CN103290050A - 一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法,该应用方法通过（1）基因克隆，（2）载体构建，（3）转基因，（4）通过转基因技术分析OsICE2的抗冷表型；（5）转基因植株与对照植株在抗冷生理方面的比较分析等步骤，测定了低温胁迫下OsICE2基因对蛋白质表达量的影响，发现转基因水稻株系可减缓低温胁迫下RuBi sCO subuni t binding-protein alpha subuni t,RuBi sCO activase small isoform precursor，Chlorophyll a-b binding protein和isocitrate dehydrogenase蛋白质的表达量的降低；提高了70 kDa heat shock-related protein蛋白质表达增加的幅度。

Description

一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法。 

背景技术

冷害是一种对作物的生长发育有着重要影响的环境胁迫因子。水稻是我国的主要粮食作物，在其苗期常常遭遇冷害这一问题，从而对水稻的生产带来不利影响。因此研究作物，特别是水稻抗冷性的分子机制、培育抗性种质有着重要的理论意义和应用价值。 

按照低温的不同程度，将植物的低温伤害分为冷害和冻害，冷害是指0℃以上低温引起的植物生理机制障碍，冻害则是指0℃以下低温引起的植物生理机制障碍。植物抗冷性是其抵御低温危害的重要决定因素，抗冷力的强弱是植物长期适应与进化的结果，并受遗传因素的控制。来自于热带与亚热带地区的多数作物，比如水稻、玉米与蕃茄，对于冷害都十分敏感。但是不断增加的证据表明，作物对冷害或冻害的耐受是一系列抗逆性相关基因或蛋白转录活化的结果。 

低温胁迫激活了植物体内基因表达的网络系统，其中许多受冷诱导的早期响应因子是转录因子，这些转录因子继而激活下游更多基因 的转录，从而表现出对低温胁迫的耐受或敏感性。ICE(inducers of CBF expression)编码一个bHLH（basic helix-loop-helix）类型的转录因子,其在拟南芥等植物抗冷过程中发挥着重要的作用。ICE在拟南芥中有两个同分异构体，其中关于AtICEl的功能在拟南芥中研究的比较多。而关于水稻OsICE2基因的克隆及其功能尚未见报道，其在水稻冷害适应中的作用还不清楚。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，旨在解决水稻抗冷性的基因工程问题。 

本发明实施例是这样实现的，一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法,该应用方法包括：（1）基因克隆，（2）载体构建，（3）转基因，（4）通过转基因技术分析OsICE2的抗冷表型；（5）转基因植株与对照植株在抗冷生理、蛋白质表达方面的比较分析。 

进一步，基因克隆方法为： 

在水稻材料日本晴幼苗植株的叶片cDNA中，根据如下引物序列，通过PCR扩增到一个编码完整蛋白质序列的基因，与在核酸序列上与OsICE1有78%相似性；引物序列为： 

ICE2-F:5'–GAGGTTGCCATGGACGAG-3' 

ICE2-R:5'–CGAGCCTCATCTCATCAGT-3' 

进一步，载体构建方法包括： 

表达载体pUbi-OsICE2的构建方法为：根据水稻OsICE2基因的 cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICE2阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为： 

Over ICE2-F:5'–CTGAGGATCCGAGGTTGCCATGGACGAG-3'BamHI 

Over ICE2-R:5'–GTCAGGATCC CGAGCCTCATCTCATCAGT-3'BamHI。 

进一步，转基因包括： 

通过电击法将pUbi-Os ICE2质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μg·mL^-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于-70℃保存，转基因备用。 

取水稻材料日本晴花后15d的幼胚,用75%乙醇浸泡l min,再用25%的次氯酸钠浸泡25-30min,无菌水洗3-4次,用异物针挑出幼胚,接种于诱导培养基上;将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液lml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心lmin，去上清，用含200μmol·L^-1乙酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25℃暗培养60h。 

进一步，通过转基因技术分析OsICE2的抗冷功能，具体步骤为； 

模拟冷胁迫条件，在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因 水稻植株与非转基因水稻植株，待幼苗生长两周后于6℃下培养四天，观察到转基因植株T2-7，T2-16，T2-21的长势优于对照植株（WT），表现在植株高度、叶色和根长性状。 

