CN109628475B - 油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在调控植物分枝中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在调控植物分枝中的用途。本发明通过亚细胞定位、拟南芥遗传转化和烟草的遗传转化最终发现从甜樱桃中分离的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1具有调控植物腋芽分枝能力的功能；本发明进一步通过在本生烟异源表达PaCYP724B1的不同的五段靶标序列，最终筛选得到一段能够有效沉默植物内源CYP724B1基因表达并影响植物侧枝形成的靶标序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。本发明为樱桃等核果类果树树体结构等经济性状的分子生物学方面提供充分的证据，同时也为培育分枝能力强的甜樱桃新种质奠定了理论与试验基础。

Description

油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在调控植物分枝中的用途

技术领域

本发明涉及油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的新用途，尤其涉及从甜樱桃中分离的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在调控植物分枝中的用途，属于油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的新用途领域。

背景技术

甜樱桃(Prunus avium L.)是目前北方落叶果树中栽培效益最好的树种之一，素有“春枝第一果”美誉，广泛栽种于中国华东、华北、辽南及西北较温暖的地区。理想的树体结构是实现甜樱桃果园早产和丰产的决定因素，也是果园省力高效生产的保证。幼树形成一定数量的有效分枝是缩短甜樱桃果树幼树期，形成预定理想树形的有效途径之一(Elfving DC,Visser DB,Henry JL.2011.Gibberellins stimulate lateral branchdevelopment in young sweet cherry trees in the orchard.International journalof fruit science 11(1):41-54.侯东梅,戴桂林,聂国伟,宋永宏,李凯.大樱桃的特性与早果丰产整形修剪技术[J].北方果树,2016(04):25-26.)。然而，鉴于甜樱桃幼树的发枝习性，顶端优势和顶端控制强，成枝能力极弱，且未经修剪的甜樱桃1年生枝的基部很难萌发侧枝(高华君,孙山,王家喜.欧洲甜樱桃中心主干形“促枝促花”技术研究进展[J].山东农业科学,2016,48(03):150-157.Hoying SA,Robinson TL,Andersen RL.2001.Improvingsweet cherry branching.New York Fruit Quarterly 9(1):19-22.Elfving DC,VisserDB,Henry JL.2011.Gibberellins stimulate lateral branch development in youngsweet cherry trees in the orchard.International journal of fruit science 11(1):41-54.)，是多年来对甜樱桃现代化省力栽培或保护地促成栽培生产的一个瓶颈，因此研究甜樱桃的分枝机理及培育分枝能力强的新种质是解决上述科学问题的一个重要措施。

研究发现甜樱桃的分枝能力是受多基因、多因素调控的数量性状，分枝的发生不仅受遗传因子的调控，还受植物激素和环境等多种因素的影响(Leyser O.2009.Thecontrol of shoot branching:an example of plant information processing.PlantCell Environ 32:694-703.Kebrom TH,Spielmeyer W,Finnegan EJ.2013.Grassesprovide new insights into regulation of shoot branching.Trends in PlantScience 18(1):41-48.Domagalska MA,Leyser O.2011.Signal integration in thecontrol of shoot branching.Nature Reviews Molecular Cell Biology 12(4):211.)。甜樱桃侧枝的形成主要受三大植物激素的共同影响，即起促进作用的细胞分裂素和起抑制作用的生长素与独脚金内酯。生长素从顶端产生向下极性运输控制侧芽生长；细胞分裂素主要在根中合成，通过木质部的蒸腾作用向地上部运输，促进细胞分裂并向上运输直接促进侧芽的生长；独脚金内酯于根部合成，向上运输控制侧芽的生长(王玫,陈洪伟,王红利,刘克锋.独脚金内酯调控植物分枝的研究进展[J].园艺学报,2014,1(09):1924-1934.)。目前甜樱桃分枝能力的相关基因及分子标记的鉴定与研究甚少，其调控甜樱桃分枝的分子机理仍未报道。

