质体的作用。

在植物和动物中，存在支持环境感知和表观遗传改变之间的关联的证据（Bonasio等，Science330，612，2010）。这些改变的跨世代（trans-generational）遗传性仍然是活跃研究的主题（Youngson等，Annu.Rev.Genom.Human Genet.9，233，2008）。之前的研究已经显示出改变的甲基化模式在多个世代中是高度可遗传的，并且可以结合到变异的定量分析中（Vaughn等，2007；Zhang等，2008；Johannes等，2009）。较早在拟南芥属中的甲基化变化的研究表明了表观基因组（epigenome）对轮回选择的顺应性，并且还表明了建立新的和稳定的表观遗传状态是可行的（F.Johannes等，PLoS Genet.5，e1000530（2009）；F.Roux等，Genetics188，1015（2011））。拟南芥met1和ddmt突变体的操纵已经允许形成epi-RIL群，其显示出新的甲基化模式化的遗传性和表观等位基因分离（epiallelic segregation），强调了植物适应中表观基因组变异的可能影响（F.Roux等，Genetics188，1015（2011））。在自然群体中，发现在拟南芥中检测到的大部分的表观等位基因变异是基因组的基因富集区内的CpG甲基化（C.Becker等，Nature480，245（2011），R.J.Schmitz等，Science334，369（2011））。

发明概述

本文中提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法、用于鉴定植物中可以赋予有用性状的一个或多个改变的染色体位点的方法、用于获得包含可以赋予有用性状的改变的染色体位点的植物的方法、呈现出有用性状的植物、那些植物的部分（包括细胞、叶、茎、花和种子）、使用所述植物和植物部分的方法以及那些植物和植物部分的产品，包括加工的产品如饲料或膳食。

在特定的实施方案中，提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法，其包括步骤：a）抑制第一亲本植物或植物细胞中一个或多个MSH1基因的表达；b）将步骤（a）的亲本植物、步骤（a）的亲本植物的后代、获自步骤（a）的植物细胞的植物或获自步骤（a）的植物细胞的植物的后代与其中MSH1未受抑制的第二植物异型杂交；c）针对至少一种有用的性状筛选获自步骤（b）的异型杂交的后代植物群体，其中所述后代植物群体的一部分表达MSH1；和d）选择表达MSH1的包含所述性状的后代植物，其中该性状是可遗传的和可逆的。在这些方法的特定实施方案中，所述性状与一个或多个改变的染色体位点相关。在特定的实施方案中，这样的改变的染色体位点可以包含甲基化的位点。在特定的实施方案中，提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法，其包括步骤：a）抑制第一亲本植物或植物细胞中一个或多个MSH1基因的表达；b）将步骤（a）的亲本植物、步骤（a）的亲本植物的后代、获自步骤（a）的植物细胞的植物或获自步骤（a）的植物细胞的植物的后代与其中MSH1未受抑制的第二植物异型杂交；c）针对至少一种有用的性状筛选获自步骤（b）的异型杂交的后代植物群体，其中后代植物群体的一部分表达MSH1；和d）选择表达MSH1的包含所述性状的后代植物，其中该性状与一个或多个突变的染色体位点相关。在特定的实施方案中，突变的染色体位点包含核苷酸倒位、插入、删除、置换或其组合。在特定的实施方案中，染色体位点包含可逆的突变。在特定的实施方案中，染色体位点包含不可逆的突变。在前述任一方法的特定实施方案中，所述方法进一步包括从以下植物产生种子的步骤：i）步骤（d）的自交后代植物，ii）步骤（d）的异型杂交的后代植物，或iii）来自步骤（d）的自交和异型杂交的后代植物两者。在特定的实施方案中，所述方法可以进一步包括分析种子或从种子生长的植物中所述性状的存在的步骤。在前述任一方法的特定实施方案中，第一亲本植物或植物细胞包含可以抑制MSH1表达的转基因。在所述方法的特定实施方案中，转基因选自通过产生小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA抑制MSH1表达的转基因的组。在前述任一方法的特定实施方案中，可以通过将雌性植物与不同的雄性植物杂交来获得第一亲本植物或植物细胞，其中雌性或雄性植物中的至少一个包含抑制亲本植物的内源性MSH1基因表达的转基因，并且其中植物在引入转基因之前是等基因近交系。在前述任一方法的特定实施方案中，在第一亲本植物或植物细胞中的MSH1抑制之前，第一亲本植物或植物细胞与第二亲本植物是等基因的。在前述任一方法的特定实施方案中，性状选自产量、雄性不育、不开花、对生物应激的抗性和对非生物应激的抗性。在特定的实施方案中，非生物应激可以选自干旱胁迫、渗透应激、氮应激、磷应激、矿物质应激、热应激、冷应激和/或光应激。在特定的实施方案中，对非生物应激的抗性可以包括耐旱性、耐高光性、耐热性、耐冷性和耐盐性。在所述方法的特定实施方案中，生物应激可以选自植物真菌病原体、植物细菌病原体、植物病毒病原体、昆虫、线虫和食草动物及其任意组合。在前述任一方法的特定实施方案中，性状不是由后代植物的线粒体中的亚化学计量转移（SSS）引起的。在前述任一方法的特定实施方案中，性状是雄性不育，并且不是由于后代植物的线粒体中的亚化学计量转移（SSS）引起的。在前述任一方法的特定实施方案中，与未发生MSH1表达抑制但其他方面与第一亲本植物或植物细胞亲本植物等基因的植物相比，步骤（d）中的后代植物或其后代呈现出性状的提高。在前述任一方法的特定实施方案中，植物是作物植物。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自棉花、加拿大油菜(canola)、小麦、大麦、亚麻、燕麦、黑麦、草皮草（turf grass）、甘蔗、苜蓿、香蕉、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、棉花、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、烟草、麻风树属（Jatropha）、亚麻荠属（Camelina）和龙舌兰属（Agave）。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、小麦、水稻、西红柿、烟草、粟和高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱，并且所述性状选自穗长、穗重、干生物量及其组合。

本文中还提供了呈现出由MSH1抑制导致的染色体位点中的改变和/或突变引起的有用性状的植物、植物部分（包括种子）或者植物或种子的产品。在特定的实施方案中，与没有发生MSH1表达抑制但其他方面与第一亲本植物或植物细胞等基因的植物、植物部分（包括种子）或者植物或种子的产品相比，呈现出由MSH1抑制导致的染色体位点中的改变和/或突变引起的有用性状的植物种子或其产品呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，呈现出由MSH1抑制导致的染色体位点中的改变和/或突变引起的有用性状的本发明这些植物、种子或产品可以包含由MSH1抑制诱导的一个或多个染色体位点中的一个或多个改变和/或突变。在特定的实施方案中，提供了通过前述任一方法产生的植物或作物植物，其中与未发生MSH1表达抑制但其他方面与第一亲本植物或植物细胞等基因的植物相比，作物植物呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，上述植物或作物植物中的任一种是近交的，并且与一个或多个亲本植物相比，呈现出至少一种有用性状的改善。本文中还提供了获自上述植物或作物植物中的任一种的种子。本文中还提供了来自上述任一植物、作物植物或种子的加工产品，其中所述产品包含可检测量的染色体DNA、线粒体DNA、质体DNA、质体和线粒体DNA或其任意组合。在特定的实施方案中，所述产品可以包含可检测量的包含MSH1抑制诱导的一个或多个染色体位点中的一个或多个改变/或突变的染色体DNA。在上述任一加工产品的特定实施方案中，产品可以是油、粗粉、棉绒（lint）、外壳或滤饼。

本文中还提供了用于产生种子的方法，其包括从本发明的上述任何植物或作物植物收获种子。在特定的实施方案中，提供了用于产生一批种子的方法，包括将本发明的植物或作物植物群体自交，种植自交的植物，并从其收获种子的步骤。在特定的实施方案中，收获的种子或从其获得的植物呈现出至少一种有用性状的改善。

本文中还提供了使用包含任一种改善性状的本发明的上述任一植物或作物植物的方法，其中所述方法包括种植、繁殖或栽培呈现出改善的性状的本发明的植物或作物植物。还提供了获得提高的产量的方法，包括收获本发明上述任一植物或作物植物的任何植物部分，包括种子。在特定的实施方案中，收获的种子或从其获得的植物呈现出至少一种有用性状的改善。

在特定的实施方案中，提供了用于鉴定植物中可以赋予有用性状的一个或多个改变的染色体位点的方法。在一个实施方案中，提供了包括以下步骤的方法：a.将没有呈现出有用性状的参照植物中的一个或多个染色体区域与呈现出有用性状的测试植物中的一个或多个相应染色体区域相比较，其中测试植物表达MSH1并且获自其中MSH1已经抑制的亲本植物或植物细胞；和b.选择参照植物中不存在的而存在于测试植物中的并且与有用性状相关的一个或多个改变的染色体位点。在特定的实施方案中，改变的染色体位点包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任何组合。在特定的实施方案中，所述选择包括分离包含改变的染色体位点的植物或后代植物或者获得与改变的染色体位点相关的核酸。在特定的实施方案中，参照植物和测试植物都是获自从其中MSH1已经抑制的亲本植物或植物细胞获得的后代植物群体。在特定的实施方案中，在亲本植物或植物细胞中的MSH1抑制之前，参照植物和亲本植物或植物细胞是等基因的。在特定的实施方案中，有用的性状选自产量、雄性不育、不开花、生物应激抗性和非生物应激抗性。在特定的实施方案中，非生物应激可以选自干旱应激、渗透应激、氮应激、磷应激、矿物质应激、热应激、冷应激和/或光应激。在特定的实施方案中，对非生物应激的抗性可以包括耐旱性、耐高光性、耐热性、耐冷性和耐盐性。在所述方法的特定的实施方案中，生物应激抗性可以选自植物真菌病原体抗性、植物细菌病原体抗性、植物病毒病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性和食草动物抗性及其任何组合。在特定的实施方案中，有用的性状选自增强的抗倒伏性、提高的生长速率、提高的生物量、增强的分蘖、增强的分枝、延迟的开花时间和延迟的衰老。本文中还提供了通过前述任一方法鉴定的改变的染色体位点。这样的改变的染色体位点包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合。

本文中还提供了包含通过前述任一方法鉴定的任何改变的染色体位点的植物。

本文中还提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法。在特定的实施方案中，这些方法可以包括步骤：a.将与有用性状相关的染色体修饰引入植物中，其中染色体修饰包括与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变；和b.选择包含该染色体修饰并呈现出有用性状的植物。在特定的实施方案中，该方法可以进一步包括从以下植物产生种子的步骤：i）步骤（b）的选定植物的自交后代植物，ii）步骤（b）的选定植物的异型杂交后代植物，或iii）来自步骤（b）的选定植物的自交和异型杂交后代植物两者。在该方法的特定实施方案中，染色体修饰可以包含改变的染色体位点，并且通过分析与改变的染色体位点相关的染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合的存在来选择植物。在特定的实施方案中，染色体修饰包含转基因或染色体突变，并且通过分析转基因或染色体突变的存在来选择植物。在其他实施方案中，通过分析有用性状的存在来选择植物。在特定的实施方案中，染色体修饰包含改变的染色体位点，并且改变的染色体位点包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合。在特定的实施方案中，改变的染色体位点具有包含基因表达降低的遗传效应，并且染色体修饰包含提供基因表达降低的转基因或染色体突变。在其中改变的染色体位点具有包含基因表达降低的遗传效应且染色体修饰包含转基因的特定实施方案中，该转基因通过产生针对该基因的小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA来降低基因的表达。在特定的实施方案中，改变的染色体位点具有包含基因表达提高的遗传效应，并且染色体修饰包含提供基因表达提高的转基因或染色体突变。在前述任一方法的特定实施方案中，有用性状选自产量、雄性不育、不开花、生物应激抗性和非生物应激抗性。在特定的实施方案中，非生物应激可以选自干旱应激、渗透应激、氮应激、磷应激、矿物质应激、热应激、冷应激和/或光应激。在特定的实施方案中，对非生物应激的抗性可以包括耐旱性、耐高光性、耐热性、耐冷性和耐盐性。在该方法的特定实施方案中，生物应激可以选自植物真菌病原体、植物细菌病原体、植物病毒病原体、昆虫、线虫和食草动物及其任何组合。在该方法的特定实施方案中，有用性状选自增强的抗倒伏性、提高的生长速率、提高的生物量、增强的分蘖、增强的分枝、延迟的开花时间和延迟的衰老。本文中还提供了通过前述任一方法产生的植物。在前述任一方法的特定实施方案中，植物是作物植物。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自棉花、加拿大油菜、小麦、大麦、亚麻、燕麦、黑麦、草坪草、甘蔗、苜蓿、香蕉、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、棉花、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、烟草、麻风树属、亚麻荠属和龙舌兰属。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、小麦、水稻、西红柿、烟草、粟和高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱，并且所述性状选自穗长、穗重、干生物量及其组合。

本文中还提供了包含与有用性状相关的染色体修饰或与有用性状相关的染色体改变的植物，植物部分（包括但不限于，种子、叶、茎、根和花）或者植物或植物部分的产品（包括但不限于，种子）。在特定的实施方案中，植物部分可以包含非再生的植物部分或植物部分的非再生部分。在特定的实施方案中，产品可以是加工的产品，其包括，但不限于，获自植物部分的饲料或膳食。在特定的实施方案中，与不包含染色体修饰的植物、植物部分（包括种子）或者植物或种子的产品相比，呈现出由染色体修饰引起的有用性状的植物种子或其产品呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，这样的呈现出有用性状的植物、种子或产品可以包含染色体修饰，其包含与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变。在特定的实施方案中，这样的呈现出有用性状的植物、植物部分、种子或产品可以包含改变的染色体位点，其包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合。在特定的实施方案中，包含染色体DNA甲基化状态的改变的染色体位点可以包含在未发生MSH1抑制的植物、植物部分或植物产品中未发现的改变的染色体位点的区别部分。在特定的实施方案中，改变的染色体位点的区别部分可以包含至少约25个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、500个核苷酸或更多个核苷酸的甲基化DNA分子。在特定的实施方案中，提供了通过前述任一方法产生的植物、植物细胞或植物产品，其中与不包含染色体改变但其他方面与第一亲本植物或植物细胞等基因的植物相比，该植物呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，上述任何植物是近交的，并且与一个或多个亲本植物相比，呈现出至少一种有用性状的改善。本文中还提供了从上述任何植物、植物细胞或作物植物获得的种子。本文中还提供了来自上述任何植物、作物植物或植物部分（包括，但不限于种子）的加工产品，其中产品包含可检测量的包含上述任何染色体修饰的染色体DNA，所述染色体修饰包括但不限于，改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变。在上述任一加工产品的特定实施方案中，产品可以是油、粗粉、棉绒、外壳或滤饼。