进一步，转基因植株与对照植株在低温胁迫下的蛋白质表达的变化的测定方法为： 

选用OsICE2转基因水稻T2-7株系和对照植株，在28℃day/25℃night,12h-light/12h-night条件下于人工气候箱中培养，两周后幼苗转入6℃冷胁迫处理12小时，取叶片冷冻于-80℃冰箱中保存； 

采用三氯乙酸/丙酮法提取幼苗叶片总蛋白，并进行蛋白定量。测定低温胁迫下OsICE2基因对蛋白质表达量的影响； 

发现，转基因水稻株系可减缓低温胁迫下RuBi sCO subunit binding-protein alpha subunit,RuBisCO activase small isoform precursor，Chlorophyll a-b binding protein和isocitrate dehydrogenase蛋白质的表达量的降低；提高了70 kDa heat shock-related protein蛋白质表达增加的幅度。 

本发明该应用方法通过（1）基因克隆，（2）载体构建，（3）转基因，（4）通过转基因技术分析Os ICE2的抗冷表型；（5）转基因植株与对照植株在抗冷生理方面的比较分析等步骤，测定了低温胁迫下OsICE2基因对蛋白质表达量的影响，发现转基因水稻株系可减缓低温胁迫下RuBisCO subunit binding-protein alpha subunit,RuBi sCO activase small isoform precursor，Chlorophyll a-b  binding protein和isocitrate dehydrogenase蛋白质的表达量的降低；提高了70kDa heat shock-related protein蛋白质表达增加的幅度。 

附图说明

图1是本发明实施例提供的水稻OsICE2基因超表达载体结构示意图 

图2是本发明实施例提供的转OsICE2水稻与对照植株幼苗经低温处理后的表型 

图3本发明实施例提供的转OsICE2水稻与对照植株幼苗低温处理后的存活率 

图4是本发明实施例提供的转OsICE2水稻与对照植株幼苗经低温处理后的叶片的光化学效率（Fv/Fm）。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

本发明实施例提供的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法,包括以下步骤： 

（1）基因克隆，（2）载体构建，（3）转基因，（4）通过转基因技术分析OsICE2的抗冷表型；（5）转基因植株与对照植株在抗冷生理、 蛋白质表达方面的比较分析。 

（1）基因克隆的具体方法为： 

在水稻材料日本晴幼苗植株的叶片cDNA中，根据如下引物序列，通过PCR扩增到一个编码完整蛋白质序列的基因，与在核酸序列上与OsICE1有78%相似性。 

引物序列： 

ICE2-F:5'–GAGGTTGCCATGGACGAG-3' 

ICE2-R:5'–CGAGCCTCATCTCATCAGT-3' 

>OsICE2核酸序列（1298bp）见序列表。 

>ICE2基因编码的蛋白序列见序列表。 

（2）结合图1，对载体构建的具体方法进行说明，具体方法为： 

表达载体pUbi-OsICE2的构建方法： 

根据水稻OsICE2基因的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICE2阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为： 

Over ICE2-F:5'–CTGAGGATCC GAGGTTGCCATGGACGAG-3'BamHI 

Over ICE2-R:5'–GTCAGGATCC CGAGCCTCATCTCATCAGT-3'BamHI 

（3）转基因的具体方法为： 

通过电击法将pUbi-OsICE2质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μg·mL^-1的YEP固体培 养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于-70℃保存，转基因备用。 

取水稻材料日本晴花后15d的幼胚,用75%乙醇浸泡l min,再用25%的次氯酸钠浸泡25-30min,无菌水洗3-4次,用异物针挑出幼胚,接种于诱导培养基上;将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液lml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心lmin，去上清，用含200μmol·L^-1乙酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25℃暗培养60h; 

（4）通过转基因技术分析OsICE2的抗冷功能的具体方法为： 

模拟冷胁迫条件，在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因水稻植株与非转基因水稻植株（对照植物，WT），待幼苗生长两周后于6℃下培养四天，观察到转基因植株T2-7，T2-16，T2-21的长势优于对照植株（WT），表现在植株高度、叶色和根长等性状。如图2所示。对比结构见表1。 

