CN103102401A - GmMYB73在培育耐逆性转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GmMYB73在培育耐逆性转基因植物中的应用。本发明提供了GmMYB73蛋白或其编码基因或如下表达载体在培育耐逆性转基因植物中的应用；在上述应用中，所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；所述GmMYB73蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，本发明从大豆中克隆了一个MYB家族的转录因子基因GmMYB73，研究发现，GmMYB73基因的过量表达提高了转基因植株的耐逆性，对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定。

Description

GmMYB73在培育耐逆性转基因植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种GmMYB73在培育耐逆性转基因植物中的应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB，WRKY等等。

MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。MYB结构域是一段约51～53个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。

自从1987年克隆了玉米与色素合成有关的ZmMYBC1基因后，又从很多植物中分离到功能各异的MYB基因。植物的MYB蛋白大都只含有两个MYB结构域，它们是一个大转录因子家族，参与许多生物学过程，例如，次生代谢的调节，控制细胞分化，应答激素刺激和外界环境胁迫以及抵抗病原菌的侵害。植物中还发现了含一个MYB结构域的MYB蛋白以及含3个MYB结构域的MYB蛋白。它们可能分别在维持染色体结构的完整性、调节基因转录和参与细胞周期的控制和调节细胞的分化上起重要作用。

MYB是植物中最大的转录因子家族之一，研究表明，MYB参与非生物胁迫的应答。在非生物胁迫调控信号途径中，MYB基因存在受ABA诱导和不受ABA诱导或甚至受抑制表达，表明MYB转录因子对非生物胁迫应答时可能参与ABA调控途径，也可参与非ABA调控途径。拟南芥MYB家族成员Atmyb2受干旱胁迫快速诱导，并且也受高盐和外源ABA诱导表达。过量表达能增强转基因植株的干旱耐性；拟南芥MYB成员HOS10的突变植株hos10-1对冷害的适应能力急剧减弱，并对脱水和NaCl处理高度敏感；在脱水胁迫条件下，ABA的含量增加。这表明HOS10对冷害适应是必需的，并通过控制ABA生物合成来影响植株的脱水胁迫的耐性。而下列基因是不受ABA诱导，拟南芥HPPBF-1是受盐诱导表达的单一MYB类型的MYB转录因子基因；水稻Osmyb4受低温诱导，在拟南芥中过量表达能够增加转基因植株的冷害和冻害抗性。对拟南芥1500个盐效应基因进行分类，发现受NaCl诱导的MYB基因仅四个。

发明内容

本发明的一个目的是提供GmMYB73蛋白或其编码基因或如下表达载体的应用。

本发明提供了GmMYB73蛋白或其编码基因或如下表达载体在培育耐逆性转基因植物中的应用；

本发明所提供的植物耐逆性相关调控蛋白为转录因子GmMYB73，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)，可以是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物油脂代谢相关的由序列2衍生的蛋白质；

(c)由与序列表中序列2所示的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的氨基酸序列组成的且与植物油脂相关调控的蛋白质。

序列表中的序列2由74个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第24-72位氨基酸残基为SANT结构域。

编码所述蛋白GmMYB73的编码基因GmMYB73也属于本发明的保护范围。

上述蛋白GmMYB73的编码基因GmMYB73可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子，由225个核苷酸组成；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物油脂代谢相关调控蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述植物油脂代谢相关调控蛋白的DNA分子。

在上述应用中，所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性。

在上述应用中，所述耐盐性通过提高叶片长度、提高发芽率和/或降低相对离子渗透率体现；

上述的叶片可以为莲座的第4片叶也可以为莲座的第3片叶，在本发明的实施例中具体统计的是莲座的第4片叶。

在上述应用中，所述耐干旱性通过提高发芽率和/或降低失水率体现；

在上述应用中，所述植物具体为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物，尤其优选为拟南芥。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物方法。

本发明提供的方法，为将GmMYB73蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；

在上述方法中，所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

在上述方法中，所述GmMYB73蛋白的编码基因为序列表中的序列1。

在上述方法中，所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性；所述耐盐性具体通过提高叶片长度、提高发芽率和/或降低相对离子渗透率体现；