本文中还提供了用于产生种子的方法，包括从本发明上述任一植物或作物植物收获种子。在特定的实施方案中，提供了用于产生一批种子的方法，其包括如下步骤：将本发明的植物或作物植物群体自交、生长自交的植物和从其收获种子。

本文中还提供了使用包含任一改善的性状的本发明的上述任一植物或作物植物的方法，其中所述方法包括生长、繁殖或栽培呈现出改善的性状的本发明的植物或作物植物。还提供了获得提高产量的方法，包括收获本发明上述任一植物或作物植物的任何植物部分，包括种子。

本文中还提供了任一植物、植物部分或其部分（包括但不限于植物细胞）、非再生的植物部分或其部分（包括但不限于植物细胞）或加工的植物产品在任何方法中的用途。其中本文中提供的植物、植物部分或其部分、非再生植物部分或其部分或加工的植物产品可以采用的方法包括，但不限于，用于育种、用作生物燃料、用作动物饲料、用于人类食品中，以及用于任何工业、食品或饲料制造方法中。

本文中还提供了呈现出有用性状的种子，和获自呈现出有用性状的改善的种子的植物。在特定的实施方案中，种子可以包含与一个或多个有用性状相关或产生该有用性状的改变的染色体位点。

在特定的实施方案中，本文中提供的植物、植物部分、非再生的植物部分、植物细胞、非再生的植物细胞、植物产品或加工的植物产品可以包含可检测量的染色体DNA，其包含与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变。在特定的实施方案中，包含染色体DNA甲基化状态的改变的染色体位点可以包含在未发生MSH1抑制的植物、植物细胞、非再生植物细胞、植物部分、非再生植物部分、植物产品或加工的植物产品中未发现的改变的染色体位点的区别部分。在特定的实施方案中，改变的染色体位点的区别部分可以包含至少约25个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、500个核苷酸或更多个核苷酸的甲基化DNA分子。本文中提供的包含染色体DNA或其区别部分的加工产品包括，但不限于，包含油、粗粉、棉绒、外壳或滤饼的产品。

附图简述

说明书中结合的并且形成说明书一部分的附图说明了本发明的特定实施方案。在附图中：

图1说明了发生MSH1抑制的各种植物中观察到的各种表型，如细胞质雄性不育、杂色性和改变的叶绿体发育、降低的生长速率和矮化病、改变的开花时间或不开花、降低的类黄酮生物合成和缺乏花青素、增强的病原体易感性、改变的叶形态和高光耐受性。

图2说明了已经发生MSH1抑制的拟南芥（上图）、西红柿（中图）和高粱（下图）植物中的叶杂色性。

图3说明了已经发生了MSH1抑制的高粱（上图）和西红柿（下图）植物中的矮化。

图4说明了已经发生了MSH1抑制的拟南芥中的线粒体DNA重排。

图5说明了发生了MSH1抑制的西红柿、烟草和粟植物中观察到的反应性氧物质（ROS）的增加。

图6说明了用于获得呈现出作为发生MSH1抑制的结果的本文中称为“离散变异”（VD）的各种类型的可遗传表型变异的植物和用于获得可以呈现出“数量变异”或“VQ”和各种有用性状的植物系的示例性的和非限制性的方案。

图7说明了相对于未发生MSH1抑制的其他方面等基因亲本植物（Col-0）呈现出生物量提高的拟南芥植物系（msh1×Col-0F₃）。

图8说明了源自其中MSH1表达受抑制的植物的异型杂交的不同高粱系GAII-11（方形）、GA11-15（三角形）、GAII-22（相对括号）、GAII-24和GAII-28（圆形）中获得的植物高度（以cM计）的分布。野生型参照系是fx WT（菱形）。

图9说明了源自其中MSH1表达受抑制的植物的异型杂交的不同高粱系GAII-11（方形）、GA11-15（三角形）、GAII-22（相对括号）、GAII-24和GAII-28（圆形）中获得的穗重（以克计）的分布。野生型参照系是fx WT（菱形）。

图10说明了源自其中MSH1表达受抑制的植物的异型杂交的不同高粱系GAII-11（方形）、GA11-15（三角形）、GAII-22（相对括号）、GAII-24和GAII-28（圆形）中获得的粒产量（以克计）的分布。野生型参照系是fx WT（菱形）。

图11A-H说明了拟南芥和高粱中MSH1-epi系的增强生长的表型。显示了用于得到高粱和拟南芥epi-群的转基因和杂交程序。（A）源自杂交Tx430x MSH1-dr的F1后代的表型。（B）田间生长的epiF2、F3和F4高粱系显示出植物结构和高度的变异。（C）来自Tx430（左，66gm，8mm茎）相对于epi-F2个体（右，112gm，11mm茎）的穗。（D）来自C中所示的穗的种子产量。（E）田间条件下的MSH1-dr高粱表型。（F）拟南芥的epi-F4系中增强的莲座丛生长的证据。（G）相对于Col-0，显示出提高的植物生物量、莲座丛直径和花茎直径的拟南芥epi-F4植物。数据显示为来自>6的平均值±SE。（H）开花时的拟南芥epiF4表型。

图12说明了高粱MSH1-epiF2系中增强的表型变异。对于两个田间定植中生长的三个独立高粱epiF2群体的植物高度和粒产量显示表型分布。通过垂直虚线显示群体平均值。

图13A、B说明了高粱MSH1-epiF2、F3和F4系中的表型变异。（A）对于植物高度和每穗的粒产量选择的MSH1-epiF4系。对于植物高度，为低植物高度选择系4b-10、10.3和3a.2，为高植物高度选择所有其他系。对于粒产量，为低产量选择了系15.2，为高产量选择所有其他系。（B）框图显示对四个独立群体选择的单个群体反应。水平虚线表示Tx430野生型的平均值。在粒产量的情况中，在温室中进行F3选择。

图14A-E说明了拟南芥中的MSH1-epi增强生长与叶绿体效应有关。（A）线粒体半-补充系AOX-MSH1x Col-0F1；（B）质体-补充的SSU-MSH1x Col-0F2表现为与Col-0野生型相同，（C）SSU-MSH1-衍生的F2系相对于Col-0的莲座丛直径和新鲜生物量；（D）显示出增强生长的线粒体补充的AOX-MSH1x Col-0F2；（E）AOX-MSH1-衍生的F2系的莲座丛直径和新鲜生物量显著高于Col-0（P<0.05）。（F）A0X-MSH1x Col-0的F4代中增强的生长表型。

图15A-C说明了拟南芥Col-0野生型和MSH1-epiF3系中的全基因组5-甲基-胞嘧啶分布。（A）CG、CHG和CHH甲基化相对于基因组的差异和非差异甲基化的相对分布。注意到基因间区域在条的顶部，接下来的顺序是TE基因、假基因、ncRNA、3’-UTR、5’-UTR、内含子和CDS。（B）CG-DMP和CG-N-DMP沿各染色体的分布，与Becker等，Nature480，245（2011）所用的分析程序平行，数据针对各染色体的最高值标准化。（C）Col-0甲基化分析取自Becker等（同上）的图1c以证明NDMP分布的相似性和DMP的不相似性。

图16说明了从msh1叶绿体半补率系x Col-0野生型的杂交获得的拟南芥F1植物。转基因介导的msh1叶绿体半补充恢复了野生型表型。然而，这些半补充系与Col-0的杂交导致F1中大约25%的植物呈现出不同强度的叶卷缩。这种表型的原因还是未知的，但在衍生的F2群中不再可见。

图17说明了拟南芥Col-0、epiF4和epiF5系中开花时间的分布。基于最少50株将各个分布绘图。

图18A、B、C使用重亚硫酸盐测序说明了拟南芥系col-0和msh1-epif3之间的差异甲基化区域的验证。AT3G27150内的DMR区域（MIR2111-5p的靶基因）的比对。预测突出显示的G（即，图中加下划线的）在Col-0中是未甲基化的，和在MSH1-epiF3中是甲基化的。序列表中提供了图18A、B和C的序列如下：AT3G27150(SEQ ID NO:27),Col0-MIR2-2(SEQ ID NO:28),Col0-MIR2-3(SEQ ID NO:29),Col0-MIR2-4(SEQ ID NO:30),Col0-MIR2-5(SEQ ID NO:31),Col0-MIR2-6(SEQ ID NO:32),Col0-MIR2-10(SEQ ID NO:33),Col0-MIR2-11(SEQ ID NO:34),Col0-MIR2-12(SEQ ID NO:35),Col0-MIR2-26(SEQ ID NO:36),Col0-MIR2-27(SEQ ID NO:37),Col0-MIR2-28(SEQ ID NO:38),Col0-MIR2-29(SEQ ID NO:39),F3-Mir2-1(SEQ ID NO:40),F3-Mir2-2(SEQ ID NO:41),F3-Mir2-4(SEQID NO:42),F3-Mir2-5(SEQ ID NO:43),F3-Mir2-7(SEQ ID NO:44),F3-Mir2-11(SEQ ID NO:45),F3-Mir2-12(SEQ ID NO:46),F3-Mir2-15(SEQ ID NO:47),F3-Mir2-16(SEQ ID NO:48),F3-Mir2-27(SEQ ID NO:49)和F3-Mir2-28(SEQ ID NO:50)。

详细说明

I.定义

如本文中所用的，短语“染色体修饰”指的是以下的任一种：a）“多个改变的染色体位点”和“改变的染色体位点”；b）“多个突变的染色体位点”、“突变的染色体位点”、“多个染色体突变”和“染色体突变”；或c）转基因。

如本文中所用的，短语“多个改变的染色体位点”（复数）或“改变的染色体位点”（单数）指的是相对于相应的亲本染色体位点已经发生了可遗传和可逆的表观遗传变化的染色体的部分。在改变的染色体位点中的可遗传和可逆的遗传变化包括，但不限于，染色体DNA的甲基化，并且特别地，胞嘧啶残基甲基化成5-甲基胞嘧啶残基，和/或组蛋白的翻译后修饰，并且特别地，包括，但不限于，乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化和SUMO化（sumoylation）（小泛素样修饰蛋白的共价连接）的组蛋白修饰。如本文中所用的，“染色体位点”指的是位于细胞核中的染色体中的位点。

如本文中所用的，术语“包含”意思是“包括但不限于”。

如本文中所用的，短语“多个突变的染色体位点”（复数）（复数），“突变的染色体位点”（单数）、“多个染色体突变”和“染色体突变”指的是相对于相应亲本染色体位点中的核苷酸序列已经发生了核苷酸序列的可遗传的遗传改变的染色体的部分。突变的染色体位点包含，包括但不限于，核苷酸序列倒位、插入、删除、置换或其组合的突变。在特定的实施方案中，突变的染色体位点可以包含可逆的突变。在这种情况中，染色体中的可逆突变可以包括，但不限于，转座因子的插入、缺失的转座因子和特定的倒位。在特定的实施方案中，染色体位点包含不可逆的突变。在这种情况中，染色体中的不可逆突变可以包括，但不限于，删除。

如本文中所用的，术语“离散变异”或“VD”指的是明显不同的、可遗传的表型变异，其包括以任意组合或分离地可观察到的雄性不育、矮化、杂色性和/或延迟的开花时间的性状。

如本文中所用的，术语“MSH-dr”指的是发生MSH1抑制的植物中观察到的植物分蘖、高度、节间伸长和气孔密度的变化。

如本文中所用的，短语“数量变异”或“VQ”指的是源自其中MSH1表达受抑制并且呈现出与其他植物的离散变异的植物的异型杂交的单个后代系中观察到的表型变异。

如本文中所用的，术语“微RNA”或“miRNA”指的是与植物中发生的天然miRNA以及与人工miRNA基本上相似的miRNA两者。在特定的实施方案中，转基因可以用于产生与植物中发生的天然miRNA或人工miRNA基本上相似的miRNA。

如本文中所用的，短语“获得与改变的染色体位点相关的核酸”指的是用于从未改变的共价连接的核酸物理分离或富集与改变的染色体位点相关的核酸的任何方法。在这种情况中，核酸不必定包含改变（即，如甲基化），但至少包含一个或多个改变的核苷酸碱基。因此，与改变的染色体位点相关的核酸可以通过如下方法获得，包括但不限于，分子克隆、PCR或基于序列数据的直接合成。

如本文中所用的短语“可操作地连接”指的是核酸序列的接合，以使得一个序列可以提供与连接的序列所需的功能。在启动子的情况中，“可操作地连接”意思是启动子与目标序列连接以使得该目标序列的转录受该启动子控制和调节。当目标序列编码蛋白时和当该蛋白的表达是所需的时候，“可操作地连接”意思是启动子以所得到的转录产物将有效翻译的方式连接该序列。如果启动子与编码序列的连接是转录融合且编码蛋白的表达是所需的，进行连接以使得所得到的转录产物中的第一个翻译启动密码子是编码序列的启动密码子。或者，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合且编码蛋白的表达是所需的，则进行连接以使得与启动子相关的5’未翻译序列中所含的第一个翻译启动密码子的连接使得所得到的翻译产物与编码所需蛋白的翻译开放阅读框同框。可以可操作地连接的核酸序列包括，但不限于，提供基因表达功能的序列（即，基因表达元件，如启动子、5’未翻译区、内含子、蛋白编码区、3’未翻译区、多腺苷酸化位点和/或转录终止子）、提供DNA转移和/或整合功能的序列（即，位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点）、提供选择性功能的序列（即，抗生素抗性标记、生物合成基因）、提供可评分标记功能的序列（即，报告基因）、在体外或体内有助于序列操作的序列（即，多接头序列、位点特异性重组序列、同源重组序列）和提供复制功能的序列（即，细菌复制起点、自主复制序列、着丝粒序列）。

如本文中所用的，短语“抑制MSH1基因的表达”指的是提供植物或植物细胞中降低水平的功能性MSH1活性的任何遗传或环境操作，所述降低的水平是相对于未发生这种遗传或环境操作的其他方面等基因的植物或植物细胞中发生的功能性MSH1活性的水平。

如本文中所用的，在染色体修饰的情况中，术语“转基因”指的是来自已经整合至宿主细胞中稳定维持的染色体中的异源来源的任何DNA。在该情况中，DNA的异源来源包括，但不限于，来自不同于宿主细胞生物体的生物体的DNA、不同于宿主细胞物种的物种、作为不同品种或相同品种的相同物种的品种、已经发生了任何体外修饰的DNA、重组DNA或其任意组合。

如本文中所用的，术语“非再生的”指的是不能产生完整植物的植物部分或植物细胞。

II.描述概览

提供了用于引入产生呈现出有用性状的植物的可遗传和表观遗传和/或遗传的变异的方法，以及通过这些方法可获得的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和加工的植物产品。在特定的实施方案中，本文中提供的方法可以用于将表观遗传和/或遗传的变异引入变种或非杂种植物中，其产生有用的性状以及有用的植物、植物部分（包括但不限于种子）、植物细胞和加工的植物产品（其呈现出、携带或另外反映出由所述有用性状赋予的益处）。在其他实施方案中，本文中提供的方法可以用于将表观遗传和/或遗传变异引入也易发生杂交的植物中。