细胞色素P450(CYP)是广泛存在于动物、植物、真菌、原生动物体内的一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，参与苯丙素、萜类、生物碱等多种结构大分子、天然色素和防御物质的合成及大部分激素和信号分子的合成与代谢等反应。近年来，细胞色素P450超家族参与植物激素调控植物生长、发育的研究机制已成为一个热点。截止目前，多个参与植物体新陈代谢途径的细胞色素P450超家族的基因功能已经被鉴定。从甜樱桃中分离获得的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1也已被鉴定，但是该油菜素内酯合成基因PaCYP724B1对于包括甜樱桃在内的植物的分枝发育是否具有调控作用，目前尚未见报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种从甜樱桃中分离获得的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的新用途，即用于调控植物的分枝发育。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明人在前期通过对甜樱桃品种间分枝能力差异调查及分子鉴定研究发现，PaCYP724B1基因的表达量与甜樱桃分枝能力密切关联，由此推测PaCYP724B1基因可能是调控甜樱桃分枝能力的关键候选基因。

为了确证PaCYP724B1基因是否为调控甜樱桃分枝能力的关键候选基因或是否具有调控甜樱桃果树分枝能力的功能，本发明首先利用生物信息方法对PaCYP724B1进行同源性和进化树分析，利用MEGA 6.0软件对甜樱桃PaCYP724B1和其它已经完成测序物种(水稻、拟南芥、小麦、番茄、葡萄、梨、苹果等)的CYP724B1进行氨基酸序列的同源比对分析，并构建其进化树；同源比对结果显示，PaCYP724B1蛋白与水稻的OsCYP724B1相似性极低，进化树中PaCYP724B1和水稻的OsCYP724B1聚集于系统进化树的两个不同的主枝上，同源性极低。基于上述对比结果，推测甜樱桃PaCYP724B1基因功能可能有别于水稻等模式生物。

为了分析PaCYP724B1基因的表达是否与甜樱桃嫩枝的形成有关，本发明从分枝能力强的甜樱桃栽培品种中克隆到PaCYP724B1基因，通过实时荧光定量PCR(qPCR)分析不同分枝能力的栽培种间及不同位置和不同处理的腋芽形成分枝过程中PaCYP724B1基因的表达量情况；试验结果显示，PaCYP724B1基因表达关联甜樱桃嫩枝的形成。

为确定PaCYP724B1蛋白是转录因子还是结构蛋白，本发明通过烟草的瞬时转化技术分析PaCYP724B1蛋白的亚细胞定位，荧光共聚焦显微镜观察发现，PaCYP724B1蛋白主要定位在细胞质内；为进一步确定PaCYP724B1蛋白的亚细胞定位，本发明通过本生烟的瞬时转化和提取烟草叶片的原生质体分析，PaCYP724B1蛋白定位在内质网上，由此推测PaCYP724B1可能是一个结构蛋白，发挥功能在内质网上。

为了确定PaCYP724B1基因是否与分枝形成有关，本发明构建了PaCYP724B1基因的植物过表达载体，利用根癌农杆菌介导的拟南芥的遗传转化。通过在拟南芥中过量表达甜樱桃PaCYP724B1产生的阳性转基因T3代株系，表型观察和统计分析发现：过表达PaCYP724B1基因的拟南芥的莲座叶显著多于野生型拟南芥，而且总莲座叶的叶片鲜重和叶片干重显著高于野生型拟南芥。同时过表达PaCYP724B1基因的拟南芥株系产生较多的抽薹，抽薹数显著多于野生型拟南芥，然而过表达PaCYP724B1基因的拟南芥株系的果荚长度与野生型拟南芥没有显著变化。拟南芥中过表达PaCYP724B1基因的遗传转化试验结果表明，过表达甜樱桃PaCYP724B1基因能够显著提高拟南芥的分枝数量。

本发明进一步构建PaCYP724B1基因的异源VIGS载体，转化本生烟，分析PaCYP724B1基因对本生烟侧枝形成的影响。通过半定量PCR检测发现：只有TRV-PaCYP724B1-3的靶标序列(SEQ ID No.4)信息可有效沉默烟草的NbCYP724B1基因的表达，沉默效率达80％以上，因此，通过半定量PCR检测可确定异源TRV-PaCYP724B1-3的标靶序列能有效沉默本生烟内源NbCYP724B1基因的表达。为进一步确定NbCYP724B1基因被沉默后，烟草植株的分枝能力如何，本发明通过侵染的本生烟的表型观察和统计分析发现：异源TRV-PaCYP724B1成功沉默本生烟内源基因表达的腋芽形成的分枝数量显著低于TRV空载接种的本生烟，表明TRV-PaCYP724B1可有效沉默烟草的NbCYP724B1基因的表达，CYP724B1基因影响本生烟侧枝的形成。