上述的叶片可以为莲座的第4片叶也可以为莲座的第3片叶，在本发明的实施例中具体统计的是莲座的第4片叶。

在上述方法中，所述耐干旱性具体通过提高发芽率和/或降低失水率体现。

在上述方法中，所述GmMYB73蛋白的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物。

在上述方法中，所述植物表达载体在本发明的实施例中具体为将所述GmMYB73蛋白的编码基因插入载体pPROKII的BamHI和KpnI的酶切位点间，得到表达GmMYB73蛋白的载体。

在上述方法中，所述目的植物可为单子叶或双子叶植物，优选为双子叶植物，在本发明的实施例中，为拟南芥。

本发明的第三个目的是提供一种表达载体。

本发明提供的表达载体，在本发明的实施例中具体为将所述GmMYB73蛋白的编码基因插入载体pPROKII的BamHI和KpnI的酶切位点间，得到表达GmMYB73蛋白的载体。

可用现有的植物表达载体构建含有GmMYB73基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmMYB73构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

本发明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

转入本发明基因的植物中，会有相应的本发明的植物油脂代谢相关调控蛋白的生物合成，进而使转入本发明基因的植物产生改良性状。

本发明的基因可以在序列1的基础上进行以下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

1)为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可根据实际需要进行修饰和优化。如可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％。

2)为了翻译的有效起始，可以修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。

3)将本发明基因与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达。所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。

优选的组成型启动子包括CaMV 35S和19S启动子。所述启动子还可为来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。另一个优选的组成型启动子为泛素启动子。上述启动子还可为在根、木髓、叶或花粉中引导表达的启动子，即组织特异性启动子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(美国专利US 6,040,504)、水稻蔗糖合酶启动子(美国专利US 5,604,121)、夜香树黄化叶卷曲病毒启动子(WO 01/73087)。

化学诱导型启动子可为Rab29A启动子(美国专利US 5,614,395)。

4)将本发明基因与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率。例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。

5)可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。

上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的特性进行选择。上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

在优选的实施方式中，将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因，并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读框。通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千个环形质体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大大高于核表达基因的优势，使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白质的10％。将本发明基因插入到质体靶向载体中，并且转化进入期望的植物宿主质体基因组中。获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组而言属同质的植物，该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。

本发明的实验证明，本发明从大豆中克隆了一个MYB家族的转录因子基因GmMYB73，研究发现，GmMYB73基因的过量表达提高了转基因植株的耐逆性，对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmMYB73在干旱、盐、低温和ABA处理时的表达特征

图2为pPROKII-GmMYB73植物表达载体示意图

图3为GmMYB73转基因拟南芥植株的RT-PCR鉴定结果

图4为GmMYB73与拟南芥MYB蛋白的聚类分析

图5为CPC和TRY基因在高盐和干旱胁迫时的表达特征

图6为GmMYB73过表达植株的耐盐性鉴定和叶长度比较

图7为GmMYB73过表达植株和对照种子在盐胁迫下的发芽率

图8为GmMYB73过表达植株和对照在盐胁迫下的相对离子渗透率

图9为GmMYB73过表达植株和对照种子在旱胁迫下的发芽率

图10为GmMYB73过表达植株和对照在旱胁迫下的失水率

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

所有植物材料均生长于22℃每天的光照为16h/8h(光照/黑暗)。

pROKII载体(双元表达载体)记载在D.C.Baulcombe，G.R.Saunders，M.W.Bevan，M.A.Mayo and B.D.Harrison，Expression of biologically active viral satelliteRNA from the nuclear genome of transformed plants.Nature 321(1986)，pp.446-449中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

农杆菌GV3101菌株记载在Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip：a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16：6，735-743中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)：种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下简称野生型拟南芥。

实施例1、大豆转录因子GmMYB73基因的转录受非生物胁迫诱导

将大豆(Glycine max(L.)Merrill)HN44种子播种于装满蛭石的盆中，生长于25±2℃，连续光照，两周后取出大豆苗，操作时注意避免伤根，进行盐、干旱、低温和外源脱落酸ABA处理。

每种处理分别在0、1、3、6、12小时收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀得到总RNA。

处理过程为：盐处理，将根浸入200mM NaCl溶液中；干旱处理，将苗置于3mM滤纸上暴露于空气中；外源ABA处理，将根浸入200μM ABA溶液中；将大豆苗置于水中作为对照，所有处理均在连续光照，且25±2℃下生长。

对GmMYB73基因在上述处理时的表达特征进行定量PCR分析，引物为Primer-F和Primer-R。为引物进行RT-PCR分析，大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF和Primer-TR。

