CN110904257B - 一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物及其应用 - Google Patents

一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物及其应用。通过对水稻及杂草稻种群的耐冷性比较及OsICE1基因启动子区域的甲基化比较，根据启动子区域特异甲基化位点，设计了基于DNA甲基化的比较水稻和杂草稻耐冷性差异的分子标记引物，分别为pOsICE1‑CT、pOsICE1‑ICTI、pOsICE1‑ICTII和pOsICE1‑CS，分别用于耐冷、中度耐冷及冷敏感水稻和杂草稻种群筛选。利用该引物对水稻和杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定，可实现水稻及杂草稻活体植株快速的耐冷性筛选与比较。方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于水稻耐冷品种选育及杂草稻耐冷性比较。

Description

一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分 子标记引物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学与植物遗传工程领域，具体涉及一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物及其应用。
背景技术
低温是经常发生且危害严重的逆境因素之一，严重危害植物的分布范围及作物产量。植物应对低温的响应并非是完全被动的，而是一种积极主动的应对过程。自然界许多的植物在遭受非冻害伤害后，植株的抗冷性会增强，这就是所谓的冷驯化现象。但是，热带和亚热带起源的植物对温度条件要求比较高，无法适应骤冷温度(0～15℃)。水稻是世界上重要的粮食来源，广泛种植于热带、亚热带及温带地区。水稻低温冷害是全球性自然灾害，在许多国家均有发生，严重影响水稻产量与品质，对世界粮食生产安全也造成了不小的影响。我国水稻种植范围广泛，所有稻区均有冷害发生，每4～5年就有一次较大冷害发生，造成水稻产量损失50～100亿kg。水稻冷害主要发生在苗期与生殖生长期，我国南方双季稻区早稻播种后，幼苗生长期的温度一般低于20℃，寒潮低温天气会导致水稻叶片变黄、生长延迟，甚至叶片卷曲或死亡，生育期的推迟严重影响晚稻的产量与品质。2008年初我国南方遭遇严重低温冰雪天气，华南地区已播种的杂交水稻制种亲本遭受了极大的损失。目前，我国耐冷性水稻品种主要是适于高纬度地区种植的粳稻品种，而南方稻区籼稻的耐冷品种培育尚未取得突破性的进展。
水稻耐冷性已经得到了广泛的研究，有研究表明，耐冷相关QTLs(quantitativetrait locus)的积累是增加植株耐冷性及高纬度适应能力的一个重要原因，比如qCTS12等。水稻种群的耐冷性与纬度分布范围显著相关，粳稻种群耐冷性和纬度分布范围显著高于籼稻种群，这种耐冷性差异除与耐冷相关QTLs积累有关外，还与水稻耐冷基因的SNPs有关，如OsMYB2基因第二外显子上的非同义SNPs，水稻染色体11325395位点的SNP导致粳稻与籼稻该位点的氨基酸分别为Cys与Tyr，染色体11325747位点SNP导致粳稻与籼稻该位点的氨基酸分别为Trp与Arg，进一步分析发现中国高纬度水稻种群这两个位点为Cys和Trp，而低纬度水稻种群则为Tyr与Arg，这两个SNPs导致OsMYB2基因功能有一定差异，可能参与了粳稻与籼稻在纬度分布上的分化。CHILLING TOLERANCE DIVERGENCE(COLD1)基因第四外显子上的SNP，使粳稻与籼稻第187位氨基酸存在差异，粳稻第187位氨基酸为Lys，而籼稻则为Met或Thr，转基因验证表明该位点的SNP是导致粳稻耐冷性高于籼稻的一个原因。用耐冷粳稻品种与冷敏感籼稻品种人工杂交构建重组自交系，在第12号染色体精细定位了1个苗期耐冷性的主效QTLqCTS12。然而这些耐冷基因没有能够很好的应用到水稻生产中，而且传统水稻耐冷品种选育技术耗时长、费用高，因此迫切需要建立快速的水稻活体植株耐冷性评估技术体系。
