CN104673803A - 基因甲基化在调控基因表达方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因甲基化调控的遗传操作技术，可以通过对单个基因不同甲基化水平的基因克隆或设计合成，利用DNA重组技术进行遗传操作，在转基因受体中调控基因的表达水平，实现表观遗传学性状的体外遗传操作的方法。通过调节植物ICE1基因的甲基化程度培育抗寒植物，为培育抗寒作物提供了新的选择，降低了低温对作物产量品质等的影响。

Description

基因甲基化在调控基因表达方面的应用

技术领域

    本发明属于分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本发明涉及一种利用基因不同的甲基化程度进行基因表达调控的遗传操作技术。

背景技术

DNA甲基化是基因组DNA的一种重要表观遗传形式，是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化现象广泛存在于细菌、植物和动物中，参与生物体的多种生物学过程。DNA甲基化在植物中具有物种、组织、器官、年龄特异性，参与遗传功能的调控，包括转录、复制、DNA修复、转基因和细胞分化，在植物生长发育及进化过程中起着重要的调节作用。Jullien等人（2012）在对拟南芥(Arabidopsis thaliana)有性生殖过程中的DNA甲基化动态变化进行研究时发现，在雌配子发生过程中，维持甲基化方式几乎不发生，而受精后在胚胎中从头甲基化与维持甲基化明显发生，并且维持一定甲基化水平直到成株，这种DNA甲基化动态变化周期对于拟南芥的繁殖具有一定意义。高盐处理可以导致水稻基因组DNA甲基化状态的改变（韩雅楠等，2010）。Tan等（2010）研究表明，盐胁迫可诱导玉米ABA负调控因子ZmPP2C内含子去甲基化水平提高，致使其表达量显著下调；而诱导参与活性氧代谢的ZmGST去甲基化，使得其表达水平增加。这些研究表明，逆境胁迫通过改变植物DNA表观遗传修饰状态，调控基因表达和植物生长发育，从而应对逆境胁迫。

作为表观遗传修饰主要方式之一，DNA甲基化已成为研究热点。虽然人们对DNA甲基化的研究开展了大量的工作，但主要集中在甲基化发生机制、甲基化生物学功能及甲基化检测方法等方面，但如何通过甲基化的改变活化基因表达的研究尚处于起步阶段，研究还不够深入。由于传统观念认为，基因的甲基化在遗传操作过程中会随机地甲基化，因此，针对特定基因的甲基化水平的保持和遗传操作，还缺乏相关技术。迫切需要建立分离不同甲基化水平的基因，进行重组及转基因遗传操作，实现通过甲基化结合转基因技术调节基因表达水平，控制表型的技术。

低温是经常发生且危害严重的逆境因素之一许多植物在受到非冷害低温处理后，其抗冷性将会增强，这就是所谓的冷驯化现象(Thomashow，1999)。但是，热带和亚热带起源的植物对温度条件要求比较高，无法适应骤冷温度（0-15℃）。低温伤害严重影响香蕉（Xu et al.2002）、棉花（Zhang & Zhang，2006）、玉米（Ma et al. 2006）和水稻（Quan et al.2006）等的产量和品质。在1991-1992年，1992-1993年以及最近的1999-2000年等几个严寒冬春，华南地区都因特强寒潮的入侵而导致了大面积的蕉园受到毁灭性的破坏，使广大蕉农蒙受极大的损失（Xu et al.2002）。棉花整个生长发育过程中，最适宜的温度为20～30℃，当日平均温度低于15℃而造成对棉花生长发育的影响时，称为冷害(Yin,2002)。2001年7月31日-8月3日连续低温、降水，最低温连续11-13℃，导致昌吉、石河子、奎屯26.7×104hm² 棉花减产40%-50%，纤维品质下降1-2级，经济损失20×10⁸元（Zhang  Zhang，2006）。由于东北地区大部气温较低，不少年份玉米生长季积温不足（≥10℃）,玉米生长发育较慢，成熟期推迟，导致玉米在秋霜前不能正常成熟，从而发生低温冷害，严重冷害年份(如1957、1969、1972和1976年等)玉米减产15%以上（Ma et al.2006）。我国大部分稻区都受到低温冷害的威胁，冷害发生频繁。吉林省延边地区水稻冷害发生年有1954、1956、1957、1969、1971、1972、1974、1976、1979、1980、1986、1988、1993、1995、1998、2002、2003 和2006年（Quan et al.2006）。