Primer-F：5’-atggctgacatagatcgctc-3’

Primer-R：5’-ttggctagtcgaaaatc-3’

Primer-TF：5’-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3’

Primer-TR：5’-TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’

Q-PCR得到的值是基因相对于GmTubulin的表达量。RT-PCR需要先通过调整模板cDNA的量来使GmTubulin的表达量一致，再进行基因的扩增。实验重复三次，结果取平均值±标准差。

结果如图1所示，GmMYB73基因在干旱、低温和ABA处理时其转录水平均有不同程度升高。在200mM NaCl处理1小时时，GmMYB73的转录即明显高于未处理，至3小时达到高峰，之后下降，直至低于未处理水平。

实施例2、转录因子GmMYB73的获得及耐逆性功能研究

一、转录因子GmMYB73的获得

分别提取大豆(Glycine max(L.)Merrill)HN44(满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；2006年获自黑龙江农业科学院大豆研究所；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，专利号为：CNA20020216.2，审定号为：黑审豆2002003，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)根的RNA，反转录成cDNA为模板，用如下带BamhI酶切位点的上游引物和带KpnI酶切位点的下游引物进行PCR扩增，得到约220bp的PCR产物。

根据GmMYB73的cDNA序列(DQ822927)设计引物为：

(带BamHI酶切位点的上游引物)5’-GGATCC atggctgacatagatc-3’(序列3)

(带KpnI酶切位点的下游引物)5’-GGTACC ttggctagtcgaaaatc-3’(序列4)

经过测序，该PCR产物含225bp，具有序列表中的序列1所示的核苷酸，即为GmMYB73，其编码的蛋白为GmMYB73，其氨基酸序列为序列表中的序列2。

二、GmMYB73的耐逆性研究

1、GmMYB73拟南芥的获得

1)重组载体的获得

将步骤一得到的PCR产物(GmMYB73的全长cDNA)连接在pMD-18-T载体上，得到pMD-18-T-GmMYB73，测序得到正确的GmMYB73编码序列后的pMD-18-T-GmMYB73以BamHI和KpnI对其进行酶切，回收225bp的GmMYB73片段，将酶切产物连接在相同酶切的双元表达载体pPROKII载体连接，将连接产物转入大肠杆菌，得到转化子。提取转化子的质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pPROKII载体的BamHI和KpnI的酶切位点间得到的载体，插入CaMV 35S启动子下游，形成含有GmMYB73全长的GmMYB73的植物表达载体，命名为pPROKII-GmMYB73(其部分结构示意图如图2)。

2)、GmMYB73转基因拟南芥及其拟南芥相似基因突变体的获得

A、GmMYB73转入农杆菌

以克隆有GmMYB73编码区的pPROKII-GmMYB73载体用电击法导入农杆菌GV3101，挑取转化的GV3101单菌落，提质粒并通过BamHI、KpnI酶切，得到225bp为验证转化成功的GV3101单菌落，命名为GV3101/pPROKII-GmMYB73。

B、转化拟南芥及转基因植株的鉴定

将GV3101/pPROKII-GmMYB73培养至对数期，然后用抽真空法将其转化野生型拟南芥(col-0)中，经培育后收获种子，将种子播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，待筛选得到的T₁代植株长至6叶时移到蛭石上生长，收获T₁代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T₂代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转GmMYB73拟南芥纯合株系T₄代。获得转基因单株27株，选取RT-PCR检测表达量不等的10个单株经T₄代纯合。

提取10个T₄代纯合转GmMYB73拟南芥单株和野生型拟南芥对照的RNA，反转录为cDNA，以Northern鉴定转基因植株。在编号为1、2、3、5、10、11、13、15、17、18的T₄代转GmMYB73拟南芥苗中均有目的片段，对照中没有GmMYB73的表达(图3)。筛选转基因阳性植株中目的基因表达较高的2株，GmMYB73-2(OE-2)和GmMYB73-5(OE-5)作进一步表型分析。