在大部分实施方案中，本文中提供的方法涉及抑制植物MSH1基因的表达，恢复功能性植物MSH1基因的表达并且选择呈现出一种或多种有用性状的后代植物。在特定的实施方案中，这些有用的性状与已经发生可遗传和可逆的表观遗传改变的一个或多个改变的染色体位点、与已经发生可遗传的遗传改变的一个或多个突变的染色体位点或与其组合相关。

III.植物或植物细胞中MSH1表达的抑制

总地来说，本文中提供的用于将表观遗传和/或遗传变异引入植物中的方法只需要简单地将MSH1表达抑制一段足以引入该变异的时间。因此，可以使用各种MSH1抑制方法来实施本文中提供的方法，并且所述方法不限于特定的抑制技术。

由于MSH1基因和MSH1基因删除的效应表现为在植物中是高度保守的，因此进一步预期本文中提供的方法可以用于多种不同的植物或植物细胞。本文中提供了来自拟南芥（Arabidopsis）、大豆、玉米（Zea mays）、高粱、水稻、短柄草（Brachypodium）、葡萄（Vitis Vinifera）、棉花和黄瓜的MSH1基因或其片段的序列。在特定的实施方案中，这样的基因可以直接用于同源或异源的植物物种中以在同源或异源植物物种中提供内源性MSH1基因的抑制。Sandhu等，2007提供了非限制性的示例性证明，其中来自一个物种的MSH1基因显示出在同源和异源物种中抑制内源性MSH1基因是有效的，其中提供西红柿MSH1序列的MSH1抑制RNA（RNAi）的转基因显示出抑制西红柿和烟草两者的内源性MSH1基因。提供玉米MSH1序列的MSH1抑制RNA（RNAi）的转基因可以抑制粟、高粱和玉米的内源性MSH1基因。可以通过各种技术获得来自其他植物的MSH1基因并用于抑制那些植物中的相应MSH1基因的表达或不同植物中的MSH1基因，所述其他植物包括，但不限于，棉花、加拿大油菜、小麦、大麦、亚麻、燕麦、黑麦、草坪草、甘蔗、苜蓿、香蕉、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、棉花、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、烟草、麻风树属、亚麻荠属和龙舌兰属。用于获得各种植物的MSH1基因的方法包括，但不限于如下的技术，如：i）搜寻包含来自植物物种的序列的氨基酸和/或核苷酸序列数据库以通过序列同一性比较鉴定MSH1基因；ii）通过从基因组序列的PCR或表达的RNA的RT-PCR克隆MSH1基因；iii）使用PCR和/或基于杂交的技术从基因组或cDNA文库克隆MSH1基因；iv）在针对MSH1蛋白的抗体用于鉴定含MSH1克隆的情况中，从表达文库克隆MSH1基因；v）通过msh1突变体或MSH1缺陷植物的补充来克隆MSH1基因；或vi）（i）、（ii）、（iii）和/或（v）的任意组合。可以通过以下方法来容易地确定或证实来自植物的MSH1基因的恢复：构建提供基因抑制的植物转化载体、用载体转化植物并且确定用载体转化的植物是否呈现出MSH1表达受抑制时通常在各种植物物种中观察到的特征性反应，包括叶杂色性、细胞质雄性不育（CMS）、降低的生长速率表型、延迟开花或不开花表型和增强的对病原体的易感性。

在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSH1基因或其片段将具有与本文中提供的一个或多个MSH1基因或其片段（包括但不限于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-10和SEQ ID NO:14）具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSH1基因或其片段编码MSH1蛋白或其部分，所述MSH1蛋白或其部分将具有与本文中提供的一个或多个MSH1蛋白（包括但不限于SEQ ID NO:2，和SEQ ID NO:3-10编码的MSH1蛋白）具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSH1基因或其片段将具有与本文中提供的一个或多个MSH1基因、其片段、其直系同源物（ortholog）或其同系物（包括但不限于SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52）具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSH1基因或其片段编码将具有与本文中提供的一个或多个MSH1蛋白或MSH1同系物（包括但不限于SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52编码的蛋白）具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的MSH1蛋白或其片段。

来自本文中提供的那些以外的植物的MSH1基因也可以通过表征许多MSH1基因的编码的DNA结合结构域（结构域I）、ATP酶结构域（结构域V）和羧基-端GIY-YIG型核酸内切酶结构域（结构域VI）来鉴定（Abdelnoor等，2006）。在这点上，预期18至20个核苷酸的MSH1核酸片段，但更优选21个核苷酸或更多个核苷酸的MSH1核酸片段，可以用于有效抑制内源性MSH1基因。在特定的实施方案中，至少18、19、20或21个核苷酸至约50、100、200、500或更多个核苷酸的MSH1核酸片段可以用于实现内源性MSH1基因的抑制。

在特定的实施方案中，用转基因实现植物中的MSH1抑制。可以用于抑制MSH1表达的转基因包括，但不限于，产生提供内源性MSH1基因抑制的MSH1的显性负突变体的转基因、小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA。通过引用全部并入本文中的描述了通过转基因抑制内源性植物基因的US专利包括US7,109,393、US5,231,020和US5,283,184（共同抑制方法）；及US5,107,065和US5,759,829（反义方法）。在特定的实施方案中，特别设计来产生与MSH1基因同源的双链RNA（dsRNA）分子的转基因可以用于降低内源性MSH1基因的表达。在这样的实施方案中，可以通过间隔序列将dsRNA的正义链序列与反义序列隔开，间隔序列优选是促进dsRNA（双链RNA）分子形成的序列。这样的间隔序列的实例包括但不限于，Wesley等，Plant J.，27(6):581-90（2001）和Hamilton等，Plant J.，15:737-746（1998）中所列的那些。Sandhu等，2007已经描述了显示出在烟草和西红柿中提供MSH1抑制的一个示例性和非限制性的载体，其中内含子序列分隔了MSH1序列的正义和反义链。

在特定的实施方案中，提供MSH1抑制的转基因可以包含提供可操作地连接的MSH1抑制序列的诱导或下调的受调控启动子。在这种情况中，MSH1抑制序列可以包括，但不限于，提供植物的内源性MSH1基因抑制的MSH1显性负突变体、小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA。这样的启动子可以通过提供或保留诱导物或下调子在受控的时间段内提供MSH1的抑制。诱导型启动子包括，但不限于，PR-1a启动子（US专利申请公开号20020062502）或GST II启动子（WO1990/008826A1）。在其他实施方案中，提供了可以诱导或抑制的转录因子以及通过该转录因子识别并可操作地连接MSH1抑制序列的启动子。这样的转录因子/启动子系统包括，但不限于：i）可以通过甲氧虫酰胼、虫酰胼和其他化合物诱导的RF2a酸性结构域-蜕皮激素受体转录因子/同源启动子（US专利申请公开号20070298499）；ii）可以用四环素抑制或去抑制的嵌合四环素阻遏物转录因子/同源嵌合启动子（Gatz，C.等（1992），Plant J.2，397-404）等。

在再其他的实施方案中，提供了转基因植物，其中提供MSH1抑制的转基因侧邻提供该转基因去除的序列。这样的序列包括，但不限于，通过同源转座酶起作用的转座因子序列。已经用于转基因植物中的这样的系统的非限制性实例包括cre-lox和FLP-FRT系统。

通过分子技术可以容易地鉴定或监测MSH1抑制。在其中内源性MSH1是完整的但其表达受到抑制的特定实施方案中，可以监测编码MSH1的RNA的产生或累积。用于监测MSH1RNA表达水平的分子方法包括，但不限于，使用半定量或定量逆转录酶聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术。已经描述了使用半定量PCR技术监测由MSH1的RNAi介导的抑制产生的MSH1抑制（Sandhu等，2007）。可以使用各种定量RT-PCR程序，包括，但不限于，TaqMan.TM.反应（AppliedBiosystems，Foster City，Calif.US）、使用Scorpion.TM或MolecularBeacon.TM.探针或者Bustin，S.A.（Journal of Molecular Endocrinology（2002）29，23-39）中公开的任何方法。还可能使用其他RNA定量技术，如定量的基于核酸序列的扩增（Q-NASBA.TM.）或Invader.TM.技术（Third Wave Technologies，Madison，Wis.）。

在其中通过使用植物的内源性MSH1基因中的突变来实现MSH1抑制的特定实施方案中，可以通过各种技术来容易地确定基因组DNA中的所述突变的存在或不存在。还可以使用提供鉴定半合子状态的突变的特定技术（即，其中一条染色体携带突变的msh1基因，而另一条染色体携带野生型MSH1基因）。可以通过各种有效的方法来检测包括插入、删除、核苷酸置换及其组合的MSH1DNA序列中的突变，所述有效方法包括，但不限于，U.S.专利No.5,468,613，5,217,863；5,210,015；5,876,930；6,030,787；6,004,744；6,013,431；5,595,890；5,762,876；5,945,283；5,468,613；6,090,558；5,800,944；5,616,464；7,312,039；7,238,476；7,297,485；7,282,355；7,270,981和7,250,252中公开的那些，将其全部通过引用并入本文中。例如，如U.S.专利5,468,613和5,217,863中公开的，可以通过与等位基因-特异性寡核苷酸（ASO）探针杂交来检测突变。US专利5,210,015公开了退火的寡核苷酸的检测，其中通过5’-3’核酸外切酶活性来释放未退火的5’标记的核苷酸。US专利6,004,744公开了通过DNA引物延伸反应检测DNA中突变的存在或不存在。US专利5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中可以通过如下方法来检测核酸序列中的单个或多个核苷酸变异，所述方法中含有核苷酸变异的序列被扩增，固定于支持物上并且暴露于标记的序列特异性寡核苷酸探针。还可以通过U.S.专利5,800,944中公开的探针连接方法来检测突变，其中将目标序列扩增，并与探针杂交，接着连接以检测探针的标记部分。US专利6,613,509和6,503,710以及其中发现的参考文献提供了使用质谱鉴定突变的方法。这些不同的鉴定突变的方法只是示例性的，而不是限制，因为本发明的方法可以结合任何多态性分型方法来使用以鉴定基因组DNA样品的MSH1基因中的突变的存在或不存在。此外，所用的基因组DNA样品可以包括，但不限于，直接从植物分离的基因组DNA、克隆的基因组DNA或扩增的基因组DNA。

内源性植物MSH1基因的突变可以获自多种来源，并且可以通过多种技术来获得。在MSH1基因中含有一个或多个功能缺失突变的同源替代序列和在双链断裂的两端的同源序列可以提供染色体中残留野生型MSH1序列与具有功能缺失突变的msh1替代序列的的同源重组和替代。这样的功能缺失突变包括，但不限于，导致MSH1功能完全缺失或足以引发其他染色体位点中的改变的MSH1功能缺失（即，可遗传和可逆的表观遗传变化）或其他染色体位点中的突变的MSH1基因内序列的插入、删除和置换。MSH1中的功能缺失突变包括，但不限于，移码突变、预成熟翻译终止密码子插入、一个或多个功能结构域的删除，所述结构域包括，但不限于，DNA结合结构域（结构域I）、ATP酶结构域（结构域V）和/或羧基-端GIY-YIG型核酸内切酶结构域等。本文中还提供了类似于拟南芥msh1突变的突变，其被工程化至内源MSH1植物基因中以获得相似的效应。已经在烟草和玉米中报道了通过同源双链断裂修复来置换内源性染色体序列的方法（Wright等，Plant J.44，693，2005；D’Halluin等，Plant Biotech.J.6:93，2008）。还可以通过非同源末端连接或非同源末端连接和同源重组的组合，将同源替换msh1序列（即，其提供MSH1序列中的功能缺失突变）引入靶向的核酸酶切割位点中（综述于Puchta，J.Exp.Bot.56，1，2005；Wright等，Plant J.44，693，2005）。在特定的实施方案中，可以通过大范围核酸酶（meganuclease）将至少一个位点特异性双链断裂引入内源性MSH1基因中。大范围核酸酶的遗传修饰可以提供在精确匹配或与特定内源性MSH1靶序列密切相关的识别序列内切割的大范围核酸酶（WO/06097853A1、WO/06097784A1、WO/04067736A2、U.S.20070117128A1）。因此，预期可以选择或设计在靶MSH1序列内切割的核酸酶。在其他实施方案中，可以用锌指核酸酶将至少一个位点特异性双链断裂引入内源性MSH1靶序列中。使用工程化锌指核酸酶来提供植物中的同源重组也已经被公开了（WO03/080809、WO05/014791、WO07014275、WO08/021207）。在再其他的实施方案中，可以通过使用如由Henikoff等所述的TILLING技术（基因组内靶向诱导的局部损伤）来鉴定内源性MSH1基因中的突变，其中传统化学诱变后接着是高通量筛选以鉴定在内源性MSH1基因中包含点突变或其他突变的植物（Henikoff等，Plant Physiol.2004，135:630-636）。

在特定的实施方案中，可以通过将整个植物或植物的繁殖结构暴露于导致内源性MSH1基因抑制的应激条件来实现MSH1抑制。这样的应激条件包括，但不限于，高光应激和热应激。示例性和非限制性高光应激条件包括连续暴露于约300至约1200μmol光子/m2.s，持续约24至约120小时。示例性和非限制性热应激条件包括连续暴露于约32℃至约37℃的温度约2小时至约24小时。对于热（Shedge等，2010）、高光应激（Xu等，2011）和其他环境应激条件（Hruz等，2008），也公开也可以提供用于MSH1抑制的示例性和非限制性热、光和其他环境应激条件应激。

本文中还提供了在培养的植物细胞中实现MSH1抑制的方法。在特定的实施方案中，可以通过在导致内源性MSH1基因抑制的应激条件下培养植物细胞来实现MSH1抑制。这样的应激条件包括，但不限于，高光应激。示例性和非限制性的高光应激条件包括连续暴露于约300至约1200μmol光子/m2.s约24至约120小时。示例性和非限制性热应激条件包括暴露于约32℃至约37℃的温度约2小时至约24小时。也可以提供用于MSH1抑制的示例性和非限制性热、光和其他环境应激条件也被公开了，热（Shedge等，2010）、高光应激（Xu等，2011）和其他环境应激条件（Hruz等，2008）。在特定的实施方案中，通过将提供这样的抑制的核酸引入植物细胞中在培养的植物细胞中实现MSH1抑制。可以用于在培养的植物细胞中提供MSH1抑制的核酸包括，但不限于，产生针对MSH1基因的小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA的转基因。可以用于在培养的植物细胞中提供MSH1抑制的核酸包括但不限于，针对内源性MSH1基因的小抑制RNA（siRNA）或微RNA（miRNA）。可以通过电穿孔引入提供MSH1抑制的RNA分子。在特定的实施方案中，可以如Vanitharani等（Proc NatlAcsd Sci U S A.，2003，100(16):9623-6）、Qi等（Nucleic Acids Res.2004年12月15；32(22):e179），或J.Cheon等（Microbiol.Biotechnol.（2009），19(8)，781-786））中公开的来完成将抑制RNA引入培养的植物细胞中以抑制靶基因。