驯化过程中新产生的蛋白即为低温诱导蛋白，因低温驯化而表达的基因就称为低温诱导基因(cold-regulated gene， COR)。植物在低温胁迫下COR基因的转录水平会提高，而这些基因的表达又能被ABA所诱导，因此曾经有专家预测是低温信号引起植物体内ABA的大量合成，后者再诱导下游的其它基因表达，该通路称为ABA依赖信号途径(Skriver et al.，1990)。之后的研究发现COR的表达能够在ABA合成基因发生突变的植株内表达，从而证实了独立于ABA途径通路的存在，称ABA非依赖信号途径。1994 年Yamaguchi和Skinozaki首次在拟南芥rd29A 基因的启动子区域中发现了一个9bp( TACCGACAT) 的DRE 元件( dehydration responseve element)，同年又从COR15a 基因的启动子区域鉴定出另一5bp(CCGAC) 的DNA 调控元件CRT( C-repeat)。这两个元件均含有CCGAC 核心序列，即LTRE ( low-temperature responsive element) 元件。CRT/DRE 或其核心序列CCGAC 普遍存在于低温诱导基因的启动子中，可促使低温、干旱及高盐等条件下基因的表达。第一个CRT/DRE 结合因子即CBF1 转录因子的发现，是通过该转录因子激活启动子上含有CRT/DRE 元件的酵母报道基因而证实的。后来又利用探针分离了CBF2和CBF3。除了模式植物拟南芥之外，人们也从别的物种克隆了许多类CBF基因。由于CBF的启动区不含CRT/DRE序列和CCGAC基序，故该基因家族不存在自我调节现象，其上游必然有诱导其表达的物质。根据CBF的表达特性及其功能预测，Gilmour等(1998)提出了ICE-CBF通路模型。ICE1(inducer of CBF expression 1)是唯一已经鉴定直接作用于CBF启动子的转录因子，它是控制CBF基因的一个主开关。DNA结合实验表明它能与CBF基因启动子的MYC识别序列CANNTG（即Gilmour预测的ICE盒）结合（Chinnusamy et al.,2003），而ICE盒正是激活CBF基因转录的重要顺式作用元件（Zarka et al.，2003）。ICE1在常温下由于磷酸化而处于钝化状态，在低温条件下发生脱磷酸化被活化，并特异性地结合到CBF的启动子上的MYC位点，从而诱导CBF的表达。

Jaglo Ohoson (1998) 发现，CBF1 在转基因拟南芥中组成型超表达后，可使含有CRT/DRE 调控元件的COR基因在未经低温诱导的条件下表达，说明CBF1 是拟南芥低温驯化反应的重要调控因子，它通过调控COR 基因的表达水平，从而提高拟南芥的抗冻性。CBFs基因强表达后，抗冻性得到一定提高，但使转基因拟南芥植株生长缓慢，花期延迟（Gilmour et al., 2004）。Fernando等（2003）研究表明，拟南芥CBF2突变体在冷胁迫抗性，CBF1和CBF3的表达增强，耐旱、耐盐能力提高，表明CBF2是CBF1和CBF3表达的一个负调节子。ICE1的转基因拟南芥植株，与未转基因拟南芥植株相比，转基因拟南芥植株的耐寒能力有明显提高(Chinnusamy et al.,2003；Chinnusamy et al.,2006)。郑银英等（2009）也将克隆到的拟南芥ICE1基因转入烟草，结果表明瞬时低温冻害下，转基因烟草存活率明显高于对照烟草植株，说明ICE1基因可以提高低温敏感植物的抗寒性。突变体的转录组学研究表明，ICE1表达缺陷造成50%的低温诱导基因不能被低温激活。但前人关于转ICE1基因提高受体植株耐冷能力的研究，并不能控制提高受体植株耐冷能力的程度。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的不能对单个基因的甲基化特征进行重组及转基因的遗传操作的局限，提供一种能通过利用基因的甲基化定量调控基因表达，达到调控遗传性状的目的。利用ICE1基因的甲基化定量提高植株耐冷能力的冷诱导基因技术。

为了达到上述目的，本发明提供了基因甲基化在调控基因表达方面的应用，通过分离克隆或人工合成不同甲基化水平的基因，进行转基因遗传操作，调控基因表达的技术。基因DNA的甲基化位点可进行分子操作，在克隆到表达载体中和进行转基因时，基因DNA会重新发生甲基化，恢复大部分相应的甲基化水平，从而达到对性状控制的目的。