3)、GmMYB73拟南芥相似基因分析

GmMYB73基因编码一个单MYB结构的蛋白，属于R3-MYB类型。为进一步了解GmMYB73的功能，对GmMYB73和其拟南芥中的相似蛋白进行聚类分析，结果表明GmMYB73与拟南芥CPC类蛋白家族较接近(图4)。对拟南芥CPC家族中的CPC和TRY等基因在高盐，200mM NaCl和干旱，300mM甘露醇胁迫下的表达特征分析表明，它们均与GmMYB73相似，受高盐和干旱胁迫的诱导(图5)，推测GmMYB73在植物中与拟南芥CPC类蛋白可能有类似功能。从ABRC(Arabidopsis Biological ResourceCenter)突变体库中获得了2个拟南芥CPC类基因TRY和CPC的突变体try(目录号为CS6518)和cpc(目录号为CS6399)作进一步分析。TRY和CPC的单突变体try和cpc与野生型表型无明显差异，因此将其杂交构建了双突变体try/cpc。

三、转GmMYB73基因拟南芥的耐逆性分析

1)转GmMYB73基因株系的耐盐逆鉴定

A、苗期耐盐性鉴定：

编号为2(OE-2)和5(OE-5)的T₄代转GmMYB73拟南芥植株、双突变体try/cpc与野生型拟南芥(对照植株Col-0)的种子同时播种在MS平板上，将萌发后5天的幼苗分别移栽到含有125mM NaCl和150mM NaCl的1/2MS培养基上生长12天，以正常生长(未处理，不加入NaCl，即加入0mMNaCl)的作为对照。每个株系各为30株。

结果如图6A-C所示，可以看出，在正常条件(未处理)下，编号为2(OE-2)和5(OE-5)的T₄代转GmMYB73植株、双突变体try/cpc与野生型拟南芥(对照植株Col-0)之间在叶片形状、莲座大小、株高、抽苔时期和抽苔高度等表型没有明显差别。

而在125和150mM NaCl处理后，OE-2、OE-5、try/cpc双突变体与Col-0的表型有显著差别。OE-2、OE-5的生长状态明显好于对照植株Col-0，而try/cpc双突变体则开始萎蔫，明显差于对照。

具体进行莲座的第4片叶的叶长统计，结果如图6D所示：

正常条件下(0mM)，除OE-5叶长较短外，其它植株叶长无明显差异；

经125mM NaCl处理后，叶长分别为：对照Col-0为0.21±0.02cm、OE-5为0.33±0.03cm、OE-2为0.31±0.05cm、try/cpc双突变体为0.17±0.02cm；

经150mM NaCl处理后，叶长分别为：对照Col-0为0.18±0.02cm、OE-5为0.31±0.03cm、OE-2为0.33±0.05cm、为0.19±0.01cm。

B、发芽率耐盐性鉴定：

编号为2(OE-2)和5(OE-5)的T₄代转GmMYB73拟南芥转GmMYB73植株、双突变体try/cpc与野生型拟南芥(对照植株Col-0)的种子同时在含0、80、120和140mMNaCl的1/2MS培养基上在4℃春化4天，最后在22℃±2℃，16小时光照/8小时黑暗交替的条件下萌发72小时。统计种子发芽率。每个株系各为30株。

结果如图7，

在含0mM NaCl处理下，三种植株种子发芽率均为100％，

经80mM NaCl处理后，发芽率分别约为：对照Col-0为90％、OE-5和OE-2均为100％、try/cpc双突变体为70％；

经120mM NaCl处理后，发芽率分别约为：对照Col-0为78％、OE-5和OE-2均为90％、、try/cpc双突变体为43％。

经140mM NaCl处理后，发芽率分别约为：对照Col-0为61％、OE-5为82％、OE-2为87％、try/cpc双突变体为18％。

可以看出，在140mM NaCl处理下，双突变体try/cpc的发芽率急剧下降至18±8％，对照发芽率也有明显下降至61±7％，而OE-2和OE-5分别降至87±5％和82±5，明显高于双突变体try/cpc和对照。

C、苗期离子渗漏的检测：

相对电导渗透率是检测植物在受到逆境胁迫的时候释放出的相对离子量，表示所鉴定部位的细胞膜受损伤的程度。一般来说，如果逆境对细胞膜的损伤大时，细胞中的离子渗漏也大，则测定出的相对离子渗透率较大，而如果植物具有一定耐逆性，则会较大限度的保存自身的离子，因而释放出的离子较少，离子渗漏少，则相对离子渗透率较小。因此相对电导渗透率与植物的耐盐性呈现一定的相关性。