可以通过其中观察植物表型的传统方法来容易地鉴定或监测MSH1抑制。例如，可以通过观察细胞器效应来鉴定或监测MSH1抑制，所述效应包括叶杂色性、细胞质雄性不育（CMS）、降低的生长率表型、延迟开花或不开花表型和/或增强的对病原体的易感性。图1、2和3中显示了各种植物中表示MSH1抑制的表型。与MSH1抑制相关的这些表型在本文中称为“离散变异”（VD）。MSH1抑制还可以产生植物分蘖、高度、节间伸长和气孔密度（本文中称为“MSH1-dr”）的变化，其可以用于鉴定或监测植物中的MSH1抑制。其他生物化学和分子性状还可以用于鉴定或监测植物中的MHS1抑制。这样的分子性状可以包括，但不限于，参与细胞周期调控、赤霉酸（Giberrellic acid）分解代谢、植物生长素生物合成、植物生长素受体表达、开花和春化作用调节剂的基因的表达变化（即，增加的FLC和降低的SOC1表达），以及提高的miR156和降低的miR172水平。这样的生物化学性状可以包括，但不限于，TCA、NAD和碳水化合物代谢途径的大部分化合物的上调，氨基酸生物合成的下调，特定植物中蔗糖的耗尽，特定植物中糖或糖醇的增加以及抗坏血酸盐、α生育酚和应激反应性黄酮芹菜素和芹菜素-7-o葡糖苷、异牡荆黄素、山奈醇3-O-β-葡糖苷、毛地黄黄酮-7-O-葡糖苷和牡荆黄素的增加。进一步考虑在特定的实施方案中，分子、生物化学和传统方法的组合可以用于鉴定或监测植物中的MSH1抑制。

IV.MSH1抑制植物的后代的恢复、自交和异型杂交

本文中提供了用于植物中的MSH1抑制之后接着后代植物恢复（其中MSH1功能恢复）的多种方法。在特定的实施方案中，可以通过下调MSH1-抑制转基因的表达或通过用转座酶除去MSH1-抑制转基因来恢复这样的后代植物。在本文中提供的方法的特定实施方案中，在目标植物或植物细胞中抑制MSH1，并且通过传统遗传技术恢复表达MSH1的后代植物。在一个示例性的和非限制性的实施方案中，可以通过植物的自交来获得后代植物，所述自交的植物对提供MSH1分离的转基因是杂合的。这样的杂合植物的自交（或从植物细胞再生的杂合植物的自交）用于转基因从后代植物群体的子集中分离出来。在另一个示例性的和非限制性的实施方案中，在其中通过使用内源性MSH1基因（即，msh1植物）中的隐性突变来抑制MSH1的情况中，msh1/msh1植物可以与MSH1植物杂交，并且然后自交以获得对于功能性的野生型MSH1等位基因纯合的后代植物。在其他实施方案中，在目标植物或植物细胞中抑制MSH1，并且通过分子遗传技术来恢复表达MSH1的后代植物。这样的分子遗传技术的非限制和示例性实施方案包括：i）通过撤回该启动子的活性所需的诱导剂或引入该启动子的阻遏物在调控的启动子的控制下下调MSH1抑制转基因；或ii）将侧邻转座酶识别位点的MSH1抑制转基因暴露于用于转基因去除的同源转座酶。

在本文中提供的方法的特定实施方案中，获得了源自其中MSH1表达受到抑制的植物（其呈现出雄性不育、矮化病、杂色性和/或延迟开花时间并且表达功能性MSH1）的后代植物，并作为独立的育种系维持。已经发现了这样的表型看来用于分类，以使得选择例如呈现出正常生长速率并且没有杂色性的细胞质雄性不育植物或高度杂色性的矮化的、雄性可育植物是可行的。我们在本文中称这种现象为离散变异（VD）。图6中提供了这种现象的示例性和非限制性的说明，如在已经通过分离失去MSH1-抑制转基因的自交植物群体中发生的。进一步考虑了可以通过上述任何传统遗传技术、分子遗传技术或其组合来获得这样呈现出离散变异（VD）的单独系。

从获自其中呈现出离散变异（V_D）的MSH1表达受抑制的植物获得的单独系可以与其他植物杂交以获得缺乏与离散变异（V_D）相关的表型（即，雄性可育性、矮化、杂色性和/或延迟的开花时间）的后代植物。已经令人惊讶地发现了这样的异型杂交的后代可以自交以获得呈现出显著表型变异的单独后代系。将源自其中MSH1表达受抑制并且呈现出与其他植物的离散变异的植物的异型杂交的这些单独后代系中观察到的这种表型变异在本文中称为“数量变异”（V_Q）。获自其中MSH1表达受抑制的植物与其他植物的异型杂交的特定单独后代植物系可以呈现出有用的表型变异，其中一个或多个性状相对于任一亲本系得到改善且可以选择。可以在这样的单独后代系中选择的有用表型变异包括，但不限于，相对于任一亲本系的鲜重和干重生物量的增加。图6中提供了这种现象的示例性和非限制性说明，如呈现出离散变异的植物与没有呈现出离散变异的植物的异型杂交的F2后代中产生的。

在特定的实施方案中，呈现出离散变异性的单独系的异型杂交可以是与未发生MSH1抑制但其他方面与呈现出离散变异的单独系等基因的植物。在特定的示例性实施方案中，通过抑制给定种质中的MSH1来获得呈现出离散变异的系，并且可以与未发生MSH1抑制的具有相同种质的植物进行异型杂交。在其他实施方案中，呈现出离散变异性的单独系的异型杂交可以是与未发生MSH1抑制但不是与呈现出离散变异的单独系等基因的植物。因此，在特定的实施方案中，呈现出离散变异性的单独系的异型杂交也可以是与包含一个或多个未出现在呈现出离散变异性的单独系中的染色体多态性的植物、与源自部分或全部不同的种质的植物或与不同杂种优势群的植物（在其中存在这样的不同杂种优势群的情况中）。还认识到可以以任一方向来进行这样的异型杂交。因此，呈现出离散变异性的单独系可以在这样的异型杂交中用作未发生MSH1抑制的植物的花粉供体或花粉受体。在特定的实施方案中，然后将异型杂交的后代自交以建立可以单独筛选来鉴定相对于亲本系具有改善的性状的单独系。然后选择呈现出改善性状的这样的单独系，并且可以通过进一步的自交来繁殖。图6中提供了这种程序的示例性和非限制性说明，其中获得了呈现出离散变异的植物与没有呈现出离散变异的植物的异型杂交的后代。针对所需的相对于亲本植物的性状改善筛选这样的F2后代系并且选择呈现出这样的改善的系。

V.比较和选择植物中可以赋予有用性状的改变的染色体位点

可以通过进行没有呈现出有用性状的参照植物和获自已经发生MSH1抑制的亲本植物或植物细胞的测试植物的适当比较分析并获得改变的位点或包含改变的位点的植物来鉴定和选择可以赋予有用性状的改变的染色体位点。预期在这样的比较和选择中可以使用多种参照植物和测试植物。在特定的实施方案中，没有呈现有用性状的参照植物包括，但不限于，以下任何一种：a）野生型植物；b）给定植物系的给定F2植物群体内的不同植物亚群（其中F2群体是以图6中所示的方式获得的任何适用的植物类型或品种）；c）呈现出野生型表型的F1群体（其中F1群体是以图6中所示的方式获得的任何适用的植物类型或品种）；和/或d）在那些亲本植物或植物细胞中的MSH1抑制之前与亲本植物或测试植物的亲本细胞等基因的植物（即，参照植物与之后发生MSH1抑制来获得测试植物的植物或植物细胞是等基因的）。在特定的实施方案中，呈现出有用性状的测试植物包括，但不限于，以下任何一种：a）呈现出有用性状并且源自已经发生了转基因介导的MSH1抑制的亲本植物或植物细胞的任何非转基因分离种，b）给定植物系的给定F2群体内呈现有用性状的不同植物亚群（其中F2群体是以图6中所示的方式获得的任何适用的植物类型或品种）；c）获自呈现出有用性状的（a）或（b）的植物的任何后代植物；或d）已经发生MSH1抑制的呈现出有用性状的植物或植物细胞。

通常，这些比较的目的是鉴定呈现出有用性状的测试植物和没有呈现出有用性状的参照植物之间特定染色体DNA位点的小RNA特征和/或甲基化的差异。然后可以在植物中分离或选择由此鉴定的改变的位点以获得呈现出有用性状的植物。

在特定的实施方案中，可以通过鉴定测试植物中上调或下调的小RNA来鉴定改变的染色体位点（与参照植物相比较）。这种方法是部分基于改变的染色体位点的鉴定，其中小干扰RNA通过RNA定向的DNA甲基化（RdDM）指导特定基因靶标的甲基化。已经描述了RNA定向的DNA甲基化（RdDM）方法（Chinnusamy V等，Sci China Ser C-Life Sci.（2009）52(4):331-343）。任何适用的技术平台可以用于比较测试和参照植物中的小RNA，包括，但不限于，基于微阵列的方法（Franco-Zorilla等，Plant J.200959(5):840-50）、基于深度测序的方法（Wang等，The PlantCell21:1053-1069（2009））等。

在特定的实施方案中，可以通过鉴定与位点相关的并且在测试植物中（与参照植物相比较）甲基化或酰化的组蛋白来鉴定改变的染色体位点。可以使用识别甲基化或酰化组蛋白的抗体通过富集和测序那些位点来完成与甲基化或酰化组蛋白相关的染色体位点的分析。已经描述了通过使用对于H3K4me3、H3K9ac、H3K27me3和H3K36me3特异性的抗体来鉴定与组蛋白H3的特定赖氨酸残基的甲基化或乙酰化相关的染色体区域的鉴定（Li等，Plant Cell20:259-276，2008；Wang等，The PlantCell21:1053-1069（2009）。

在特定的实施方案中，可以通过鉴定测试植物中（与参照植物相比）具有改变的甲基化状态的染色体区域（基因组DNA）来鉴定改变的染色体位点。改变的甲基化状态可以包含与参照植物相比测试植物的一个或多个染色体位点中甲基化的存在或不存在。任何适用的技术平台可以用于比较测试和参照植物中的染色体位点的甲基化状态。用于鉴定具有其甲基化状态的变化的染色体位点的适用技术包括，但不限于，基于用识别5-甲基胞苷的抗体的DNA免疫沉淀的方法、基于使用甲基化依赖性限制性内切核酸酶和PCR的方法如McrBC-PCR方法（Rabinowicz等，Genome Res.13:2658-26642003；Li等，Plant Cell20:259-276，2008）、重亚硫酸盐转化的DNA的测序（Frommer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(5)：1827-31；Tost等，BioTechniques35(1)：152-156，2003）、重亚硫酸盐处理的DNA的甲基化特异性PCR分析（Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(18):9821-6，1996）、基于深度测序的方法（Wang等，The Plant Cell21:1053-1069（2009））、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸（MsSnuPE；Gonzalgo and Jones Nucleic Acids Res.25(12):2529-2531，1997）、荧光相关光谱学（Umezu等，Anal Biochem.415(2):145-50，2011）、单分子实时测序方法（Flusberg德国，Nature Methods7，461-465）、高分辨率熔化分析（Wojdacz和Dobrovic（2007）Nucleic AcidsRes.35(6):e41）等。

VI.将与有用性状相关的染色体修饰引入植物中

本文还提供了用于将可以赋予有用性状的各种染色体修饰引入植物中的方法，以及植物、植物部分和那些植物部分的产品。可以按照本文中所述的鉴定通过MSH1的抑制诱导的染色体变化和/或染色体突变。一旦鉴定，可以将包括但不限于染色体变化、染色体突变或提供与通过MSH1抑制诱导的染色体变化和/或染色体突变相同的遗传效应的转基因的染色体修饰引入宿主植物中以获得呈现出所需性状的植物。在这种情况中，“相同的遗传效应”意思是引入的染色体修饰提供与已经发生MSH1抑制并且呈现出有用性状的植物中观察到的相似的一个或多个内源性基因的表达的提高和/或降低。在其中内源性基因在发生了MSH1抑制并且呈现出该基因表达降低和有用性状两者的植物中甲基化的特定实施方案中，提供了在其他植物中也导致该基因表达降低和有用性状的染色体修饰。在其中内源性基因在发生了MSH1抑制并且呈现出该基因表达提高和有用性状两者的植物中去甲基化的特定实施方案中，提供了在其他植物中也导致该基因表达提高和有用性状的染色体修饰。

在特定的实施方案中，引入的染色体修饰是染色体改变。可以通过将包含染色体改变的植物与缺乏染色体改变的植物杂交并且选择杂交的F1、F2或任何后续世代的后代植物中改变的存在来引入包括但不限于甲基化状态差异的染色体改变。在再其他的实施方案中，可以通过RNA定向的DNA甲基化，通过靶向该基因的siRNA或发夹RNA的表达来引入特定靶基因中的染色体改变（Chinnusamy V等，Sci China SerC-Life Sci.（2009）52(4):331-343；Cigan等，Plant J43929-940，2005；Heilersig等（2006）Mol Genet Genomics275437-449；Miki和Shimamoto，Plant Journal56(4):539-49；Okano等，Plant Journal53(1):65-77，2008）。

在特定的实施方案中，染色体修饰是染色体突变。提供染色体位点的内源性基因表达的降低或提高的染色体突变可以包括但不限于基因中的核苷酸序列的插入、删除和/或置换。染色体突变可以通过多种机理导致基因降低的表达，所述机理包括但不限于错义密码子的引入、移码突变、早熟翻译终止密码子、启动子删除、破坏mRNA加工的突变等。导致基因表达提高的染色体突变包括但不限于启动子置换、从基因除去负调控元件等。可以通过任何适用方法将染色体突变引入植物的特定位点中。用于将染色体突变引入内源性植物染色体位点中的适用方法包括，但不限于，同源双链断裂修复（Wright等，Plant J.44，693，2005；D’Hallulin等，Plant Biotech.J.6:91，2008）、非同源末端接合或非同源末端接合与同源重组的结合（综述于Puchta，J.Exp.Bot.56，1，2005；Wright等，Plant J.44，693，2005）、大范围核酸酶诱导的位点特异性双链断裂修复（WO/06097853A1、WO/06097784A1、WO04067736A2、US/20070117128A1）和锌指核酸酶介导的同源重组（WO03/080809、WO05/014791、WO07014275、WO08/021207）。在再其他的实施方案中，可以按照所述的（Henikoff等，Plant Physiol.2004，135:630-636），通过使用TILLING技术（基因组中靶向诱导的局部损伤）来鉴定内源性植物染色体位点中的所需突变。