植物低温响应信号通路中研究最为详细是CBF低温响应转录途径，涉及到水稻CBF通路的耐冷基因已知有OsDREB1A/CBF3、OsDREB1B/CBF1、OsDREB1C/CBF2、OsDREB1D、OsDREB1F、OsDREB2A及OsDREB2B等，CBF低温响应转录通路在杂草稻低温响应过程中同样发挥重要作用，低温条件下耐冷种群中冷诱导基因的相对表达量显著高于冷敏感种群的表达量。研究表明，水稻耐冷性分化可能与CBF通路的ICE1基因甲基化有关。DNA甲基化是一种重要的表观调控机制，在调节基因表达、生长发育、逆境响应等过程中发挥重要的作用。研究表明，启动子区域胞嘧啶的甲基化能够负调控基因的表达。我们前期的研究表明，ICE1基因的去甲基化导致外来入侵植物紫茎泽兰耐寒性增强，驱动其在中国迅速向北成功入侵扩散(Xie et al.,2015)，DNA甲基化参与水稻与杂草稻耐冷性分化仍未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物及其应用，通过对中国100个杂草稻种群及伴生水稻的耐冷性分化进行比较及典型耐冷种群CBF通路基因相对表达量，进一步研究OsICE1基因DNA甲基化与种群耐冷性的关系，发掘耐冷基因的甲基化特异位点，开发基于DNA甲基化的水稻与杂草稻耐冷性筛选的分子标记引物，建立水稻与杂草稻活体植株快速耐冷性评估技术体系，为水稻耐冷品种选育及杂草稻耐冷性比较提供技术。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物，所述分子标记引物为pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTI、pOsICE1-ICTII、pOsICE1-CS中的一种；其中，
所述分子标记引物pOsICE1-CT是由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；
所述分子标记引物pOsICE1-ICTI是由核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；
所述分子标记引物pOsICE1-ICTII是由核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；
所述分子标记引物pOsICE1-CS是由核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的下游引物组成。
一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物在水稻耐冷品种选育及杂草稻耐冷性比较中的应用。
上述应用是以亚硫酸氢盐处理后的水稻或杂草稻基因组为模板，用所述分子标记引物pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTI、pOsICE1-ICTII、pOsICE1-CS中的一种进行PCR扩增，然后对扩增产物进行凝胶成像仪扫描记录结果。
进一步地，所述PCR扩增反应具体如下：
PCR反应体系为：亚硫酸盐修饰后的基因组DNA 100ng、dNTP Mixture 6μL、10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5μL、25mM MgCl2 5μL、10μM的上下游引物各2.0μL、EpiTaqHS 1.25U，用ddH2O补足至50μL；
PCR反应程序为：98℃20s；98℃10s，55℃至45℃Δ1℃40s，72℃45s，循环10次；98℃10s，45℃40s，72℃45s，循环30次；60℃30min；4℃保存；
所述分子标记引物pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTI、pOsICE1-ICTII和pOsICE1-CS的扩增产物用凝胶成像仪扫描记录结果，并连接PMD19-T载体进行克隆测序。
进一步地，所述分子标记引物pOsICE1-CT可扩增出343bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-402位点处发生甲基化，则为耐冷性水稻或杂草稻种群。
进一步地，所述分子标记引物pOsICE1-ICTI可扩增出343bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-385、-396、-402和-405位点处发生甲基化，则为中度耐冷种群I，其耐冷性小于所述耐冷性水稻。
进一步地，所述分子标记引物pOsICE1-ICTII可扩增出347bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-393、-396、-402、-405和-409位点处发生甲基化，则为中度耐冷种群II，其耐冷性小于所述中度耐冷种群I。