分别将3周龄无菌幼苗编号为2(OE-2)和5(OE-5)的T₄代转GmMYB73拟南芥转GmMYB73植株、双突变体try/cpc与野生型拟南芥(对照植株Col-0)浸泡在1/2MS溶液中含200mM NaCl溶液中，12小时，后分别测定4个株系的相对离子渗透率，具体方法为将处理的苗用清水清洗4～6次，充分洗净植物表皮的离子，将植物置于15ml玻璃管中，加入12ml去离子水，0.1Mpa抽真空20～30分钟，室温放置2～3h，测定此时溶液中的电导率。将玻璃管置于沸水中煮20～30分钟，待叶片完全变黄，取出，温度降到室温后再次测定电导率值。相对离子渗透率即为前一次电导率与后一次电导率的比值。以在1/2MS培养基中浸泡作为正常处理。每个株系各为20株。

结果如图8所示，

在1/2MS中，对照、突变体与2个转基因纯系间的相对离子渗透率无明显区别，均约为0.5-0.6。

在200mM NaCl盐处理12小时，对照Col-0相对离子渗透率约为0.270、OE-5约为0.230、OE-2约为0.235、try/cpc约为0.290。

从上述可以看出，在200mM NaCl处理下，2个过量表达纯系OE-5和OE-2相对离子渗透率均低于对照，而try/cpc则明显高于其它3和株系。

上述结果表明，在盐胁迫后，TRY、CPC的功能缺失加重了细胞膜的损伤，而GmMYB73的过表达减轻了细胞膜的损伤，从而提高了转基因植株的耐盐性。

2)耐旱性鉴定：

A、发芽率

将编号为2(OE-2)和5(OE-5)的T₄代转GmMYB73植株、双突变体try/cpc与野生型拟南芥(对照植株Col-0)的种子分别播于含0、100、200和300mM甘露醇的1/4MS培养基上，每个株系各为25株。春化4天后72小时统计发芽率。

结果如图9所示，可以看出，含0甘露醇(未处理)时所有株系发芽率约100％，在200和300mM甘露醇胁迫下，所有株系的发芽率均明显下降。try/cpc下降最为明显，发芽率分别为45％和18％，对照降至发芽率分别为86％和63％，而OE-5降至发芽率分别为86和69％，OE-2降至发芽率分别为89和73％，OE-5和OE-2的发芽率是高于突变体和野生型对照。

B、水分丧失率(失水率)

测定了旱胁迫下4种株系的失水率，具体如下：

对生长3周编号为2(OE-2)和5(OE-5)的T₄代转GmMYB73拟南芥转GmMYB73植株、双突变体try/cpc与野生型拟南芥(对照植株col-0)的幼苗移出，暴露于空气中，在22-23℃下进行空气干燥处理，分别在20、40、60、80、100和120分钟测定各株幼苗的鲜重，计算失水率。每个株系各为25株。

失水率计算：(处理后鲜重X100)/处理前鲜重。

结果如图10所示，可以看出，在空气中干燥120分钟后，统计的失水率如下：OE-2和OE-5约为45.6％和48.5％，野生型对照约为52.9％，而try/cpc植株约为77.7％，明显高于野生型和OE植株。因此GmMYB73的过表达降低了植株在干旱胁迫下的失水速度，而TRY、CPC功能的缺失加速了植株的失水速度。

综合上述结果，GmMYB73参与了植物在高盐和干旱胁迫下的调控。其编码基因GmMYB73的过量表达，提高了转基因植株的耐盐和耐旱性。

Claims (10)

1.GmMYB73蛋白或其编码基因或如下权利要求10所述的表达载体在培育耐逆性转基因植物中的应用；

所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GmMYB73蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述耐盐性通过提高叶片长度、提高发芽率和/或降低相对离子渗透率体现；

所述耐干旱性通过提高发芽率和/或降低失水率体现；

所述植物具体为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物，尤其优选为拟南芥。

4.一种培育转基因植物方法，为将GmMYB73蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；

所述GmMYB73蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述GmMYB73蛋白的编码基因为序列表中的序列1。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐干旱性；所述耐盐性具体通过提高叶片长度、提高发芽率和/或降低相对离子渗透率体现；

所述耐干旱性具体通过提高发芽率和/或降低失水率体现。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：所述GmMYB73蛋白的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物。

8.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为将所述GmMYB73蛋白的编码基因插入载体pPROKII中，得到表达GmMYB73蛋白的载体。

9.根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物，尤其优选为拟南芥。

10.一种表达载体，为将所述GmMYB73蛋白的编码基因插入载体pPROKII中，得到表达GmMYB73蛋白的载体。

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