在其他实施方案中，提供所需遗传效应的染色体修饰可以包含转基因。转基因可以通过各种机理导致基因表达降低，所述机理包括，但不限于，显性负突变体、小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA等。将其全部内容通过引用并入本文中作为参考的描述了通过转基因抑制内源性植物基因的US专利包括US7,109,393、US5,231,020和US5,283,184（共同抑制方法）；及US5,107,065和US5,759,829（反义方法）。在特定的实施方案中，特别设计来产生与染色体位点的内源性基因具有同源性的双链RNA（dsRNA）分子的转基因可以用于降低该内源性基因的表达。在这样的实施方案中，dsRNA的正义链序列可以通过间隔序列与反义序列隔开，优选是促进dsRNA（双链RNA）分子形成的间隔序列。这样的间隔序列的实例包括，但不限于，Wesley等，Plant J.，27(6):581-90（2001）和Hamilton等，Plant J.，15:737-746（1998）中所列的那些。用于用转基因介导的发夹RNA的表达抑制内源性植物基因的载体公开于U.S.专利申请No.20050164394、20050160490和2004023016，其各自的全部内容通过引用并入本文中。

导致染色体位点的基因的表达提高的转基因包括，但不限于，与强于天然启动子的异源启动子融合的重组基因、包含提供提高表达的元件如异源内含子、5’未翻译区、3’未翻译区的重组基因及其组合。这样的启动子、内含子、5’未翻译区、3’未翻译区和任何必要的多腺苷酸化区域可以可操作地连接重组DNA分子中的目标DNA，所述重组DNA分子包含可用于形成如本文中提供的染色体修饰的转基因的部分。

可用于转基因表达的示例性启动子包括，但不限于，病毒CaMV35S和FMV35S启动子（U.S.专利No.5,378,619，将其全部内容通过引用并入本文中）、花椰菜花叶病毒（CaMV）19S启动子、水稻Act1启动子和玄参花叶病毒（FMV）35S启动子（U.S.专利No.5,463,175；将其全部内容通过引用并入本文中）的增强或重复形式。可用于转基因表达的示例性内含子包括，但不限于，玉米hsp70内含子（U.S.专利No.5,424,412；将其全部内容通过引用并入本文中）、水稻Act1内含子（McElroy等，1990，The Plant Cell，Vol.2，163-171）、CAT-1内含子（Cazzonnelli和Velten，Plant Molecular Biology Reporter21:271-280，2003年9月）、pKANNIBAL内含子（Wesley等，Plant J.200127(6):581-90；Collier等，2005，Plant J43:449-457）、PIV2内含子（Mankin等，（1997）Plant Mol.Biol.Rep.15(2):186-196）和“超级泛素（Super Ubiquitin）”内含子（U.S.专利No.6,596,925，将其全部内容通过引用并入本文中；Collier等，2005，Plant J43:449-457）。示例性多腺苷酸化序列包括，但不限于，土壤杆菌肿瘤诱导（Ti）质粒胭脂碱合酶（NOS）基因和豌豆ssRUBISCO E9基因多腺苷酸化序列。

VII.MSH1抑制的植物或包含呈现出改善的或有用性状的修饰的染色体位点的植物的异型杂交后代的筛选和选择

通过使用各种技术，可以筛选和选择通过本文中提供的方法获得的植物系的各种有用性状。在本文中提供的特定实施方案中，筛选和选择其中MSH1表达受抑制的植物与其他植物的异型杂交获得的单独后代植物系的所需有用性状。

在特定的实施方案中，筛选和选择的性状是提高的植物产量。在特定的实施方案中，这样的产量提高是相对于非应激条件下的一个或多个亲本系的植物系的产量提高。非应激条件包括其中水、温度、营养素、矿物质和光落入用于植物物种栽培的典型范围内的条件。这样的用于栽培的典型范围包括既不是不足也不是过量的水、温度、营养素、矿物质和/或光的量或值。在特定的实施方案中，这样的产量提高是相对于非生物应激条件下的亲本系的植物系的产量提高。这样的非生物应激条件包括，但不限于，其中水、温度、营养素、矿物质和/或光不足或过量的条件。非生物应激条件因此将包括，但不限于，干旱应激、渗透应激、氮应激、磷应激、矿物质应激、热应激、冷应激和/或光应激。在这种情况中，矿物质应激包括，但不限于，由于不足或过量的钾、钙、镁、铁、锰、铜、锌、硼、铝或硅引起的应激。在这种情况中，矿物质应激包括，但不限于，镉、铜、镍、锌、铅和铬。

可以通过直接测量湿或干生物量来鉴定通过本文中提供的方法获得的植物系中的产量提高，所述生物量包括，但不限于，籽粒、棉绒、叶、茎或种子。还可以通过测量产量相关性状来测定产量的提高，所述性状包括，但不限于，100粒种子重量、收获指数和种子重量。在特定的实施方案中，这样的产量提高是植物系相对于一个或多个亲本系的产量提高，并且可以通过与亲本植物平行地种植通过本文中提供的方法获得的植物系来容易地测定。在特定的实施方案中，可以使用田间试验以测定产量的差异，由此对于变异将测试和对照植物的地块进行重复、随机化和进行控制（Giesbrecht FG和Gumpertz ML.2004.Planning,Construction,and Statistical Analysis of Comparative Experiments（比较实验的计划、构建和统计学分析），Wiley.New York；Mead，R.1997.Design of plantbreeding trial（植物育种试验的设计），见Statistical Methods for PlantVariety Evaluation（用于植物品种评价的统计学方法），编辑，Kempton和Fox.Chapman and Hall.伦敦）。在参考文献中提供了用于将测试植物（即，用本发明的方法获得的植物）和对照植物（亲本或其他对照）隔开以获得适用于比较的产量数据的方法，所述参考文献包括，但不限于，Cullis,B.等，J.Agric.Biol.Env.Stat.11:381-393及Besag,J.和Kempton,RA.1986.Biometrics42:231-251中的任何一个。

在特定的实施方案中，筛选和选择的性状是相对于亲本系提高的对生物植物应激的抗性。生物植物应激包括，但不限于，由植物真菌病原体、植物细菌病原体、植物病毒病原体、昆虫、线虫和食草动物产生的应激。在特定的实施方案中，提供了呈现出对真菌病原体的抗性的植物系的筛选和选择，所述真菌病原体包括但不限于链格孢菌（Alternariasp.）、壳二孢菌（Ascochyta sp.）、葡萄孢菌（Botrytis sp.）；尾孢菌（Cercospora sp.）、刺盘孢菌（Colletotrichum sp.）、腐皮壳菌（Diaporthesp.）、色二孢菌（Diplodia sp.）、白粉菌（Erysiphe sp.）、镰刀霉菌（Fusariumsp.）、顶囊壳菌（Gaeumanomyces sp.）、长蠕孢菌（Helminthosporium sp.）、壳球孢菌（Macrophomina sp.）、丛赤壳菌（Nectria sp.）、霜霉菌（Peronospora sp.）、层锈菌（Phakopsora sp.）、瓶霉菌（Phialophora sp.）、茎点霉菌（Phoma sp.）、瘤梗孢菌（Phymatotrichum sp.）、疫霉菌（Phytophthora sp.）、单轴霉菌（Plasmopara sp.）、柄锈菌（Puccinia sp.）、叉丝单囊壳菌（Podosphaera sp.）、核腔菌（Pyrenophora sp.）、梨孢菌（Pyricularia sp）、腐霉菌（Pythium sp.）、丝核菌（Rhizoctonia sp.）、小菌核菌（Scerotium sp.）、核盘菌（Sclerotinia sp.）、壳针孢菌（Septoria sp.）、根串珠霉菌（Thielaviopsis sp.）、钩丝壳菌（Uncinula sp）、黑星菌（Venturiasp.）和轮枝孢菌（Verticillium sp）。在特定的实施方案中，提供了呈现出对细菌病原体的抗体的植物系的筛选和选择，所述细菌病原体包括，但不限于欧文氏菌(Erwinia sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)和黄单胞菌(Xanthamonas sp.)。在特定的实施方案中，提供了呈现出对昆虫的抗性的植物系的筛选和选择，所述昆虫包括，但不限于蚜虫和其他穿刺/抽吸昆虫，如草盲蝽（Lygus sp.）、鳞翅目(lepidoteran)昆虫，如Armigera sp.、铃夜蛾（Helicoverpa sp.）、实夜蛾（Heliothis sp.）和尺夜蛾（Pseudoplusiasp.），以及鞘翅目昆虫，如Diabroticus sp.。在特定的实施方案中，提供了呈现出对线虫的抗性的植物系的筛选和选择，所述线虫包括但不限于，根结线虫（Meloidogyne sp.）、异皮线虫（Heterodera sp.）、刺线虫（Belonolaimus sp.）、茎线虫（Ditylenchus sp.）、球皮线虫属（Globoderasp.）、珍珠线虫（Naccobbus sp.）和剑线虫（Xiphinema sp.）。

通过本文中提供的方法可以获得的其他有用性状包括各种种子质量性状，包括，但不限于，种子中的油、蛋白或淀粉的组成或量的提高。通过本文中提供的方法可以获得的再其他的有用性状包括但不限于，提高的生物量、不开花、雄性不育、可消化性、种子灌浆期、成熟（按照需要早熟或晚熟）、降低的倒伏和植物高度（按照需要提高的或降低的）。

除了上述任一种性状，对于高粱，通过本文中提供的方法可以获得的特别有用的性状还包括，但不限于：i）农艺学性状（开花时间、开花天数、雨后开花天数、下雨开花天数）；ii）真菌病抗性（高粱霜霉病抗性-温室、高粱霜霉病抗性-田间、高粱籽粒发霉、高粱叶枯病抗性、高粱锈病抗性）；iii）籽粒相关的性状：（籽粒干重、籽粒数、籽粒数/平方米、穗上的籽粒重、种子颜色、种子光泽、种子大小）；iv）生长和发育阶段相关的性状（基础分蘖数、采收天数、成熟天数、结节分蘖、植物高度、雨后植物高度）；v）花序解剖学和形态学性状（脱粒率）；vi）昆虫损害抗性（雨后高粱黄潜蝇抗性、下雨时高梁黄潜蝇抗性、高粱钻心虫抗性）；vii）叶相关性状（叶色、叶中脉颜色、叶脉颜色、旗叶重量、叶重、剩余叶重）；viii）矿物质和离子含量相关性状（芽钾含量、芽钠含量）；ix）穗相关性状（穗的数目、穗紧实度和形状、穗颈长度(panicleexertion)、穗收获指数、穗长、穗重、不含籽粒的穗重、穗宽）；x）植物化学化合物含量（植物着色）；xii）小穗解剖学和形态学性状（颖色、颖片覆盖（glume covering））；xiii）茎相关性状（茎超过叶重（stem overleaf weight）、茎重）；和xiv）杂项性状（秸杆相关性状、代谢的能量、氮消化性、有机物质消化性、秸杆干重）。

实施例

包括以下实施例来证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解以下实施例中公开的技术遵循发明人发现的很好地实施本发明的技术，并且因此可以认为是构成了优选的实施方式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当认识到可以在所公开的特定的实施方案中形成许多变化，并且仍然获得同样或相似的结果而没有脱离本发明的精神和范围。

实施例1.提供MSH1抑制的转基因植物的构建

如下构建提供西红柿和烟草中的MSH1抑制的载体。使用引物序列TOM-CD1F（5-CGCAGGTATCACGAGGCAAGTGCTAAGG-3；SEQ IDNO:11）和TOM-CD1R（5-ATCCCCAAACAGCCAATTTCGTCCAGGATCCCCAAACAGCCAATTTCGTCCAGG-3；SEQ ID NO:12）从西红柿EST序列（SEQ ID NO:5）得到编码MSH1蛋白的氨基酸651-870的片段，并且以正向和反向定向克隆，其通过内含子序列隔开。基础载体，pUCRNAi-内含子带有拟南芥小核核蛋白的第二内含子（At4g02840；SEQ ID NO:13）。CaMV35S启动子和转录终止子调控构建和新霉素磷酸转移酶II（nptII）报道基因的表达，并且插入片段侧邻右边界和左边界整合序列。根癌土壤杆菌菌株C58C1/pMP90（28）用于烟草（Horsch RB等，(1985)Science227:1229-1231）和西红柿（McCormick等，1986，Plant Cell Rep5:81-84）中的转化。

通过相似的程序和材料产生粟和高粱RNAi系，并根据Howe等（Plant Cell Rep25:784-91，2006）的程序进行了转化和植物再生。用于粟的RNAi载体针对粟MSH1基因，而用于高粱的RNAi载体针对高粱MSH1基因（SEQ ID NO:6）。使用引物：zm-msf8（5’-GGTTGAGGAGCCTGAATCTCTGAAGAAC-3’；SEQ ID NO:15）和zm-msr8（5’-CTCGCCAGAGATTCGAGATATACCGAAG-3’；SEQ IDNO:16）从珍珠粟和高粱的总cDNA扩增编码从MSH1C-端的157个氨基酸的片段。以正向和反向定向克隆PCR产物，其通过内含子序列隔开。基础载体，pUCRNAi-内含子（其带有拟南芥小核核蛋白的第二内含子（At4g02840；SEQ ID NO:13））由H.Cerutti（University of Nebraska，Lincoln，NE）提供。载体pPTN290，pPZP212的衍生物（Hajdukiewicz等，1994，Plant Mol Biol.；25(6)：989-94），用于在与其第一内含子偶联的玉米泛素1启动子的控制下引入Msh1-RNAi盒，并且通过CaMV35S终止子终止其转录。CaMV35S启动子和终止子调控新霉素磷酸转移酶II（nptII）报告基因的表达，并且插入片段侧邻右边界和左边界整合序列。根癌土壤杆菌菌株NTL4（Luo Z-Q等，2001，Mol Plant MicrobeInteract.，14(1):98-103）用于接种来自珍珠粟保持系Tift23DBE1和高粱Tx430系的胚芽。用于珍珠粟的详细转化程序与用于高粱的相同（Howe等，2006，Plant Cell Rep25:784-91）。

实施例2：MSH1抑制的表型效应

通过在五个植物物种中使用RNAi来转基因抑制MSH1表达：大豆（Glycine max(L.)Merr）、西红柿（Solanum lycopersicum L）、烟草（Nicotiana tabacum L.）、粟（Pennisetum glaucum(L.)R.Br.）和高粱（Sorghum bicolor(L.)Moench）。在每种情况中，观察到了相似的变化，包括细胞质雄性不育、杂色和改变的叶绿体发育的迹象、降低的生长速率和矮化、改变的开花时间或不开花、增强的分枝、降低的类黄酮生物合成和缺乏花青素、增强的病原体易感性和改变的叶形态（参见图1）。在发生MSH1抑制的各种植物中也观察到了杂色性、矮化和线粒体DNA重排，分别如图2、3和4中所示。在生理学上，植物显示出降低的ATP和增强的ROS水平、降低的线粒体活动力、增强的线粒体自噬、应激反应途径的表达以及改变的细胞分裂素和GA代谢（图5中的ROS数据）。