进一步地，所述分子标记引物pOsICE1-CS可扩增出123bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-405、-425、-437、-503和-528位点处发生甲基化，则为冷敏感水稻或杂草稻种群，所述冷敏感水稻的耐冷性小于所述中度耐冷种群II。
本发明的有益效果如下：
(1)快速检测：利用本发明耐冷性筛选的分子标记引物，可在一天内完成水稻与杂草稻耐冷性比较，大大缩短检测周期。
(2)活体检测：与传统耐冷选育技术相比，本发明耐冷性筛选的分子标记引物可以实现水稻与杂草稻植株的活体检测，快速无损比较其耐冷性，不影响植物成长。
(3)可同时进行多个植株耐冷性比较，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率、缩短水稻品种的育种周期。
(4)通过分子标记引物进行PCR扩增，减少了检测结果的误差性，提高了选育结果的准确性。
附图说明
图1为低温处理后杂草稻和水稻的耐冷性及光合参数变化；
图1中：a为杂草稻；b为水稻；
图2为典型耐冷性杂草稻和水稻种群CBF通路基因表达模式研究；
图2中：(a)为OsICE1；(b)为OsCBF1；(c)为OsCBF2；(d)为OsCBF3；(e)为OsMYB2；图中小写字母代表种群间差异显著性，P<0.05；
图3为不同杂草稻和水稻种群OsICE1基因启动子区域CHG、CHH甲基化程度与种群耐冷性及采集地环境因子相关性分析；
图3中：△为杂草稻；□为水稻；
图4为水稻与杂草稻耐冷性分子标记引物扩增结果；
图4中：A为pOsICE1-CT；B为pOsICE1-ICTI；C为pOsICE1-ICTII；D为pOsICE1-CS。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明的技术方案采取以下思路：100个水稻和杂草稻种群的耐冷性、CBF通路基因相对表达量及OsICE1基因启动子区域CHG和CHH的甲基化程度存在差异显著性，且耐冷性、基因表达量与甲基化程度显著负相关。通过不同耐冷性水稻及杂草稻种群OsICE1基因启动子甲基化位点比较发现，甲基化差异位点集中分布于-385～-547bp之间，根据不同耐冷种群的特异性甲基化位点设计甲基化扩增引物，用于不同耐冷性水稻及杂草稻种群鉴定。
引物设计原理如下：植物DNA序列在用亚硫酸氢盐处理时，DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，用PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断该位点是否发生甲基化。通过对100个水稻和杂草稻种群OsICE1基因启动子区域甲基化测定发现，不同耐冷种群在-385～-547bp间存在特异性位点，冷敏感种群在-385、-391、-393、-396、-402、-405、-425、-437、-503、-528和-547共11个特异位点均发生了甲基化，中度耐冷种群II在-385、-391、-393、-396、-402、-405、-409、-437和-547共9个特异位点发生甲基化，中度耐冷种群I在-385、-396、-402和-405共4个特异位点发生甲基化，而耐冷种群仅在-402位点处发生甲基化。耐冷种群与其他种群相比，在-385、-396和-405位点均未发生甲基化，设计引物时可直接转化为T，据此设计耐冷种群鉴定的上游引物SEQ ID NO:1，序列为TAGCAGATATAGTTTATTTATAG，与下游引物SEQ ID NO:2：ACTCRCTAACTATAACRATATTT进行PCR扩增(下游引物可根据产物长度要求，设计其他引物)；中度耐冷种群I与中度耐冷种群II及冷敏感种群相比，均在-385、-396、-402和-405位点发生甲基化，但中度耐冷种群I在-391、-393位点处未发生甲基化，因此在设计正向引物时，-385、-396、-402和-405位点保持C不变，-391、-393位点中的一个或两个突变为T，正向引物SEQ ID NO:3-5，SEQ ID NO:3序列为CAGCAGATACAGTTTATTTACAG，SEQ ID NO:4序列为CAGCAGATACAGCTTATTTACAG，SEQ ID NO:5序列为CAGCAGATACAGTTCATTTACAG，分别与下游引物SEQ ID NO:2进行PCR扩增；中度耐冷种群II与冷敏感种群相比，在-393、-396、-402和-405位点均发生甲基化，但中度耐冷种群II在-409位点发生特异甲基化，因此根据此序列设计引物时保持这5个位点为C，正向引物SEQID NO:6序列为ATTCAATCAGCAGATACAGC，与下游引物SEQ ID NO:2进行PCR扩增；冷敏感种群与其他种群相比，在-503和-528位点发生特异甲基化，设计引物时仍为C，根据此序列设计反向引物SEQ ID NO:8：CTRATTAAATAAAACRATAAAAARAC，在-405～-437bp区域设计正向引物SEQ ID NO:7：CCGTAAGTACGTAAGGAGATAAGATC，进行PCR扩增。