本发明通过上述一系列的试验最终确定，从甜樱桃中分离获得的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1能够调控植物分枝的发育或形成；更进一步的，从甜樱桃中分离获得的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1能够促进植物的分枝发育或增加分枝的数量。

由此，作为实践应用的一个方面，可以将油菜素内酯合成基因PaCYP724B1构建到植物表达载体中得到重组植物表达载体，将该重组植物表达载体转化到植物中，让油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在植物中进行过表达以促进植物的分枝的发育或增加分枝的数量。

譬如，将油菜素内酯合成基因PaCYP724B1与含有启动子的植物表达载体进行可操作性的连接后构建得到重组植物表达载体，将该重组植物表达载体转化到植物中，可以有效促进转化植物的分枝的发育或增加其分枝的数量，培育得到具有较强分枝能力的新的甜樱桃品种。

所述的重组植物表达载体中还可含有选择标记基因。

含有所述重组植物表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范畴。

作为一种参考，可以采用任何一种的植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体转化到受体植物的细胞、组织中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等；所述的受体植物包括单子叶植物、双子叶植物；优选的，所述的受体植物为禾本科植物，例如玉米、水稻、大麦、小麦或高粱等农作物。

本发明中所述的启动子可以是任何一种能够启动外源基因在植物中进行表达的启动子，包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导性启动子；譬如可以是35S启动子、Act1启动子、玉米泛素基因的启动子Ubil和木薯叶脉花叶病毒的CsVMV启动子等。

本发明中所述的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的核苷酸序列优选为SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；还可以是与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有促进分枝的功能或活性；还可以是与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有70％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸仍具有促进分枝的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有促进分枝的功能或活性；更优选的，与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有促进分枝的功能或活性。

此外，本领域人员也可按照本领域人员的常规突变技术在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到多个核苷酸变体，且该核苷酸变体仍具有促进分枝的功能或活性。

本发明还进一步提供了一段油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的靶标因序列，其核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；将该靶标因序列转化到植物体内能够有效沉默植物体的CYP724B1基因的表达

本发明中所述的“替换”是指分别用不同的碱基取代另外的碱基；所述的“缺失”是指缺少一个或多个碱基；所述的“插入”是指核苷酸的改变，相对天然分子而言，所述改变是因添加一个或多个碱基所致。

按照上述方法得到的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的突变体均能适用于本发明。

本发明通过亚细胞定位、拟南芥遗传转化和烟草的遗传转化最终确定PaCYP724B1具有调控植物腋芽的分枝能力的功能，同时本发明通过异源表达PaCYP724B1的一段靶标序列片段可以有效沉默本生烟的内源NbCYP724B1基因并影响本生烟侧枝的形成。本发明为樱桃等核果类果树树体结构等经济性状的分子生物学方面提供充分的证据，同时为培育分枝能力强的甜樱桃新种质奠定理论与试验基础。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“同源性”是指在此用作序列之间相似性的衡量；两个序列之间的序列同源性越大，则杂交程度越高。本领域技术人员采用已知的方法可测定杂交体形成。

术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“启动子”指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。

术语“选择标记基因”：该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势，用这些选择性标记基因所转化的这些细胞所具有的选择优势可以是由于它们与非转化细胞的生长相比具有在阴性选择剂(如：抗菌素或除草剂)的存在下生长的能力。选择标记基因还指多种基因的组合，它们在植物细胞中的表达给予该细胞阴性以及阳性的选择优势。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达选择标记物或待转录的异源性基因等。

附图说明

图1 PaCYP724B1的同源性分析结果。

图2不同位置的腋芽及不同处理后腋芽的位置。

图3 PaCYP724B1基因的表达。A.‘乌梅极早’、‘美早’和‘赛维’三个栽培品种不同位置的腋芽发育过程中PaCYP724B1基因的表达。B.‘美早’和‘赛维’两个栽培品种中短截和未短截处理后不同位置的腋芽中PaCYP724B1基因的表达。

图4.PaCYP724B1蛋白的亚细胞定位；A载体构建流程图。B.PaCYP724B1在烟草叶肉细胞的定位。C.PaCYP724B1在烟草叶肉细胞的原生质体的定位。