植物物种之间惊人的表型相似性表明，许多msh1-相关变化是编程的反应。转录产物和代谢分析已经鉴定出与出现的表型相关的几个途径（表1）。高粱和拟南芥转录产物谱实验显示出降低的细胞周期基因表达、改变的开花基因表达（FLC）和在降低的生长表型中增强的GA分解代谢（GA20-ox2和GA20-0x6）。通过施加赤霉酸，恢复了植物的生长速率和开花诱导。

表1.拟南芥中的样品转录产物/代谢谱分析结果显示出途径改变中的对应性

显示了有限的数据集。阴影表示msh1的下调。

实施例3.暴露于MSH1RNAi转基因并且通过分离失去MSH1RNAi转基因后Tx430高粱系的遗传分析

从后代植物的分离群体获得了非转基因的、高度矮化的、延迟开花的和杂色的TX430高粱植物，所述后代植物来自对通过RNA干扰（RNAi）抑制MSH1表达的转基因为杂合的亲本Tx430高粱植物。Tx430是用于获得包含抑制MSH1表达的转基因的转基因高粱植物的初始基因型。这种非转基因、高度矮化的、延迟开花和杂色的TX430高粱植物与作为花粉亲本的等基因TX430野生型的杂交产生了野生型F1表型，其没有显示原始矮化、延迟开花或杂色表型的迹象（图6）。这是令人惊讶的结果，因为我们已经假定了RNAi-诱导的变化是表型的细胞器的预期的母系转移。野生型基因组的引入中和了原始的RNAi-诱导的效应。F2群体，源自这些F1植物的自花传粉，产生了宽范围的表型变异分布，称为数量变异，其中一些描述于表2中。SAS PROC MIXED用于表2中的所有分析。分析在模型中具有固定的系效应的各个性状，并假定和估算系间的异源方差以及估算值的标准误差。进行了异源方差模型针对同源方差模型的卡方（chi-square）检验。显著的卡方值表示系变异间的统计学显著差异。尽管小部分（ca.1/50植物）显示出矮化的、杂色的表型，并且约50%显示出很可能是线粒体遗传损伤的细胞质雄性不育（Hanson和Bentolila，2004），大部分的群体在地上鲜重和干重生物量、穗重和其他有用的农艺学特征中显示出显著的数量变异。在这些数据中特别令人感兴趣的是在群体内观察到的对于几个性状优于任一亲本的能力。多样性的范围不能通过核遗传变异来合理地解释，因为原始杂交是TX430x TN430（使用装袋的穗在温室中进行）。

表2.高粱中的表型变异的评价

1）N=系中观察的数目

2）卡方检验是用于系方差中的差异的检验

3）通常高的方差是对于该性状的小样本大小的结果

实施例4.msh1/msh1x MSH1/MSH1杂交的拟南芥MSH1/MSH1F3后代的分析

在这些实验中，通过分离除去隐性msh1突变。首先将隐性msh1/msh1Columbia生态型亲本与作为花粉供体的野生型Columbia生态型植物杂交(Col-0msh1x Col-0wt)，以获得msh1/MSH1植物的F1群体。将F1后代自交以获得对于msh1基因座分离的F2群体。从F2群体选择MSH1/MSH1F2后代，并且自交以获得选择的MSH1/MSH1F2亲本的MSH1/MSH1F3后代。

为了评价选择的F3MSH1/MSH1拟南芥系中的表型变异，从平均了来自四个植物测量值，其各自为野生型Col-0和选择的F3后代系，如表3中所示的。新鲜生物质是总的地上叶组织，基部直径是根-茎过渡区的直径，茎直径是花茎(floral stalk)的直径。各个参数在选择的F3后代系中显示出20-24%的增加，即使两个植物群体（即，Col-O和MSH1/MSH1F3）后代在遗传上应当是相同的。选择来自各个组的植物以表示相同的发育阶段和相同的叶数目（各个组中平均48片叶/植物）。表3的数据和图7中所示的植物代表一个选择的F3群体。其他选择的F3群体（未显示）证明了相对于野生型一致较低的平均生长。

一个源自Col-0msh1x Col-0wt杂交的MSH1/MSH1F3后代显示出显著增强的生长，如图7和表3中所示。这样显著增强的生长在该杂交的F3后代显示出相对于Col-O亲本种质提高的生长方面类似于杂种优势。然而，这些实验可以与其中通过将两个不同遗传背景的亲本系杂交来获得杂种优势的情况区分开来，因为在此所用的两个亲本系都具有Columbia生态型遗传背景并且仅在Columbia生态型亲本之一中存在隐性msh1突变方面不同。

表3.拟南芥中表型变异的评价

实施例5.从与MSH1抑制高粱的异型杂交获得的F2群体中的单个高粱植物的植物高度、穗重和籽粒产量的变异

通过比较群体中单个植物的值，分析了源自如图6和实施例3中所述的已经发生了MSH1抑制的亲本Tx430高粱植物的高粱植物的F2群体的植物高度（图8）、穗重（图9）和籽粒产量（图10）的变异。

在F2群体内的单个植物之间观察到明显的变异。更具体地，对于这些性状，特定的高粱系呈现出F2群体内的植物独特的两相分布。例如，高粱系GAII-11的F2群体呈现出植物高度约105至125cM的植物的一个植物亚群和植物高度约185至215cM的植物的另一个植物亚群。这些亚群通过图8曲线中的“峰”来表示。对于图8曲线中的高粱系GA11-15、GA11-28和GA11-24，也观察到相似的亚群分布。对于GA11-11、GA11-15、GA11-28和GA11-24F2群体，一组亚群与野生型TA430对照植物高度的值重叠或具有小于野生型TA430对照植物高度的值，而另一个亚群具有明显高于野生型PA430对照植物的值（图8）。GA11-11、GA11-15、GA11-28和GA11-24F2群体中的亚群和/或单个植物也呈现出重叠或具有小于野生型TA430对照植物高度的值的穗重和谷粒产量，而其他亚群或植物具有明显高于野生型PA430对照植物的值（图9和10）。

结论是在以下植物之间观察到高粱植物高度、穗重和籽粒产量的差异：a）给定高粱系的给定高粱植物F2群体内的不同植物亚群；和/或b）给定高粱系和野生型亲本对照系的给定高粱植物F2群体内的不同植物亚群。进一步考虑在植物高度、穗数目和/或籽粒产量中呈现出所需提高的那些高粱植物亚群可以包含在其直接造成这些有用性状（即，具有与有用性状直接的因果关系）或通过遗传或表观遗传连锁与直接造成这些所需想性状的位点相关的染色体DNA甲基化状态、染色体DNA序列、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合中的特定差异。实施例6.呈现出与MSH1抑制相关的有用性状的植物中小RNA特征和DNA甲基化状态的表征

没有呈现有用表型的参照植物和包含与有用性状相关的改变的染色体位点的测试植物中的小RNA特征和DNA甲基化状态的比较可以用于鉴定改变的染色体位点。该实施例中提供了可以推广至多种植物的进行这些比较的方法。

在特定的示例性实施方案中，比较了以下亚群中的各种染色体位点的小RNA特征和DNA甲基化状态：a）给定高粱系的给定高粱植物F2群体内的不同亚群；和/或b）给定高粱系和野生型亲本对照系的给定高粱植物F2群体内的不同亚群。这些比较的目的是鉴定呈现出有用性状的那些高粱植物和没有呈现出有用性状的高粱植物之间的特定染色体DNA位点的小RNA特征和/或甲基化中的差异。然后可以将这样的差异用于鉴定直接造成这些有用性状或通过遗传连锁或通过表观遗传机制与直接造成这些有用性状的位点相关的sRNA或染色体位点。将要检验的高粱植物可以包括野生型植物、来自GA11-11、GA11-15、GA11-28和GA11-24的不同亚群和/或单个植物或者呈现出重叠或具有小于野生型TA430对照植物高度的值的植物高度、穗重和/或籽粒产量的其他高粱系F2群体，以及来自GA11-11、GA11-15、GA11-28和GA11-24或呈现出明显高于野生型TA430对照植物的植物高度、穗重和/或谷粒产量的其他高粱系F2群体中的不同亚群和/或单个植物的植物。这样的植物和这样的亚群示例性地描述于之前的实施例5以及图8、9和10中。

测定了野生型高粱（Tx430）、F1高粱和源自不同亚群的选择的F2高粱植物的小RNA（sRNA）特征。将要检验的高粱亚群或植物可以包括野生型植物、如上所述的GA11-11、GA11-15、GA11-28和GA11-24或其他高粱F2群体中的亚群和/或单个植物。例如，发生MSH1抑制的特定高粱群体可以呈现出重叠或具有低于野生型TA430对照植物高度的值的穗重和籽粒产量，而其他高粱亚群或植物可以是明显高于野生型TA430对照物质的值，如图9和10中所示的，可以进行深度测序以鉴定这些不同植物系中存在的sRNA的类型（定性分析）和相对量（定量分析）。这样的定性和定量分析然后可以用于建立给定表型的存在或不存在与给定sRNA的存在、不存在或相对丰度之间的相关性。

通过包括但不限于Zhou等，PLoS One.2010；5(12):e15224或Glazov等，PLoS One.2009年7月27日；4(7):e6349中所述的那些方法，按照所述的确定用于表征sRNA群的深度测序技术。在特定的实施方案中，可以对于各个样品测序三个生物重复，并且可以根据IlluminaTM方案制备sRNA文库并测序。简而言之，可以通过大小分级从总RNA分离低分子量sRNA（17-27nt长）。3’和5’接头与sRNA连接后，进行RT-PCR来构建sRNA文库。根据Illumina^TM方案纯化和验证文库，并且可以进行基于Illumina^TM的深度测序。

除去共有序列（rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA）后，将剩余的sRNA序列进行几个分析。第一个分析是评价sRNA在基因组中的分布，预期通过MSH1功能的分布鉴定改变的sRNA分布。基因组聚类的分析将用于检验基因组中sRNA-产生位点的分布。sRNA簇定义为其中各个小RNA距其最接近的邻居<100nt的sRNA组，如Johnson等（2009）中所述的。基于这种定义，簇末端的sRNA距簇外的下一个最接近的小RNA>100nt（Johnson等，2009）。可以比较不同植物系间siRNA印记的差异表达以获得它们与破坏的MSH1功能的关系的深入了解。这将通过比较源自各个植物系的各个文库中miRNA或siRNA的相对丰度来完成。SAMseq方法可以用于进行差异表达的显著水平的统计学分析。可以选择在深度测序分析中呈现出差异表达模式的几个sRNA用于使用RNA凝胶印迹分析的验证。

为了获得关于各种样品中DNA甲基化的改变和sRNA水平之间的相关性的信息，可以将含有DNA甲基化（下述）的区域相对获自该研究和其他公众可获得的数据库的sRNA作图，以鉴定含有由sRNA潜在靶向的DNA甲基化的区域。

可以比较获自不同系的sRNA和DNA甲基化特征以确定呈现出不同MSH-1诱导表型的各种植物样品中DNA甲基化含量的改变是否与sRNA丰度的变化相关。这类分析中的一个关注问题是sRNA可能太短以致不能被检测。sRNA通常在植物中由长得多的转录产物生成。因此，按照所报道的（Wang等，2009），可以将DNA甲基化的分析扩展至含有sRNA的染色体位点的任一侧上的500bp。这个分析将表明DNA甲基化是否可以潜在地通过sRNA来诱导。这样的研究可以用于鉴定sRNA群体中改变了可能由MSH1抑制导致的基因组甲基化模式的可检测改变。然后可以使用转基因或其他基于基因组改变的方法将这些研究中鉴定的任何sRNA和/或基因组区域抑制和/或上调，以获得可以由MSH1抑制产生的所需表型。

还可以通过全基因组重亚硫酸盐测序实验中的甲基C检测来测定各种植物和植物系中MSH1抑制诱导的有用表型与染色体改变的相关性。基因组重亚硫酸盐深度测序方法（Lister2009）可以用于获得发生MSH1抑制的植物和合适的对照植物的基因组中所有可能的甲基化胞嘧啶的全基因组景象，所述植物包括，但不限于，呈现出所需表型或不需要表型的那些植物，合适的对照植物，包括，但不限于，尚未发生MSH1抑制的亲本系。在示例性方法中，可以分离约五微克基因组DNA，并且用25纳克的未甲基化λDNA（用作非甲基化胞嘧啶核苷酸重亚硫酸盐转化成尿嘧啶的效率的内部对照）掺入。可以将DNA超声处理成约300bp的平均长度，并且可以构建DNA文库。可以使用按照Illumina^TM PairedEnd实验方案的示例性方法，所述方案包括其中末端修复混合物不含dCTP并且接头含有甲基化胞嘧啶（Illumina^TM）的改变。接头-连接的DNA的重亚硫酸盐转化可以接着使用尿嘧啶不敏感的PfuTurboCx DNA聚合酶（Stratagene^TM）进行有限循环的PCR。凝胶分离的200-300bp产物测序达到Illumina^TM GAII系统上的110碱基长度。标准Illumina^TM图像分析、碱基识别(base calling)和加工流程将用于获得初始加工的序列。在特定的实施方案中，只有通过内部Illumina^TM过滤器（纯净度>0.6）的那些序列将与PHRED-样序列质量评分一起存储在FastQ文件中。在低质量碱基（PHRED评分<2）的第一Project Description12出现之前，修剪序列阅读片段。可以将序列中任何剩余的胞嘧啶碱基转化成胸腺嘧啶，并且将其基因组位置保留在甲基C覆盖文件中。在特定的实施方案中，可以产生两个参照基因组。在第一参照基因组中（对应于“Watson”链），胞嘧啶可以转化成胸腺嘧啶。在第二参照基因组中（对应于Crick链），鸟嘌呤可以转化成腺嘌呤。对于内部控制λDNA可以进行相同的转化，其对于非甲基化胞嘧啶的转化效率作为单独的参照基因组进行分析。使用Bowtie（Langmead等，2009），将Illumina序列与两个参照基因组比对。在特定的实施方案中，只有具有独特起始位置的测序阅读片段被评分（相同位置处开始的第二序列被丢弃以最小化数据的不等PCR扩增失真）。对于λ内部控制，预期高于99%的非甲基化胞嘧啶至胸腺嘧啶的转化率，并且在先导研究和各个文库的单一泳道分析（在进一步的文库测序之前）中证实，如使用内部λDNA控制序列测定的。重亚硫酸盐处理的λDNA中的胞嘧啶的出现可以作为序列覆盖率的函数来计算（各个序列阅读片段计数为1的覆盖率）。对于通过测序错误或不完全转化成尿嘧啶产生的胞嘧啶，将建立具有<0.01的p-值的域值。