基于上述水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物在水稻耐冷品种选育及杂草稻耐冷性比较中的应用，包括以下步骤：
(1)水稻及杂草稻DNA提取。
(2)提取的DNA用亚硫酸氢盐处理，制备模板DNA。
(3)合成引物。
(4)PCR扩增：
PCR反应体系为：亚硫酸盐修饰后的基因组DNA 100ng、dNTP Mixture 6μL、10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5μL、MgCl2 5μL(25mM)、上下游引物各2.0μL(10μM)、EpiTaqHS 1.25U，用ddH2O补足至50μL；
PCR反应程序：98℃20s；98℃10s，55℃to 45℃Δ1℃40s，72℃45s，10cycles；98℃10s，45℃40s，72℃45s，30cycles；60℃30min；4℃保存；
扩增产物用凝胶成像仪扫描记录结果，并连接PMD19-T载体进行克隆测序。
(5)结果判断
若以pOsICE1-CT为引物扩增出343bp大小条带，为耐冷性水稻或杂草稻；以pOsICE1-ICTI为引物扩增出343bp大小条带，为中度耐冷种群I；以pOsICE1-ICTII引物扩增出347bp大小条带，为中度耐冷种群II；以pOsICE1-CS为引物可扩增出123bp大小条带，则为冷敏感水稻或杂草稻(表1)。
表1水稻与杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物
实施例1水稻与杂草稻种群耐冷性比较
选取籽粒饱满的种子于50℃下处理48h，以破除种子休眠，破休眠的种子用70％酒精消毒30s，然后浸泡在无菌水中15min，再用无菌水反复冲洗种子5次。消毒后的种子浸种24h，25℃下催芽4d，将萌发的种子播种于土壤中培养(28℃，相对湿度70～80％，光照12h，黑暗12h，光照强度为300μmol·m-2·s-2)。每个采样点选取采集的5个杂草稻单株种子和1个水稻单株种子进行种植，每个单株种植4盆，每盆3棵苗。待幼苗生长至3-4叶期，将3盆幼苗置于5℃下进行低温处理3d(相对湿度70～80％，光照12h，黑暗12h，光照强度为300μmol·m-2·s-2)，1盆作为对照，置于培养箱中正常培养6d。低温处理后于28℃恢复生长3d，调查幼苗的受害程度，计算各种群幼苗的冷害指数，冷害指数＝∑(各级株数×级别数)/(最高级别数×总株数)×100％，植株耐冷性为1-冷害指数。
同样的实验材料用于Imaging-PAM比较各种群的耐冷性。分别选取正常生长与5℃低温处理3d后幼苗叶片，每个种群3棵幼苗，每棵幼苗选取3个叶片，重复3次。叶片荧光参数测定前，材料暗适应30min。进行荧光诱导动力学曲线测定时，先在弱光下测定暗适应条件下的最小荧光值Fo，然后用饱和脉冲光(2500mmol·m-2·s-1)处理。充分暗适应后，分别测定获取表观电子传递速率(electrontransport rate，ETR)、PSII(photosystem II)实际光合效率(Y(II))、光化学淬灭系数(qP)等参数。荧光参数测定时变量设定如下：幼苗叶片与离电荷耦合元件CCD(charge coupled device)镜头间距离18cm，测定光密度13，频率1，增益为7，衰减为2，饱和脉冲光13。
5℃低温处理3d并于28℃恢复生长3d后，不同种群杂草稻和水稻表型差异明显，北方种群耐冷性强，低温处理后幼苗虽有部分叶卷曲，但整体植株仍呈绿色，与对照植株没有较大差异；中部种群具有中等耐冷性，低温处理后幼苗较多叶片失绿，叶卷曲，植株相比对照矮小，生长明显受抑制；而华南种群耐冷性低，低温处理后幼苗叶片枯黄，植株死亡。
低温处理后，不同地理种群杂草稻和水稻的耐冷性和光合参数变化均存在显著的差异和分化。根据耐冷性可将其分为耐冷、中度耐冷和冷敏感3类。耐冷种群包括14个杂草稻与水稻种群，中度耐冷种群包括I和II两个类群，其中中度耐冷种群I包括23个杂草稻与水稻种群，中度耐冷种群II包括40个杂草稻与水稻种群，冷敏感种群包括23个杂草稻与水稻种群(表2)。