图5拟南芥中过表达PaCYP724B1基因的阳性植株中PaCYP724B1基因表达量分析。

图6拟南芥中过表达PaCYP724B1基因提高拟南芥的分枝数量；A.拟南芥的表型。B-C.拟南芥莲座叶的叶片鲜重(B)和干重(C)。D.分枝的数量统计。E.果荚的长度统计。

图7异源PaCYP724B1基因的靶标序列沉默本生烟内源基因的表达情况。

图8异源TRV-PaCYP724B1基因的表达影响本生烟分枝能力。A半定量分析内源基因NbCYP724B1表达。B-C.本生烟分枝的表型。D.本生烟分枝数目的统计。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料

菌株和载体：根癌农杆菌GV3101，载体TRV1、TRV2(清华大学刘玉乐博士惠赠)，载体pBI121，pCAMBIA1302-GFP(p-GFP)为本发明人实验室保存。

试验例1甜樱桃PaCYP724B1基因的同源性分析试验

为确定甜樱桃PaCYP724B1基因的生物学功能，本试验首先利用生物信息方法对PaCYP724B1进行同源性和进化树分析，利用MEGA 6.0软件对樱桃PaCYP724B1和其它已经完成测序物种(水稻、拟南芥、小麦、番茄、葡萄、梨、苹果等)的CYP724B1进行氨基酸序列的同源比对分析，并构建其进化树。

同源比对结果显示，PaCYP724B1蛋白与水稻的OsCYP724B1相似性极低，进化树中PaCYP724B1和水稻的OsCYP724B1聚集于系统进化树的两个不同的主枝上，同源性极低。基于上述对比结果，推测甜樱桃PaCYP724B1基因功能可能有别于水稻等模式生物。但是甜樱桃PaCYP724B1与梅花、桃树、苹果、梨树的同源性较高，然而上述树种中鲜有PaCYP724B1研究报道(图1)，而且桃树、梨树等的一年生枝条的分枝能力较强，与甜樱桃的分枝习性有很大的差别。鉴于上述分析结果能够推测甜樱桃PaCYP724B1的生物学功能可能有别于水稻及桃树等植物。

试验例2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PaCYP724B1基因的表达模式。

为了分析PaCYP724B1基因的表达是否与甜樱桃嫩枝的形成有关，本实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)分析不同分枝能力的栽培种间及不同位置和不同处理的腋芽形成分枝过程中PaCYP724B1基因的表达量情况，设计特异性引物，进行三次独立的荧光定量PCR。

分别提取分枝能力不同的栽培品种【‘赛维’(Sylvia，较少分枝型)、‘红灯’(hongdeng，中等分枝类型)和‘乌梅极早’(Skorospelka，较多分枝型)】的不同位置的腋芽(一年生枝条的基部个顶端)以及不同处理(短截处理和未短截处理)的不同位置腋芽的总RNA(图2)，利用PaCYP724B1基因的特异性编码区序列作为靶标，进行三次独立的荧光定量PCR，通过实时荧光定量PCR的方法进行甜樱桃PaCYP724B1基因的差异表达模式分析，并以2^(-ΔΔCT)法对实验结果进行处理，确定PaCYP724B1基因的表达量对分枝形成的影响。

试验结果显示，‘乌梅极早’枝条的基部腋芽相比‘美早’和‘赛维’的腋芽易形成嫩枝，在腋芽形成嫩枝的过程中，‘乌梅极早’基部腋芽的PaCYP724B1基因的表达量显著高于‘美早’和‘赛维’的基部腋芽的PaCYP724B1基因的表达量(图3A)。由于甜樱桃的顶端优势，枝条顶部的腋芽相比基部的腋芽易形成嫩枝，PaCYP724B1基因的表达结果显示，‘乌梅极早’、‘美早’和‘赛维’三个栽培品种的腋芽形成嫩枝的过程中，枝条顶端腋芽PaCYP724B1基因的表达量显著高于枝条基部腋芽PaCYP724B1基因的表达(图3A)。枝条短截可以消除顶端优势，促进嫩枝形成。‘美早’和‘赛维’两个栽培品种的枝条短截后，腋芽形成嫩枝的过程中，形成嫩枝的腋芽的PaCYP724B1基因的表达量显著高于不形成嫩枝的腋芽PaCYP724B1基因的表达，表明PaCYP724B1基因表达关联甜樱桃嫩枝的形成。