两个生物重复可以用于各个分析的基因组类型。对于各条链，覆盖率可以为10x。这应当是足够的覆盖率来比较对于单个变异在最多位置处的单独生物重复。当比较不同基因型样品时，对于各条链的20x覆盖率合并来自两个个体的组合序列数据。单个生物重复可以用于建立覆盖率和甲基化百分比域值以对于特定位置处的差异具有<0.05的假发现率（False Discovery Rate）（FDR）。可以通过传统的重亚硫酸盐-PCR-克隆方法来分析显示出甲基C差异的选定区域以验证全基因组数据和FDR预测。

实施例7.响应于MSH1抑制的甲基化和表型变异的定量分析

可能利用通过MSH1RNAi-衍生的表型变体x野生型杂交产生的F2群体中出现的定量表型变异。可以测定本文中描述的发生MSH1抑制的各种高粱群体和对照高粱植物中的遗传力和定量变异以鉴定赋予有用性状的染色体改变。在特定的实施方案中，这些方法需要使用通过SNP发生和检测中的高粱鸟枪（shotgun）测序实验鉴定的重亚硫酸盐衍生的DNA SNP多态性。高粱基因组为约1628cM，并且我们将瞄准约1SNP/10cM（厘摩）的SNP标记密度。因此，基于多达五个样品类型（即，（1）野生型，（2）显示出剧烈降低的生长速率和延迟开花的转基因MSH1敲除植物，（3）保留改变的生长表型的非转基因分离种，（4）F1植物（如图6中所示）和（5）呈现出数量变异的选定F2植物（图6））的全基因组分析中其差异甲基化，并且对于高粱基因组上甚至10-cM的间隔选择用于QTL分析的163个Me-C位点。

来自200个F2个体的DNA可以进行重亚硫酸盐处理以在随后的PCR产物中形成C/T SNP。C/T比例将取决于各个甲基化位点的Me-C程度。对于C-耗尽序列设计的PCR引物用于扩增重亚硫酸盐处理的DNA中的靶向Me-C SNP区域。使用HybprobesTM（Roche，Indianapolis，IN，USA）在LightCycler480PCR系统上检测C/T多态性。Hybprobes^TM使用与PCR产物杂交的邻近探针之间的荧光共振能量转移（FRET）和差异熔融以确定Me-C SNP位置的C/T频率。LightCyclerTM探针设计软件（Roche）用于设计HybProbes，具有传感器探针中间的C/T多态性。对于各SNP，通过实验确定为了获得用于与HybprobesTM杂交的Me-C链的最佳不对称PCR的PCR引物的比例。

遗传力分析。可以在高粱中产生多达约二百个或更多个F3家族。可以从各个F2个体提取DNA，从而产生各个F3家族。可以进行F3家族的重复田间试验以进行通过MSH1RNAi转基因（即，MSH1抑制）的跨代效应产生的推定的表观遗传变异的遗传力分析。对于各个物种，在随机的完整区组设计中排列单一的三米排，两次重复。群体将在实验田中生长。

QTL分析。与200个F2个体上的标记数据一起，表型数据将用于QTL分析中以定位在产生观察到的总生物质和种子产量变异的之前世代中受MSH1影响的基因组区域。使用关于甲基化位点改变的分离数据构建遗传图谱，接着进行标准复合区间作图。

实施例8.使用Msh1抑制来改变表观基因组以产生植物生长的剧烈的和可遗传的改变

Msh1抑制用于诱导表型和表观遗传变异，并且在作物物种高粱（Sorghum bicolor(L.)Moench）和模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh）中选择衍生的表型。

图11显示了用于拟南芥和高粱两者的该研究中的转基因和杂交方法。在高粱中，所有实验使用近交系Tx430进行（F.R.Miller，Crop Sci.24，1224，1984），而拟南芥实验在近交生态型Columbia-0中进行。将不再含有MSH1-RNAi转基因的MSH1-dr高粱植物恢复到正常MSH1转录产物水平；然而，它们通过多代的自花传粉维持改变的生长表型。当与野生型近交Tx430系反交时，后代恢复至正常表型。衍生的F1后代，称为MSH1-epiF1，不再显示矮化的、分蘖的、晚开花表型。实际上，与野生型相比，植物生长较高并且通常产生更多种子（图11A）。MSH1-epiF1植物的自花授粉产生了F2群（MSH1-epiF2），其惊人地在植物表型中可变但没有显示出MSH1-dr表型（图11B-D）。一部分温室生长的MSH1-epiF3家族以约8%的频率显示出MSH1-dr表型（表4），并且在epi-F4系中没有出现矮化表型。

表4.源自高粱Tx430MSH1-dr x Tx430并且生长在温室中的epi-F3家族中的MSH1-dr表型（8.4%）的频率。衍生的epi-F4家族没有显示出MSH-dr表型的迹象（未显示）。

F2植物及通过自花授粉衍生的后续群体显示出农艺学性能性状的变异，包括穗和植物结构、分蘖时间和数量、植物高度和地上生物量，以及穗的产量成分和种子重量（对于植物高度和籽粒产量的表5）。相似地，在源自msh1突变体与野生型杂交的拟南芥群体中观察到了剧烈的变化，接着选择纯合的MSH1/MSH1F2植物和系列的自花授粉（图11F-H）。

在2010和2011年田间条件下种植的高粱MSH1-epiF2、MSH1-epiF3和MSH1-epiF4群体允许较大规模的植物生长变化的评价（表5、6、7）。从两个高粱田间实验的结果产生了表型分布，证明MSH1-epiF2近似双峰中的模式（图12）。所有性状显示出变异的定量模式。在田间和温室条件下测试了F3和F4后代，展示了植物高度的遗传力，在每代的植物间具有提高的均匀性对于籽粒产量选择的反应，尽管这个性状在温室生长的过程中经历不太严格的选择（图13）。这些结果表明对于观察到的变异的高度遗传力和选择反应。

通过叶绿体变化调节高粱MSH1-dr和拟南芥msh1突变系中改变的植物发育，包括生长速率、分枝、成熟和开花的变异（参见以下的实施例9）。我们感兴趣的是测定MSH1-epiF2变异与这些细胞器影响的关系。拟南芥MSH1半-补充系，通过将线粒体靶向的MSH1转基因相对叶绿体-靶向的MSH1转基因引入msh1突变系中产生的（Y.-Z.Xu等，PlantCell239:3428，2011），区分了形成该现象的线粒体和叶绿体的影响。线粒体和叶绿体半补充系作为母本与野生型（Col-0）杂交以产生F1和F2后代。来自与叶绿体补充系杂交的F1植物产生了与野生型相似的表型，尽管约25%的F1植物显示出改变的叶卷缩和延迟的开花（图16）。该卷缩表型可以是MSH1超表达的结果，因为F1植物含有野生型MSH1等位基因和转基因。该表型类似于改变的水杨酸途径调控（表观遗传调控的过程）的效应（T.L.Stokes等，Genes Dev16，171，2002）。来自与线粒体补充系杂交的F1后代在植物生长中表现出表型变异，超过30%的植物显示出增强的生长、较大的莲座丛直径、较厚的花茎和较早的开花时间，与MSH1-epiF3表型相似（图14A&17；表8）。这些结果进一步在线粒体vs.叶绿体-补充的F2群体中得到了证实（图14B-E），并且表明MSH1-epiF3增强的生长变化源自将MSH1功能恢复成已发生MSH1-dr发育重编程现象的植物。

研究拟南芥野生型和MSH1-epiF3植物（都是Col-0背景）的可能伴随可遗传MSH1-产生的表型的甲基化组(methylome)变化的证据。实验使用了重亚硫酸钠处理的基因组DNA和全基因组下代序列分析（genome-wide next gen sequence）（Lister等，Cell133，523，2008）。甲基化变化是广范的，差异甲基化的位置主要涉及CpG位点，在超过1700个区域中具有超过91,000个差异甲基化的位置（表11，图15A）。甲基化变化的模式与观察到的改变表型的遗传力一致，基因组的基因编码区域中具有大比例的变化，类似于来自天然表观遗传变异的研究的数据（C.Becker等，Nature480，245，2011；R.J.Schmitz等，Science334，369，2011）。在针对最近天然甲基化变异的拟南芥研究（C.Becker等，Nature480，245，2011；R.J.Schmitzdeng，Science334，369，2011）所报道的模式进行的这一研究中野生型和MSH1-epiF3系中的非差异甲基化模式的比较显示出明显的模式对应性（图15B，MSH1-epiF5系2），证实了两个研究之间的Col-0基因组甲基化分析的一致性。对于富集差异甲基化位置的染色体的区域的两个研究之间的显著差异是明显的；Becker等，天然变异的分析，为了说明目的显示于图15C中，显示了相当均匀的跨越各个染色体的差异甲基化的分布，而MSH1-epiF3系揭示了集中于基因组的离散区域中的差异甲基化的不规则模式（图5B，红线）。通过重亚硫酸盐处理的DNA区间的靶向PCR扩增和测序证实了显示出甲基化变化的几个DMR（图18，表9）。从这些结果，我们推断伴随MSH1破坏的发育变异涉及植物甲基化结构中的明显变化。MSH1-dr表型的遗传模式（显示出与转基因的无关性和与多个发育途径的牵连）也表明MSH1-dr系中发生了表观遗传变化。

表5.与野生型Tx430相比，大部分高粱F2epi-系家族一致地显示出植物高度和籽粒产量变异的统计学显著提高（p-值<0.05）。从2010年和2011年田地条件下种植的植物收集数据

p-值基于用于与野生型Tx430比较的方差的均质性的Levene’s检验。

NS=不显著

表6.用于干生物质测量的五个高粱epi-F2系家族中的三个显示出与野生型Tx430相比变异的统计学显著提高(p值<0.05)。从2011年田间条件下种植的植物收集数据。

p-值基于用于与野生型Tx430比较的方差的均质性的Levene’s检验。

NS=不显著

表7.与野生型Tx430相比，高粱F4代数据显示出许多epi-F4家族中植物高度（39个系中的37个）和籽粒产量（39个系中的11个）的显著差异（p-值<0.05）。从2011年田间条件下种植的植物收集数据。

p-值基于用于平均值的多重比较（Dunnett对比）的max-t检验，使用针对野生型Tx430的异方差一致性协方差估计（E.Herberich等，PLoSOne.5(3):e9788（2010））。

NS=不显著

表8.通过半补充系x Col-0野生型杂交产生的单个拟南芥F2家族的表型数据的分析。SSU-MSH1指的是用质体靶向形式的MSH1转化的系；AOX-MSH1指的是含有线粒体靶向形式的MSH1转基因的系。在所有使用半补充的遗传实验中，用基于PCR的试验证实了转基因的存在。

P值是基于双侧Student t-检验，与Col-0比较

NS=不显著

表9.对于四个DMR的样品差异甲基化数据，通过来自拟南芥野生型Col-0和MSH1-epiF3系的重亚硫酸盐处理的DNA的基于PCR的分析来产生。

表10.研究中使用的引物

用于重亚硫酸盐测序：

引物名称序列(SEQ ID NO:)

AT5G67120RING-F5’-TTTTTAGGAATTATTGAGTATTATTGA-3’(SEQ ID NO:17)

AT5G67120RING-R5’-AAATAAAAATCATACCCACATCCC-3’(SEQID NO:18)

AT1G20690SWI-F5’-TGTTGAATTATTAAGATATTTAAGAT-3’(SEQ ID NO:19)

AT1G20690SWI-R5’-TCAACCAATAAAAATTACCATCTAC-3’(SEQ ID NO:20)

AT3g271501stMir2-F5’-TAAGTTTTTTTTAAGAGTTTGTATTTGTAT-3’(SEQ ID NO:21)

AT3g271501stMir2-R5’-TAAAAATAATCAAAACCTAACTTAC-3’(SEQ ID NO:22)

AT3g271502ndMir2-F5’-ATTGTTTATTAAATGTTTTTTAGTT-3’(SEQID NO:23)

AT3g271502ndMir2-R5’-CTAACAATTCCCAAAACCCTTATC-3’(SEQID NO:24)

用于MSH1-RNAi转基因的PCR分析:

RNAi-F5’-GTGTACTCATCTGGATCTGTATTG-3’(SEQ ID NO:25)

RNAi-R5’-GGTTGAGGAGCCTGAATCTCTGAAC-3’(SEQ IDNO:26)

表11.拟南芥Col-0和MSH1-epiF3植物中的全基因组5-甲基胞嘧啶分析

源自MSH1-dr选择株与野生型杂交的植物表型没有表现为类似于从其他类型的诱导甲基化改变报道的那些植物表型，即使甲基化组变化在所得到的群体中是明显的。由包括拟南芥metl突变体的杂交产生的EpiRIL群体产生多种变异体表型（J.Reinders等，Genes Dev.23，939（2009））。然而，这些较早的研究没有报道对于MSH1操纵看到的增强的活力、明显较大的植物和茎大小或更高的种子产量。

以下描述了该实施例中所用的材料和方法。

植物材料和生长条件

拟南芥Col-0和msh1突变系获自拟南芥储备中心，并且在地下混合(metro mix)中22℃下生长在12hr日光下。通过将MSH1-dr系与野生型植物杂交来产生MSH1-epi系。对4周大的植物测量拟南芥植物生物量和莲座丛直径。拟南芥开花时间测量为第一可见花蕾出现的日子。对于半补充杂交，线粒体（AOX-MSH1）和质体（SSU-MSH1）补充的纯合系与Columbia-0野生型植物杂交。将各个F1植物对于转基因和野生型MSH1等位基因进行基因分型，并单独地收获。评价来自AOX-MSH1xCol-0的三个F2家族和来自SSU-MSH1x Col-0的两个F2家族的生长参数。所有家族生长在相同条件下，并且测量生物量、莲座丛直径和开花时间。双侧Student t-检验用于计算p-值。

这些实验中所用的高粱种质源自Tx430，一种近交高粱系（Miller，1984）。几个T3高粱姐妹株源自单一MSH1-dr植物，生长在温室条件下，并且命名为GAII1-AGII30。证实这些系中的各系是转基因空白的。其中六个，GAII11、GAII15、GAII22、GAII24、GAII25和GAII28用作在与野生型近交系Tx430的杂交中用作母本以得到F1种子。三种另外的植物，GAII22、GAII23和GAII27用作正反交中的父本。温室中的白天温度为79至83℉，和晚上温度为69至73℉。植物生长在短（10-hr）日照长度下。

F1后代生长在相同温室条件下，后代大小范围为5-19个个体。产生的T4后代从六个使用的母本msh1-dr植物生长以得到F1（GAII11、GAII15、GAII22、GAII24、GAII25和GAII28），群体大小范围为15-19个个体。每个F1植物的自花授粉种子单独收集以得到相应的F2家族。

田间实验

在2010年和2011年夏季，F2家族生长在两个田间实验中生长，所述实验建立在林肯的内布拉斯加大学的Havelock Experiment Station的雨灌条件下。以不完全的区组设计安排实验，2010年实验由15个区组的一个重复和30项/区组（30x15α网格）组成。单个的系以单穗/排计划来种植，5-m长的单排地块，排之间间隔0.75-m。从单个植物收获F3种子。