低温胁迫下不同种群的叶绿素光合参数变化明显，实际光合效率Y(II)、相对电子传递速率ETR1、光化学淬灭系数qP逐渐降低，而不同地区杂草稻和水稻种群荧光参数变化存在显著差异。杂草稻的耐冷种群在低温处理3d后Y(II)下降百分率为48～56％，ETR1下降百分率为30～48％，qP下降百分率为35～60％；中度耐冷种群处理3d后Y(II)下降百分率为49～92％，ETR1下降百分率为45～72％，qP下降百分率为39～84％；冷敏感种群处理3d后Y(II)下降百分率为94～97％，ETR1下降百分率为81～100％，qP下降百分率为90～100％。水稻的耐冷种群在低温处理3d后Y(II)下降百分率为43～62％，ETR1下降百分率为32～48％，qP下降百分率为35～49％；中度耐冷种群处理3d后Y(II)下降百分率为60.32～93.48％，ETR1下降百分率为44～85％，qP下降百分率为36～88％；冷敏感种群处理3d后Y(II)下降百分率为94～98％，ETR1下降百分率为81～100％，qP下降百分率为91～100％。耐冷种群的杂草稻和水稻叶绿素荧光参数下降幅度低，中度耐冷种群叶绿素荧光参数下降幅度次之，而敏感种群下降幅度最大，说明低温对杂草稻和水稻冷敏感种群的光合反应中心破坏程度大于中度耐冷种群和耐冷种群(图1)。
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实施例2杂草稻与水稻典型耐冷种群CBF通路基因表达模式研究
以杂草稻耐冷种群WRLN004、中度耐冷种群WRJS023、冷敏感种群WRGD008及对应的水稻种群WRLN004R、WRJS023R和WRGD008R为实验材料，测定CBF通路基因表达量。以典型种群的5个杂草稻单株和3个水稻单株种子为材料，每个单株选取8株长势一致的3叶期幼苗进行5℃低温处理，取冷处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h和24h的幼苗叶片各0.1g，提取叶片RNA，利用Real-time PCR比较不同种群间OsICE1、OsCBF1、OsCBF2、OsCBF3和OsMYB2基因表达模式，各种群杂草稻、水稻单株RNA分别提取及反转录3次，每次cDNA进行3次Real-timePCR实验。
5℃低温处理条件下，杂草稻典型耐冷种群WRLN004、中度耐冷种群WRJS023、冷敏感种群WRGD008及对应的水稻WRLN004R、WRJS023R和WRGD008R种群耐冷性，与CBF通路中OsICE1、OsCBF1、OsCBF2、OsCBF3和OsMYB2基因的表达量显著相关(图2)。
低温处理后，不同耐冷杂草稻和水稻种群OsICE1基因的表达水平不同。整体趋势而言，各种群的OsICE1基因表达量随冷处理时间延长而增加。正常生长条件下各种群基因表达量无差异，且都在较低水平，低温处理1～2h时各种群OsICE1基因表达量没有差异；低温处理4～8h时耐冷种群WRLN004、WRLN004R的OsICE1基因表达量显著高于中度耐冷种群WRJS023、WRJS023R和冷敏感种群WRGD008、WRGD008R的OsICE1基因表达量，而中度耐冷WRJS023、WRJS023R和冷敏感种群WRGD008、WRGD008R的OsICE1基因表达量差异相对较小；低温处理12～24h时耐冷种群WRLN004、WRLN004R的OsICE1基因表达量依然显著高于中度耐冷种群WRJS023、WRJS023R和冷敏感种群WRGD008、WRGD008R的OsICE1基因表达量，而中度耐冷种群WRJS023、WRJS023R的OsICE1基因表达量显著高于冷敏感WRGD008、WRGD008R的OsICE1基因表达量。低温处理过程中，同一地区水稻和杂草稻OsICE1基因表达量整体上没有较大差异，导致了杂草稻和水稻之间的耐冷性没有差异(图2)。
正常生长条件下，不同耐冷性杂草稻和水稻OsCBF1基因表达量无差异，低温处理1h时各种群OsCBF1基因的表达量没有较大差异；低温处理2h时不同耐冷性杂草稻种群间OsCBF1基因表达量不同，而水稻种群间OsCBF1基因表达量无差异。低温处理4～24h后，不同耐冷性杂草稻和水稻OsCBF1基因表达量差异显著，表现为耐冷种群WRLN004、WRLN004R的OsCBF1基因表达量显著高于中度耐冷种群WRJS023、WRJS023R和冷敏感种群WRGD008、WRGD008R的OsCBF1基因表达量，种群间OsCBF1基因表达量差异随低温处理时间的延长而逐渐增加(图2)。