试验例3 p-GFP-PaCYP724B1亚细胞定位载体的构建及蛋白定位分析试验

为确定PaCYP724B1蛋白是转录因子还是结构蛋白，若是结构蛋白其在细胞的哪个位置发挥作用。本试验通过烟草的瞬时转化技术分析PaCYP724B1蛋白的亚细胞定位。

以pBI121-PaCYP724B1重组质粒为模板，设计包含PaCYP724B1基因编码区序列的特异性引物，进行PCR扩增，获得PaCYP724B1基因片段，利用同源重组的方法将全长的PaCYP724B1基因(去除终止密码子)构建到亚细胞定位载体pCAMBIA1302-GFP上Nco I和SpeI酶切位点之间，获得p-GFP-PaCYP724B1重组载体，电击转化根癌农杆菌，通过农杆菌介导的方法注射本生烟的叶片，2天后，提取本生烟的原生质体，通过荧光共聚焦显微镜观察PaCYP724B1-GFP的亚细胞位置，进一步确定PaCYP724B1的功能。

荧光共聚焦显微镜观察发现，PaCYP724B1蛋白主要定位在细胞质内(图4B)。为进一步确定PaCYP724B1蛋白的亚细胞定位，本试验通过本生烟的瞬时转化和提取烟草叶片的原生质体分析，PaCYP724B1蛋白定位在内质网上(图4C)，确定PaCYP724B1可能是一个结构蛋白，发挥功能在内质网上。

试验例4拟南芥中过表达PaCYP724B1基因的遗传转化试验

为了进一步确定PaCYP724B1基因是否与分枝形成有关，本试验构建了PaCYP724B1基因的植物过表达载体，利用根癌农杆菌介导的拟南芥的遗传转化。

以甜樱桃的总RNA为模板，设计包含PaCYP724B1基因编码区序列的特异性引物，进行PCR扩增，获得PaCYP724B1基因的编码区序列，利用同源重组的方法将全长的PaCYP724B1基因(SEQ ID No.1)构建到植物表达载体pBI121上Xba I和Sma I酶切位点之间，获得pBI121-PaCYP724B1重组载体，电击转化根癌农杆菌，利用农杆菌介导的蘸花法侵染拟南芥，进行基因的遗传转化，获得T3代阳性植株后，观察并统计过表达PaCYP724B1基因的拟南芥的分枝数量，确定过表达樱桃PaCYP724B1对分枝能力的影响。获得了多个过表达PaCYP724B1基因的拟南芥阳性转化株系，并继代培养2代后，得到纯合的转化株系，选取三个表达量最高的株系(PaCYP724B1-3、PaCYP724B1-8和PaCYP724B1-12)进行进一步表型研究(图5)。

本试验通过在拟南芥中过量表达甜樱桃PaCYP724B1产生的阳性转基因T3代株系，表型观察和统计分析发现：过表达PaCYP724B1基因的拟南芥的莲座叶显著多于野生型拟南芥，而且总莲座叶的叶片鲜重和叶片干重显著高于野生型拟南芥(图6)。同时过表达PaCYP724B1基因的拟南芥株系产生较多的抽薹数，抽薹数显著多于野生型拟南芥，然而过表达PaCYP724B1基因的拟南芥株系的果荚长度与野生型拟南芥没有显著变化(图6)。

拟南芥中过表达PaCYP724B1基因的遗传转化试验结果表明过表达甜樱桃PaCYP724B1基因能够显著提高野生型拟南芥的分枝数量。

试验例5 VIGS-PaCYP724B1瞬时干扰载体的构建和本生烟的侵染试验

靶基因片段的长度及序列信息是影响TRV病毒诱导基因沉默本生烟效率的关键因素，本试验设计5条甜樱桃PaCYP724B1基因的靶标序列，构建到TRV病毒载体上，通过农杆菌介导的转化方法侵染和接种本生烟：