2011年实验包括各28项的七个区组（28x7α网格），两个重复，用100kg/ha剂量的补充氮施肥。选择四十八个来自2010年实验的样品以构成F3。这些样品源自所有六个初始杂交，并且包括高和低F2籽粒产量值。此外，基于干穗重，选择了17个F3样品的温室生长亚组以得到F4种子。因此，2011年田间实验包括分别对应于F2、F3和F4代的48、77和42项，使用野生型Tx430作为对照。

高粱表型评估

在2010年和2011年田间实验中，记录的高粱表型性状包括植物高度（PH）（以从地面至穗尖的cm计）、穗长（PL）（以从穗基到穗尖的cm计）、新鲜和干穗重（FPW和DPW）（g）、新鲜和干生物质产量（FBY和DBY）（g）以及净籽粒产量（NGY）（g）。用于PH、PL、FPW、DPW和NGY的样品大小从五至十个随机的排内植物/排。测量FPW时，在用于自交的开花期前将健康的、形状良好的头装袋，并且在生理成熟后收获。将样品在80℉下干燥30天，接着测量DPW和NGY。生物质样品由三个植物样品组成，在切割以获得FBW后装袋并称重。植物经过随机的排内选择的，并且将样品在160℉下完全干燥15天以获得DBW。

用于RNAi转基因的PCR分析

用于高粱材料中MSH1-RNAi转基因存在的PCR分析使用了表S7中所列的引物。反应条件为：95℃5min，95℃30s的30个循环，55℃1min，75℃2min；最后延伸为72℃10min。分别包括来自证实的转基因系和野生型Tx430的阳性对照和阴性对照。

重亚硫酸盐处理的基因组文库构建和测序

将从Col-0和epi-F3植物制备的拟南芥基因组DNA（ca15ug）进行超声处理至200bp至600bp的峰范围，进行苯酚/氯仿纯化，并且乙醇沉淀。用Mung Bean核酸酶（New England Biolabs）处理超声处理的DNA（ca12ug），苯酚/氯仿萃取，并且乙醇沉淀。将Mung Bean核酸酶处理的基因组DNA（ca3ug）末端修复，并且用Illumina基因组DNA样品制备试剂盒（Illumina，San Diego，CA）将3’-端腺苷酸化。然后将腺苷酸化的DNA片段连接到甲基化接头（Illumina，San Diego，CA）上。然后将样品柱纯化，并且在琼脂糖中分级。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）凝胶纯化280bp至400bp的级分。将另一3ug Mung Bean核酸酶处理的基因组DNA用于重复该过程，并且将两个级分合并，并根据制造商的说明使用MethylEasy Xceed试剂盒（Human Genetic Signatures Pty Ltd，North Ryde，澳大利亚）进行重亚硫酸钠处理。使用来自作为输入模板的总共30ul重亚硫酸盐处理的DNA的10ul，进行三个独立的文库PCR富集。PCR反应混合物是10ul DNA，5ul10x pfu Turbo Cx缓冲液，0.7ul PE1.0引物，0.7ul PE2.0引物，0.5uldNTP（25mM），1ul Pfu Turbo Cx Hotstart DNA聚合酶（Stratagene，SantaClara，CA），和水以达到50ul的总体积。PCR参数是95℃，2min，接着95℃30sec的12个循环，65℃30sec和72℃1min，然后72℃5min。将PCR产物柱纯化，并且将来自各个PCR反应的等体积合并在一起至10nM的终浓度。

在Illumina基因组分析仪II上将文库进行DNA测序，使用三个36-循环TrueSeq测序试剂盒v5以阅读来自各个插入片段的单一末端的116个核苷酸的序列（V8实验方案）。

用于PCR分析的DNA的重亚硫酸盐处理

根据制造商的说明，使用MethylEasy Xceed试剂盒对拟南芥基因组DNA进行重亚硫酸盐处理。使用表S7中所列的引物进行PCR，并且克隆PCR产物（Topo TA克隆试剂盒，Invitrogen）和DNA测序。使用T-Coffee多序列比对服务器进行序列比对（C Notredame等，J Mol Biol.302:205-217，2000）。

DNA序列分析和差异甲基化的胞嘧啶（DMC）的鉴定

使用Bismark（F Krueger，SR Andrews.Bioinformatics27:1571-1572（2011））将Fastq文件与TAIR10参照基因组比对，其还用于确定胞嘧啶的甲基化状态。在阅读片段的前50个核苷酸中允许一个错配。Bismark只保留在可以独特地映射于基因组中的位置的阅读片段。

只有在对于至少一个基因型的至少两个阅读片段中鉴定为甲基化的胞嘧啶和在各个基因型中至少测序四次的胞嘧啶位置才用于DMC的鉴定。对于这些胞嘧啶位置，使用R（http://www.r-project.org）将表示各个基因型的甲基化或非甲基化的阅读片段数制成表格。进行Fisher’s精密检验用于测试各个位置的差异甲基化。如Storey和Tibshirani（JDStorey，R Tibshirani.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:9440-9445（2003））建议的进行完整基因组的多重测试的调节，并且将0.05的假发现率（FDR）用于鉴定差异甲基化的胞嘧啶。已经将甲基化组序列数据上载至Gene Expression Omnibus，登录号为GSE36783。

将DMC映射于基因组环境中，并且鉴定差异甲基化的区域（DMR）

将TAIR10注释（可在互联网ftp站点ftp.arabidopsis.org/home/tair/Genes/TAIR10_genome_release/TAIR10_gff3上获得）用于确定DMC或基因编码区、5’-UTR、3’-UTR、内含子、假基因、非编码RNA、可转位元件基因和基因间区域中的非差异甲基化胞嘧啶的计数。基因间区域定义为不对应于任何注解特征的区域。

对于各个甲基化情况（CpG、CHG、CHH），使用100-bp增量的1-kb窗口扫描基因组的富含DMC的区域，。保留具有至少四个DMC的窗口，并且将重叠窗口并入区域中。保留具有至少10个DMC的区域，将边界修整至区域中最远的DMC。然后通过将区域中所有胞嘧啶位置处的所有甲基化/非甲基化阅读片段计数合并而对各个区域进行Fisher’s精密检验。对于所有测试的区域进行调节，将FDR控制在0.1。

实施例10.核酸序列和SEQ ID NO的概要表格

表12.序列表中提供的核苷酸序列

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尽管已经说明和描述了本发明的原理，但本领域技术人员应当清楚本发明可以在排列和细节上改变而不脱离这些原理。

尽管已经根据各种实施方案和说明性实施例描述了本发明的材料和方法，本领域技术人员很清楚可以将改变应用于本文中所述的材料和方法而不脱离本发明的概念、精神和范围。本领域技术人员清楚的所有这样的相似取代和改变被视为在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。

Claims (43)

1.一种用于产生呈现出有用性状的植物的方法，其包括步骤：

a.抑制第一亲本植物或植物细胞中一个或多个MSH1基因的表达；

b.将步骤（a）的所述亲本植物、步骤（a）的所述亲本植物的后代、获自步骤（a）的所述植物细胞的植物，或获自步骤（a）的所述植物细胞的植物的后代与其中MSH1未受抑制的第二植物异型杂交；

c.针对至少一种有用的性状筛选获自所述步骤（b）的异型杂交的后代植物群体，其中所述后代植物群体的一部分表达MSH1；和

d.选择表达MSH1的包含所述性状的后代植物，其中所述性状是可遗传的且可逆的。

2.权利要求1的方法，其中所述性状与一个或多个改变的染色体位点相关。

3.一种用于产生呈现出有用性状的植物的方法，其包括步骤：

a.抑制第一亲本植物或植物细胞中一个或多个MSH1基因的表达；

b.将步骤（a）的所述亲本植物、步骤（a）的所述亲本植物的后代、获自步骤（a）的所述植物细胞的植物、或获自步骤（a）的所述植物细胞的植物的后代与其中MSH1未受抑制的第二植物异型杂交；

c.针对至少一种有用的性状筛选获自所述步骤（b）的异型杂交的后代植物群体，其中所述后代植物群的一部分表达MSH1；和

d.选择表达MSH1的包含所述性状的后代植物，其中所述性状与一个或多个突变的染色体位点相关。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述方法进一步包括从以下植物产生种子的步骤：i）步骤（d）的自交后代植物，ii）步骤（d）的异型杂交后代植物，或iii）来自步骤（d）的自交和异型杂交后代植物两者。

5.权利要求4的方法，其中所述方法进一步包括分析所述种子或从所述种子生长的植物中所述性状的存在的步骤。

6.权利要求1-3任一项的方法，其中所述第一亲本植物或植物细胞包含可以抑制MSH1表达的转基因。

7.权利要求6的方法，其中所述转基因选自通过产生小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA来抑制MSH1表达的转基因的组。

8.权利要求1或2的方法，其中通过将雌性植物与不同的雄性植物杂交来获得所述的第一亲本植物或植物细胞，其中所述雌性或雄性植物中的至少一个包含抑制所述亲本植物的内源性MSH1基因表达的转基因，并且其中所述植物在引入所述转基因之前是等基因近交系。

9.权利要求1-3任一项的方法，其中在所述第一亲本植物或植物细胞中的MSH1抑制之前，所述第一亲本植物或植物细胞与所述第二亲本植物是等基因的。

10.权利要求1-3任一项的方法，其中所述性状选自产量、雄性不育、不开花、生物应激和非生物应激。

11.权利要求10的方法，其中所述性状不是通过所述后代植物的线粒体中的亚化学计量转移（SSS）引起的。

12.权利要求10的方法，其中所述性状是雄性不育，并且不是通过所述后代植物的线粒体中的亚化学计量转移（SSS）引起的。

13.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤（d）中的所述后代植物或其后代与未发生MSH1表达抑制但其他方面与所述第一亲本植物或植物细胞等基因的植物相比呈现出所述性状的改善。

14.权利要求1-3任一项的方法，其中所述植物是作物植物。

15.权利要求14的方法，其中所述作物植物选自玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、小麦、水稻、西红柿、烟草、粟和高粱。

16.权利要求15的方法，其中所述作物是高粱。

17.权利要求16的方法，其中所述性状选自穗长、穗重、干生物量及其组合。

18.通过权利要求1-3任一项的方法产生的植物，其中所述植物与未发生MSH1表达抑制但其他方面与所述第一亲本植物或植物细胞等基因的植物相比呈现出至少一种有用性状的改善。

19.权利要求18的植物，其中所述植物是近交的。

20.从权利要求18的植物获得的种子，其中所述种子或从其获得的植物呈现出至少一种有用性状的改善。

21.一种来自权利要求18的植物或其种子的加工产品，其中所述产品包含可检测量的染色体DNA，所述DNA在一个或多个染色体位点中包含一个或多个由MSH1抑制诱导的并且与有用性状的改善相关的改变。

22.权利要求21的加工产品，其中所述产品是油、粗粉、棉绒、外壳或滤饼。

23.一种用于产生一批种子的方法，包括将权利要求18的植物群体自交，并由此收获种子的步骤，其中收获的种子或从其获得的植物呈现出至少一种有用性状的改善。

24.一种用于鉴定植物中可以赋予有用性状的一个或多个改变的染色体位点的方法，其包括步骤：

a）将没有呈现出所述有用性状的参照植物中的一个或多个染色体区域与呈现出所述有用性状的测试植物中的一个或多个相应染色体区域相比较，其中所述测试植物表达MSH1并且获自其中MSH1已经抑制的亲本植物或植物细胞；和

b）选择不存在于所述参照植物中的而存在于所述测试植物中的并且与所述有用性状相关的一个或多个改变的染色体位点。

25.权利要求24的方法，其中所述改变的染色体位点包括染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合。

26.权利要求24的方法，其中所述选择包括分离包含所述改变的染色体位点的植物或后代植物或者获得与所述改变的染色体位点相关的核酸。

27.权利要求24的方法，其中所述参照植物和所述测试植物都是获自从其中MSH1已经抑制的亲本植物或植物细胞获得的后代植物群体。

28.权利要求24的方法，其中所述参照植物和所述亲本植物或植物细胞在所述亲本植物或植物细胞中的MSH1抑制之前是等基因的。

29.权利要求24-28任一项的方法，其中所述有用性状选自产量、雄性不育、不开花、生物应激抗性、非生物应激抗性、增强的耐倒伏性、提高的生长速率、提高的生物量、增强的分蘖、增强的分枝、延迟的开花时间和延迟的衰老。

30.通过权利要求24-28任一项的方法鉴定的植物的改变的染色体位点。

31.包含权利要求30的改变的染色体位点的植物。

32.一种用于产生呈现出有用性状的植物的方法，其包括步骤：

a.将与有用性状相关的染色体修饰引入植物中，其中所述染色体修饰包括与所述有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点、提供与所述有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与所述有用性状相关的由MSH1抑制诱导的改变的染色体位点相同遗传效应的染色体突变；和，

b.选择包含所述染色体修饰并呈现出所述有用性状的植物。

33.权利要求32的方法，其中所述方法进一步包括从以下植物产生种子的步骤：i）步骤（b）的所述选择植物的自交后代植物，ii）步骤（b）的所述选择植物的异型杂交后代，或iii）来自步骤（b）的所述选择植物的自交和异型杂交两者的后代植物。

34.权利要求32的方法，其中所述染色体修饰包括改变的染色体位点，并且其中通过分析与所述改变的染色体位点相关的染色体DNA甲基化状态的存在、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰的存在或其任意组合来选择所述植物。

35.权利要求32的方法，其中所述染色体修饰包括所述转基因或所述染色体突变，并且其中通过分析所述转基因或所述染色体突变的存在来选择所述植物。

36.权利要求32的方法，其中通过分析所述有用性状的存在来选择所述植物。

37.权利要求32的方法，其中所述染色体修饰包括改变的染色体位点并且其中所述改变的染色体位点包括染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任何组合。

38.权利要求32的方法，其中所述改变的染色体位点具有包括基因表达降低的遗传效应，并且其中所述染色体修饰包括提供所述基因的表达降低的转基因或染色体突变。

39.权利要求38的方法，其中所述转基因通过产生针对所述基因的小抑制RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、共同抑制正义RNA和/或反义RNA来降低所述基因的表达。

40.权利要求32的方法，其中所述改变的染色体位点具有包括提高基因表达的遗传效应并且其中所述染色体修饰包括提供所述基因的表达提高的转基因或染色体突变。

41.权利要求32-40任一项的方法，其中所述有用性状选自产量、雄性不育、不开花、生物应激抗性和非生物应激抗性。

42.权利要求32-40任一项的方法，其中所述有用性状选自增强的抗倒伏性、提高的生长速率、提高的生物量、增强的分蘖、增强的分枝、延迟的开花时间和延迟的衰老。

43.通过权利要求32-40任一项的方法产生的植物。

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