表1转基因植株T27，T216，T221与植株（WT）对比结果 

（每种材料的植株数为n=10，*为重复间差异显著，p<0.5） 

（5）结合图3和图4，转基因植株与对照植株在抗冷性方面的比较分析的具体方法为： 

1.存活率 

在从冷胁迫处理10天的植株存活率指标来看，过量表达OsICE2转基因植株在6℃冷胁迫处理的存活率也明显高于对照植株，高出大约2.3倍（图3）。 

2.叶绿体PSⅡ的光化学效率（Fv/Fm） 

Fv/Fm是植株对冷胁迫应答的一个主要生理指标。在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因水稻植株与非转基因水稻植株，生长两周后的幼苗于6℃下冷胁迫处理一周。从图中可以看出，过量表达OsICE2转基因植株幼苗（T2-7，T2-16，T2-21）在6℃冷胁迫条件下处理一周的叶绿体PSⅡ的光化学效率（Fv/Fm）明显高于对照植株（图）。 

3.生物量的变化 

在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因水稻植株与非转基因水稻植株，生长两周后的幼苗于6℃下冷胁迫处理一周，然后测定植株的地上部和地下部的鲜重和干重。过量表达OsICE2转基因植株幼苗（T2-7，T2-16，T2-21）在6℃冷胁迫条件下处理一周的植株地上部的鲜重和干重高于对照野生型的植株，地下部的鲜重和干重也明显高于对照植株。 

4.蛋白质表达量的变化 

转基因水稻T2-7株系和对照植株，在28℃day/25℃night,12h-light/12h-night条件下于人工气候箱中培养，两周后幼苗转入6℃冷胁迫处理12小时；采用三氯乙酸/丙酮法提取幼苗叶片总蛋白，测定低温胁迫下OsICE2基因对蛋白质表达量的影响；转基因水稻株系可减缓低温胁迫下RuBisCO subunit binding-protein alpha subunit,RuBisCO activase small isoform precursor，Chlorophyll a-b binding protein和isocitrate dehydrogenase蛋白质的表达量的降低；提高了70kDa heat shock-related protein蛋白质表达增加的幅度。 

表1.转基因植株与对照植株在低温胁迫下的蛋白质表达的变化 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法,其特征在于，该应用方法包括：（1）基因克隆，（2）载体构建，（3）转基因，（4）通过转基因技术分析OsICE2的抗冷表型；（5）转基因植株与对照植株在抗冷生理方面的比较分析；（6）转基因植株与对照植株在低温胁迫下的蛋白质表达的变化。 

2.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，基因克隆方法为： 

在水稻材料日本晴幼苗植株的叶片cDNA中，根据如下引物序列，通过PCR扩增到一个编码完整蛋白质序列的基因，与在核酸序列上与OsICE1有78%相似性；引物序列为： 

ICE2-F:5'–GAGGTTGCCATGGACGAG-3' 

ICE2-R:5'–CGAGCCTCATCTCATCAGT-3' 。

3.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，载体构建方法包括： 

表达载体pUbi-OsICE2的构建方法为：根据水稻OsICE2基因的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICE2阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为： 

Over ICE2-F:5'–CTGAGGATCC GAGGTTGCCATGGACGAG-3'BamHI 

Over ICE2-R:5'–GTCAGGATCC CGAGCCTCATCTCATCAGT-3' BamHI。 

4.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，转基因包括： 

通过电击法将pUbi-Os ICE2质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μg·mL^-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于-70℃保存，转基因备用； 

取水稻材料日本晴花后15d的幼胚,用75%乙醇浸泡l min,再用25%的次氯酸钠浸泡25-30min,无菌水洗3-4次,用异物针挑出幼胚,接种于诱导培养基上;将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液lml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心lmin，去上清，用含200μmol·L^-1乙酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25℃暗培养60h。 

5.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，通过转基因技术分析OsICE2的抗冷功能，具体步骤为； 

模拟冷胁迫条件，在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因水稻植株与非转基因水稻植株，待幼苗生长两周后于6℃下培养四天，观察到转基因植株T2-7，T2-16，T2-21的长势优于对照植株（WT）， 表现在植株高度、叶色和根长性状。 

6.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，转基因植株与对照植株在低温胁迫下的蛋白质表达的变化的测定方法为： 

选用OsICE2转基因水稻T2-7株系和对照植株，在28℃day/25℃night,12h-light/12h-night条件下于人工气候箱中培养，两周后幼苗转入6℃冷胁迫处理12小时，取叶片冷冻于-80℃冰箱中保存； 

采用三氯乙酸/丙酮法提取幼苗叶片总蛋白，并进行蛋白定量。测定低温胁迫下OsICE2基因对蛋白质表达量的影响。 

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