以甜樱桃的总RNA为模板，设计5对PaCYP724B1基因的引物，扩增PaCYP724B1基因的片段信息，片段大约在300bp左右，扩增获得的5条靶基因片段(其中，PaCYP724B1-1的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，PaCYP724B1-2的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，PaCYP724B1-3的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，PaCYP724B1-4的核苷酸序列为SEQ IDNo.5所示，PaCYP724B1-5的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示)利用同源重组的方法将其连接到TRV2载体的的多克隆位点的EcoR I和Kpn I的双酶切的位点处，获得重组载体TRV2-PaCYP724B1-1，TRV2-PaCYP724B1-2，TRV2-PaCYP724B1-3，TRV2-PaCYP724B1-4和TRV2-PaCYP724B1-5，电击转化农杆菌GV3101菌株，与携带TRV1(TRV病毒另一部分基因信息)的农杆菌GV3101菌株1：1混合，采用叶片注射的方法侵染本生烟，利用半定量PCR(RT-PCR)检测本生烟NbCYP724B1基因的表达量，确定异源的TRV-PaCYP724B1形成的小RNA片段(siRNA)能否有效沉默本生烟NbCYP724B1基因的表达，并分析NbCYP724B1基因被沉默的本生烟植株腋芽的成枝数量。异源TRV-PaCYP724B1可有效沉默烟草NbCYP724B1基因的表达及对本生烟分枝能力的影响。

通过半定量PCR检测发现：只有TRV-PaCYP724B1-3的靶标序列(SEQ ID No.4)可有效沉默烟草的NbCYP724B1基因的表达，沉默效率达80％以上(图7)。

本实验通过半定量PCR检测确定异源TRV-PaCYP724B1-3的标靶序列可有效沉默本生烟内源NbCYP724B1基因的表达。为进一步确定NbCYP724B1基因被沉默后，烟草植株的分枝能力如何，本实验通过侵染的本生烟的表型观察和统计分析发现，异源TRV-PaCYP724B1成功沉默本生烟内源基因表达的腋芽形成的分枝数量显著低于TRV空载接种的本生烟(图8)，表明TRV-PaCYP724B1可有效沉默烟草的NbCYP724B1基因的表达，CYP724B1基因影响本生烟侧枝的形成。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在调控植物分枝中的用途

<130> HN-2002-181207A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1461

<212> DNA

<213> Prunus avium L.