OsCBF2基因作为CBF通路的负调控基因，在低温处理条件下达到峰值的时间早于通路中其他基因。低温处理1～2h时，杂草稻种群OsCBF2基因表达量整体略高于水稻表达量，但不同耐冷性杂草稻或水稻种群之间OsCBF2基因表达量无差异或差异较小。低温处理4～12h后，各种群OsCBF2基因表达量逐渐降低，但耐冷种群WRLN004、WRLN004R中OsCBF2基因表达量降低速度显著高于中度耐冷种群WRJS023、WRJS023R和冷敏感种群WRGD008、WRGD008R，导致耐冷种群中OsCBF2基因表达量显著低于中度耐冷种群的表达量。至低温处理24h后，各种群OsCBF2基因表达量均降低至低水平(图2)。
低温处理下，不同耐冷性杂草稻和水稻种群OsCBF3基因表达量随低温处理时间延长逐渐增加，至12h时达到峰值。在低温处理0～2h时，各种群表达量没有较大差异；在冷处理4～24h时，不同耐冷性种群间OsCBF3基因表达量差异显著，表现为耐冷种群WRLN004、WRLN004R的OsCBF3基因表达量显著高于中等耐冷种群WRJS023、WRJS023R和冷敏感种群WRGD008、WRGD008R的OsCBF3基因表达量(图2)。
低温处理下，不同耐冷性杂草稻和水稻种群OsMYB2基因表达模式与OsICE1、OsCBF1和OsCBF3基因相似，均随低温处理时间延长表达量呈增加趋势。低温处理4h前各种群间OsMYB2基因表达量无差异或差异较小，低温处理8h后不同耐冷性杂草稻和水稻种群OsMYB2基因表达量差异显著，耐冷种群WRLN004、WRLN004R中OsMYB2基因表达量显著高于中度耐冷种群WRJS023、WRJS023R和冷敏感种群WRGD008、WRGD008R。低温处理过程中，同一地区杂草稻和水稻种群间OsMYB2基因表达量整体差异较小或无差异(图2)。
综上所述，不同耐冷性杂草稻和水稻种群CBF通路基因在低温处理初始阶段差异不明显，而随处理时间延长不同耐冷种群间基因表达量差异逐渐增加，除负调控基因OsCBF2外，其余基因表达量与种群耐冷性显著正相关。但同一地区杂草稻和水稻种群间CBF通路基因表达量整体差异较小或无差异，这与同一地区杂草稻和水稻种群耐冷性相似结果一致，表明杂草稻和水稻地理种群发生了在CBF通路基因表达水平的耐冷性共分化。
实施例3杂草稻及水稻OsICE1基因启动子序列的甲基化测定
杂草稻及水稻种群植株培养至3叶期时，分别取各单株叶片0.1g用于叶片DNA提取。分别取各种群杂草稻及水稻单株DNA450ng进行亚硫酸氢盐处理，处理后的DNA用EpiTaqTM HS进行PCR扩增，扩增体系为：亚硫酸盐修饰后的基因组DNA 100ng、dNTP Mixture6μL、10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5μL、MgCl2 5μL(25mM)、上下游引物各2.0μL(10μM)(表3)、EpiTaq HS 1.25U，用ddH2O补足至50μL。OsICE1基因启动子区(ATG上游1000bp)甲基化扩增分3段进行扩增，扩增程序为95℃5min；95℃30s，52℃1min，72℃2min，35cycles；72℃10min。PCR产物连接至pMDTM 19-T Vector Cloning Kit载体，转化Escherichia coliDH5αElectro-cells，然后进行转化子的检测鉴定，挑选10个阳性克隆测序。测序后的序列与OsICE1基因区及启动子区原始序列进行比对，每个CHG、CHH胞嘧啶位点C/(C+T)比例大于50％的位点为甲基化位点。以上实验每个种群系统重复3次。
表3水稻与杂草稻OsICE1基因启动子序列的甲基化测定引物
引物名称 引物序列
P-ICE1-1F 5’-TAATAAAGTAGAGTAAATGTAAAAT-3’
P-ICE1-1R 5’-CCGACAAAAATCACAAAAAAAAAAT-3
P-ICE1-2F 5’-TTTTATAATAAAGTGTTGTTTTATAAA-3’
P-ICE1-2R 5’-AAAAAAAATTTTCTTTATACTATATTC-3
P-ICE1-3F 5’-TTAAATTGTGTGGTGTATATAGAGAAATGT-3’
P-ICE1-3R 5’-CAAAAATACAAAAATACAAAAAACTC-3’