本发明还提供了一种紫茎泽兰冷诱导基因AaICE1，核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的蛋白质多肽序列为SEQ ID NO：3，或核苷酸序列为SEQ ID NO：2，编码的蛋白质多肽序列为SEQ ID NO：4。拟南芥ArICE1基因，编码的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，该基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。或为与上述氨基酸序列相比具有不小于82%同源性的氨基酸序列，或基因序列中包含bHLH特征结构的基因。

其中，紫茎泽兰AaICE1基因的甲基化位点数为50～66个，前1209bp区域的甲基化位点数为44～60个。拟南芥ArICE1基因的甲基化位点数为6～20个，前1209bp区域的甲基化位点数为3～14个。

对植物ICE1基因甲基化的研究发现，植物耐冷性与ICE1基因甲基化程度，特别是前1209bp区域的甲基化程度呈负相关关系。

如：紫茎泽兰耐寒性种群HGG（贵州黄果树种群，AaICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：7）、中度耐寒性种群JHY（云南景洪种群，AaICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：8）和DLY（云南大理种群，AaICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：9）、冷敏感种群BSG（广西百色种群，AaICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10） AaICE1基因前1209bp区域内的甲基化位点数分别为44、53、56和60个，甲基化程度分别为3.64%、4.39%、4.63%和4.96%，要较整个基因序列的甲基化程度提高，这也说明甲基化的差异和重要性主要集中在前1209bp区域内，相应的贵州黄果树种群（HGG）最高为96.67%、云南景洪（JHY）和云南大理（DLY）种群分别为78%和67.67%、耐寒性广西百色种群（BSG）最低为34.67%。

如：拟南芥耐寒性种群At-1（英国种群1，ArICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：12）、中度耐寒种群At-2（英国种群2，ArICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：13）、At-5（塔吉克斯坦种群，ArICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：14）、At-7（俄罗斯种群，ArICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：15）和At-13（哈萨克斯坦种群，ArICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：16）、冷敏感种群At-14（波兰种群，ArICE1的核苷酸序列为SEQ ID NO：17）ArICE1基因前1209bp区域内的甲基化位点数分别为3个、3个、6个、8个、9个和14个，甲基化程度分别为0.25%、0.50%、0.70%、0.66%和1.20%，要较整个基因序列的甲基化程度提高，这也说明甲基化的差异和重要性主要集中在前1209bp区域内。

利用植物耐冷性与ICE1基因甲基化程度呈显著负相关，可以设计和人工合成甲基化程度不同的核苷酸序列，从而人为定量控制植物耐冷性。如核苷酸序列为SEQ ID NO：11的AaICE1s基因。

本发明还提供了一种上述冷诱导基因的表达载体，该表达载体为植物转化质粒。

利用冷诱导基因进一步构建包含表达构件的植物转化质粒时，表达构件包括启动子，冷诱导基因和终止子。在转化单子叶植物时启动子可以是玉米Ubiqutin启动子、水稻Actin启动子或其他启动子，终止子可以是根癌农杆菌终止子或者其他终止子。转化双子叶植物时启动子可以是35S启动子或其他启动子。这个表达构件可以通过农杆菌（如Agrobacterium菌株GV3101）转入整合到植物的基因组中，稳定遗传和表达。

利用本发明提供的基因甲基化调控的遗传操作技术，基因甲基化位点可在真核表达载体和转基因材料间进行部分遗传，从而达到对植物性状控制的目的。

本发明还提供了上述冷诱导基因在制备耐寒植株方面的应用。利用不同甲基化程度ICE1基因制备不同耐冷性植株，可通过含有上述冷诱导基因表达构件的植物转化质粒获得。各种植物的转化方法和步骤有所不同，同种植物不同品种也可能存在差异。但是植物转化的技术和方法是已知和成熟的。通常通过农杆菌或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体，然后根据标记基因进行筛选，获得转化植株，经过生根培养基培养就可以获得可以种植的种苗。也可以通过花粉介导法，通过农杆菌导入植物的花粉从而获得转基因种子。具体制备步骤如下：

（1）利用DNA重组技术，构建含有所述冷诱导基因的植物转化质粒；

（2）将步骤（1）中构建的植物转化质粒通过基因枪或农杆菌浸染方法或花粉介导法导入植物组织，利用标记基因进行筛选含有冷诱导基因的转基因植株；

本发明适用于所有植物，包括双子叶和单子叶植物。植物可选取香蕉、水稻、玉米、棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、马铃薯、甘薯、谷子、大麦、甘蔗、烟草、桃、梨、蔬菜（青菜、白菜、黄瓜、芹菜、辣椒、茄子）等。