<400> 1

atggccggaa gcactttttg gcctgtggtt ctacttggaa tgtttggctc ccttttgggt 60

ttcattttaa accacttctt gcccttaatg ttgctaaggc ttaatggtag ccctccaccc 120

aaggggtctt ttgggtggcc tatattggga caaacacttg ccttcttgaa gcctcatcct 180

tctaattccc ttggtgcctt cctgcaacac cattgttcta ggtatgggaa agtgtttaaa 240

tcgcatttgt tcttgtctcc cacaattgtg tcatgtgatc aagagctcaa ctacttcata 300

cttcagaatg aaggcaagtt gttcgaatgc agctatccaa aacccatcca tggcatcctt 360

ggcaagagct ccatgcttgt ggctgtggct gatacccaca aaaggctcag aaatgtggct 420

gtctccttgg tcaccattac caaatccaag cctgagtttc tcagcgacat tgaagccaca 480

accattagca tacttcactc ttggaaagat aaatcacaag tcatcttttg tgaggaagcc 540

agaaagttca cattcaatgt aatagtaaag caagtgctag gtttgacccc agatgagcca 600

cagaccacaa gaattcttga agatttcttg actctcatga gagggctcat ttctctccct 660

ctttacattc ctggaacccc atatgcaaga gctgttaagg ctagaaggag gatatcttca 720

actgtgaaag caattataga ggaaagaaga agacaagcag ctgagacaag cactaattcc 780

agcaggagta aaaggagtga ttttcttgag atacttatgg atgttgatac cttatctgaa 840

gatgaaaaag tgagtttcat cttggattct ctattgggtg gctatgagac tacctctctc 900

ttaatcagca tggcagttta ttttctagct caatcacctt ctgcgttaca acaattaaag 960

gtggagcatc agaacattag aagagggaag cagaaagatg agtacttgaa ctgggaagat 1020

tatgagaaaa tggaatttac ccaaaatgtg atcaacgaag ctctcagatg tggaaacgtt 1080

gtaaaattcg tgcaccgaaa ggctctcaaa gatgtgaaat ttagagatta tctaattcca 1140

tctggctgga aagttctacc cgtctttagt gcagctcatt tggacccttc actccatgca 1200

agtgctcttg agtttcatcc ttggagatgg gagaaaattc agagccaaga ccaaacgtgc 1260

aagagattta ctccctttgg tggagggtct agatgctgtc ctggatctga acttgggaag 1320

cttgaagttg caatttttct ccaccacctt gtacagaatt tcaggtggag gactgaggat 1380

gatgaccaac ccatagcgtt tccatacgta gaatttcaaa gaggcctgcc actgcacttg 1440

gagcattgcc ctatcaattg a 1461

<210> 2

<211> 341

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

actttttggc ctgtggttct acttggaatg tttggctccc ttttgggttt cattttaaac 60

cacttcttgc ccttaatgtt gctaaggctt aatggtagcc ctccacccaa ggggtctttt 120

gggtggccta tattgggaca aacacttgcc ttcttgaagc ctcatccttc taattccctt 180

ggtgccttcc tgcaacacca ttgttctagg tatgggaaag tgtttaaatc gcatttgttc 240

ttgtctccca caattgtgtc atgtgatcaa gagctcaact acttcatact tcagaatgaa 300

ggcaagttgt tcgaatgcag ctatccaaaa cccatccatg g 341

<210> 3

<211> 275

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

gctatccaaa acccatccat ggcatccttg gcaagagctc catgcttgtg gctgtggctg 60

atacccacaa aaggctcaga aatgtggctg tctccttggt caccattacc aaatccaagc 120

ctgagtttct cagcgacatt gaagccacaa ccattagcat acttcactct tggaaagata 180

aatcacaagt catcttttgt gaggaagcca gaaagttcac attcaatgta atagtaaagc 240

aagtgctagg tttgacccca gatgagccac agacc 275

<210> 4

<211> 303

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

gaccccagat gagccacaga ccacaagaat tcttgaagat ttcttgactc tcatgagagg 60

gctcatttct ctccctcttt acattcctgg aaccccatat gcaagagctg ttaaggctag 120

aaggaggata tcttcaactg tgaaagcaat tatagaggaa agaagaagac aagcagctga 180

gacaagcact aattccagca ggagtaaaag gagtgatttt cttgagatac ttatggatgt 240

tgatacctta tctgaagatg aaaaagtgag tttcatcttg gattctctat tgggtggcta 300

tga 303

<210> 5

<211> 246

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

tggattctct attgggtggc tatgagacta cctctctctt aatcagcatg gcagtttatt 60

ttctagctca atcaccttct gcgttacaac aattaaaggt ggagcatcag aacattagaa 120

gagggaagca gaaagatgag tacttgaact gggaagatta tgagaaaatg gaatttaccc 180

aaaatgtgat caacgaagct ctcagatgtg gaaacgttgt aaaattcgtg caccgaaagg 240

ctctca 246

<210> 6

<211> 368

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

cgtgcaccga aaggctctca aagatgtgaa atttagagat tatctaattc catctggctg 60

gaaagttcta cccgtcttta gtgcagctca tttggaccct tcactccatg caagtgctct 120

tgagtttcat ccttggagat gggagaaaat tcagagccaa gaccaaacgt gcaagagatt 180

tactcccttt ggtggagggt ctagatgctg tcctggatct gaacttggga agcttgaagt 240

tgcaattttt ctccaccacc ttgtacagaa tttcaggtgg aggactgagg atgatgacca 300

acccatagcg tttccatacg tagaatttca aagaggcctg ccactgcact tggagcattg 360

ccctatca 368

Claims (2)

1.从甜樱桃（Prunus avium L.）中分离得到的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在促进植物分枝的形成或分枝数量增多中的用途；所述的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；将油菜素内酯合成基因PaCYP724B1与含有启动子的植物表达载体可操作性的连接后构建得到重组植物表达载体；将该重组植物表达载体转化到植物中，促进转化植物的分枝的发育或增加植物分枝的数量；所述的植物是甜樱桃、拟南芥或烟草。

2.一种抑制植物分枝的发育或形成的方法，其特征在于，包括：将油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的靶标序列转化到植物中沉默植物体内CYP724B1基因的表达；所述的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的靶标序列为SEQ ID NO.4所示；所述的油菜素内酯合成基因PaCYP724B1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述的植物是甜樱桃、拟南芥或烟草。

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