对100个不同杂草稻和水稻种群OsICE1基因启动子甲基化位点进行比较，研究结果显示，不同杂草稻和水稻种群OsICE1基因启动子区域甲基化程度不同。对杂草稻和水稻不同种群OsICE1基因启动子区域甲基化位点比较发现，CG甲基化位点保守性很高，甲基化发生位点较为固定，杂草稻和水稻种群间位点基本相同。不同耐冷性杂草稻和水稻OsICE1基因启动子CHG和CHH甲基化程度不同，在-385～-547bp间存在特异性位点，冷敏感种群在-385、-391、-393、-396、-402、-405、-425、-437、-503、-528和-547共11个特异位点均发生了甲基化，中度耐冷种群II在-385、-391、-393、-396、-402、-405、-409、-437和-547共9个特异位点发生甲基化，中度耐冷种群I在-385、-396、-402和-405共4个特异位点发生甲基化，而耐冷种群仅在-402位点处发生甲基化(表2)。
实施例4杂草稻和水稻种群OsICE1基因启动子CHG和CHH甲基化程度与耐冷性显著相关
对不同杂草稻和水稻种群OsICE1基因启动子区域甲基化程度与种群耐冷性量及采集地环境因子的相关性分析表明，杂草稻和水稻种群OsICE1基因启动子CHG和CHH甲基化程度与种群耐冷性及采样点纬度显著负相关，高纬度耐冷种群甲基化程度低，而低纬度种群甲基化程度高；OsICE1基因启动子CHG和CHH甲基化程度与采样点极端最低温、年均温和移苗月均温显著正相关，温度较低地区的杂草稻和水稻种群甲基化程度较低(图3)。
实施例5典型耐冷杂草稻和水稻种群OsICE1基因启动子甲基化测定
水稻及杂草稻DNA提取。利用天根DNA提取试剂盒，提取典型耐冷杂草稻和水稻种群DNA备用。提取的DNA用亚硫酸氢盐处理，制备模板DNA，具体过程如下：
(1)向0.2mL PCR管中加入130μL配制好的CT Conversion Reagent溶液，加入提取的DNA 500ng，用枪头轻轻吹打几次进行混匀。
(2)98℃10min，64℃2.5h，4℃储存。
(3)在吸附柱管子中加入600μL M-Binding Buffer。
(4)将步骤(2)的产物转移到步骤(3)的管子中，盖紧后上下颠倒几次。
(5)12000rpm离心30s，倒掉废液。
(6)向吸附柱管子中加入100μL M-Wash Buffer，12000rpm离心30s，倒掉废液。
(7)向吸附柱管子底部加入200μL M-Desulphonation Buffer，室温放置20min，12000rpm离心30s，倒掉废液。
(8)向吸附柱管子中加入200μL M-Wash Buffer，12000rpm离心30s，倒掉废液。重复1次。
(9)吸附柱从管子中取出，放到1.5mL离心管中，向吸附柱管子底部加入15μL M-Elution Buffer，12000rpm离心30s，收集离心管中的液体，即位处理好的DNA模板。
PCR反应体系为：亚硫酸盐修饰后的基因组DNA 100ng、dNTP Mixture 6μL、10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5μL、MgCl2 5μL(25mM)、上下游引物各2.0μL(10μM)、EpiTaqHS 1.25U，用ddH2O补足至50μL；
PCR反应程序：98℃20s；98℃10s，55℃to 45℃Δ1℃40s，72℃45s，10cycles；98℃10s，45℃40s，72℃45s，30cycles；60℃30min；4℃保存。
扩增产物用凝胶成像仪扫描记录结果，结果显示，耐冷性水稻或杂草稻用引物pOsICE1-CT可扩增出343bp大小条带，引物pOsICE1-ICTI、pOsICE1-ICTII及pOsICE1-CS均未扩增出条带(图4-A)；中度耐冷种群I用引物pOsICE1-ICTI可扩增出343bp大小条带，引物pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTII及pOsICE1-CS均未扩增出条带(图4-B)；中度耐冷种群II用引物pOsICE1-ICTII了扩增出347bp大小条带，引物pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTI及pOsICE1-CS均未扩增出条带(图4-C)；冷敏感水稻或杂草稻用引物pOsICE1-CS可扩增出123bp大小条带，引物pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTI及pOsICE1-ICTII均未扩增出条带(图4-D)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagcagatat agtttattta tag 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcrctaac tataacrata ttt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcagatac agtttattta cag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcagatac agcttattta cag 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcagatac agttcattta cag 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attcaatcag cagatacagc 20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgtaagtac gtaaggagat aagatc 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctrattaaat aaaacrataa aaarac 26

Claims (1)

1.一种水稻及杂草稻OsICE1基因启动子甲基化测定的特异性分子标记引物在水稻耐冷品种选育及杂草稻耐冷性比较中的应用，其特征在于，所述分子标记引物为pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTI、pOsICE1-ICTII、pOsICE1-CS中的一种；其中，
所述分子标记引物pOsICE1-CT是由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；
所述分子标记引物pOsICE1-ICTI是由核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5所示的上游引物，和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；
所述分子标记引物pOsICE1-ICTII是由核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；
所述分子标记引物pOsICE1-CS是由核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的下游引物组成；
所述应用是以亚硫酸氢盐处理后的水稻或杂草稻基因组为模板，用所述分子标记引物pOsICE1-CT、pOsICE1-ICTI、pOsICE1-ICTII、pOsICE1-CS中的一种进行PCR扩增，然后对扩增产物进行凝胶成像仪扫描记录结果，具体如下：
所述分子标记引物pOsICE1-CT可扩增出343bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-402位点处发生甲基化，则为耐冷性水稻或杂草稻种群；
所述分子标记引物pOsICE1-ICTI可扩增出343bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-385、-396、-402和-405位点处发生甲基化，则为中度耐冷种群I，其耐冷性小于所述耐冷性水稻；
所述分子标记引物pOsICE1-ICTII可扩增出347bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-393、-396、-402、-405和-409位点处发生甲基化，则为中度耐冷种群II，其耐冷性小于所述中度耐冷种群I；
所述分子标记引物pOsICE1-CS可扩增出123bp大小条带，ATG上游从0开始，在启动子-405、-425、-437、-503和-528位点处发生甲基化，则为冷敏感水稻或杂草稻种群，所述冷敏感水稻的耐冷性小于所述中度耐冷种群II。
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水稻冷调控关键蛋白OsICE1和OsICE2的功能机制研究;邓翠云;《万方学位论文》;20180613;第1-65页 *
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