本发明相比现有技术具有以下优点：第一，基因在遗传操作过程中，会在载体和受体生物中发生甲基化，这种甲基化尽管仍主要发出在胞嘧啶碱基上，但是，多随机发生。有时会导致遗传操作的目标基因沉默，更难以控制其通过甲基化调节基因表达的效应实现。本发明通过针对不同甲基化水平基因的克隆或人工合成不同甲基化水平的目的基因，进行遗传操作，其大部分的甲基化位点可以在载体并特别是在受体生物中恢复甲基化，从而可以保证来源目的基因的甲基化位点和水平，达到通过甲基化水平体外遗传操作调控基因的目的。实现表观遗传学的体外遗传操作。第二，本发明基于自然界的生物基因的天然甲基化并利用其表观遗传多样性的甲基化水平和位点，进行克隆或人工模拟合成，再进行遗传操作，培养转基因生物。可以保证转基因生物的遗传多样性，使遗传改良生物具有更强的适应能力。第三，本发明还为利用同种生物的基因的表观遗传多样性，遗传改良生物提供了技术途径。由于基因是本种来源，在培育更优良的作物后的生态环境和食品安全风险要低于不同生物类别的异源基因。第四，本发明利用植物天然耐寒性为基础，通过比较同种植物不同地理种群耐寒性的差异，获得该植物的耐冷性种群、中度耐冷种群和冷敏感种群，并利用RACE和Tail-PCR技术分别克隆它们的ICE1基因和启动子，比较不同耐冷性种群ICE1基因的甲基化程度，发现其耐冷性是与其甲基化水平呈反比，进一步在拟南芥中证明了转不同甲基化程度ICE1基因的拟南芥耐冷能力提高程度不同，为培育耐寒作物提供了新的选择。虽然ICE1基因是通过CBF基因发挥作用，但是转CBF基因后的植株耐寒能力有一定提高，但植株生长受抑制，实际应用价值较低；而ICE1基因作为植物组成型表达的基因，超表达后可明显提高植株耐寒能力，且对植株表型没有影响。不过，在不了解ICE1基因受甲基化程度控制基因表达量之前，培育转ICE1基因植物的耐冷程度是盲目的也是有限的，而本发明可以利用不同甲基化水平的ICE1基因定量实现耐冷能力的提高，特别是培育更高耐冷能力的植物，甚至是高出2倍耐冷能力的植物。还使得转基因植物在耐冷能力方面保持多样性。

具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1. 紫茎泽兰不同地理种群耐寒性比较

通过比较紫茎泽兰低温处理下的冷害指数，及使用Imaging-PAM和Handy-PEA三种方法，对34个地理种群的耐寒性进行比较。无菌苗生根移栽后，当第4对叶片完全展开时，选取生长健壮、大小一致的植株为实验材料。植株置于-5℃（晚上14 h），25℃光照培养箱（白天10 h）中进行间歇低温胁迫。在整个胁迫过程中，相对湿度保持在80%。间歇低温胁迫重复处理4次，每次处理每个紫茎泽兰种群15株，进行数据统计分析。期间测定各处理的荧光参数，比较荧光参数的变化。结果显示，低温处理4 d后，广西百色种群（BSG）冷害指数最低（34.67%）、Y(II) 、PI（abs）下降幅度最大（90.25%和97.31%），为冷敏感种群；云南大理（DLY）和云南景洪（JHY）种群为中度耐冷种群，冷害指数分别为67.67%和78%，Y(II) 下降幅度分别为70.10%和66.89%、PI（abs）下降幅度分别为74.02%和63.71%；贵州黄果树种群（HGG）为耐冷种群，冷害指数为96.67%最高，Y(II) 、PI（abs）下降幅度分别为49.95%和52.00% (如下表1所示)。

实施例2. ICE1基因克隆和启动子序列扩增

以贵州黄果树种群总RNA反转录产物为模板，利用ICE1基因保守序列设计引物，进行RT-PCR反应，将扩增得到的片段克隆至pMD19-T载体中，进行测序及BLAST比较。

得到保守区的序列后，再通过RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术，进行ICE1基因的全长克隆。试剂盒BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司，获得ICE1基因的3’端和5’端序列。

最后，将保守区、3’端序列，5’端序列进行拼接，获得ICE1基因的cDNA的全长序列，并进行全长扩增。这个基因的核苷酸序列为SEQ ID NO : 1，其编码的氨基酸为SEQ ID NO :2，命名为AaICE1。利用上述方法扩增得到其他种群ICE1基因全长。

实施例3. AaICE1基因启动子序列扩增

用Tail-PCR对紫茎泽兰目的基因AaICE1的5’端侧翼序列进行扩增，根据AaICE1基因设计特异性引物和锚定引物，4轮PCR后得到目的基因AaICE1的5’端侧翼序列。

实施例4. AaICE1基因甲基化位点比较

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，设计特异性引物进行目的基因扩增，扩增片段长500bp，将扩增得到的片段克隆至pMD19-T载体中，各进行10个单克隆测序。亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶突变为尿嘧啶，PCR扩增时复制为胸腺嘧啶。用Clone Manager进行连接后比对，序列中的胞嘧啶位点为AaICE1基因的甲基化位点。比较各种群紫茎泽兰AaICE1基因（核苷酸序列SEQ ID NO：7～10）的甲基化位点发现，紫茎泽兰种群耐寒性与AaICE1基因的甲基化成都呈显著负相关，表现为耐冷性种群AaICE1基因的甲基化程度最低，为50个，中度耐冷种群次之，为61-63个，冷敏感种群AaICE1基因的甲基化程度最高，为66个。

对紫茎泽兰ICE1基因甲基化程度与种群耐寒性进行相关性分析，结果显示两者呈显著负相关关系，而进一步对紫茎泽兰ICE1基因前1209bp内的甲基化程度与种群耐寒性进行相关性分析，显示负相关关系更为显著，说明ICE1基因的甲基化特别是前1209bp内的甲基化程度在调节种群耐寒性方面发挥重要作用。

对其它紫茎泽兰种群的分析如下表1所示：

表1  紫茎泽兰采集样地自然地理信息、种群耐寒性及甲基化位点

注：括号内数字为3次重复实验的标准误，每列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

用荧光定量PCR分析耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY及冷敏感种群BSG的AaICE1基因和AaCBF1基因的表达量。常温下各种群AaICE1基因可以表达，HGG、JHY、DLY和BSG表达量分别为19.20、15.63、15.16和12.00,4℃处理0.5h时表达量分别为25.76、11.53、11.4和9.5，处理4h时表达量分别为20.50、19.50、19.00和15.60。AaCBF1基因常温下均不表达，4℃处理0.5h时HGG、JHY、DLY和BSG表达量分别为5.12、3.13、4.17和2.33，处理4h时表达量分别为14.79、11.10、11.25和8.50。此结果显示，耐冷种群中AaICE1基因和AaCBF1基因的表达量均高于冷敏感种群，而AaICE1基因作为上游调节因子，在紫茎泽兰耐冷调节中发挥关键作用。

实施例5. AaICE1s基因的体外合成及烟草遗传转化

ICE1基因体外合成利用DNA合成仪，采用DNA固相合成的方法进行AaICE1s基因的体外合成。合成过程为：第一个碱基的3’末端固定在树脂上，下一个碱基的5’-OH用二对甲氧三苯甲基DMT保护，碱基上的氨基用苯甲酸保护，然后对3’-OH用氨基磷酸化合物进行活化。上一个碱基的5’-OH和下个碱基的3’-OH形成亚磷酸三酯，然后用碘氧化成磷酸三酯，加入二氯乙酸除去第二个碱基5’-OH上的保护剂DMT，循环进行加入下一个碱基，基因合成底物为dATP，dTTP, dGTP和dCTP或5-甲基化dCTP（甲基化位点）。合成完毕后，用苯硫酚除去5’-OH上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将片段与固体树脂断开，洗脱，用浓氢氧化铵在加热的条件下除去碱基上的保护剂除去氢氧化铵，真空抽干，液相色谱或者PAGE，回收最长的片段。分别合成了未甲基化及具有50和2个甲基化位点的AaICE1s基因。

通过农杆菌介导的遗传转化，分别将合成的具有不同甲基化程度的AaICE1s基因转移到烟草中。转基因实验过程如下：（1）农杆菌活化。共培养：将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L)上，25℃暗培养4天。（2）抗性芽的筛选：将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L+Kan100mg/L+Carb500mg/L)上，2-3周后即可生芽。（3）生根：待抗性芽长到1cm左右时，将其转移到生根培养基(MS+Kan100 mg/L+Carb500mg/L)上，1-2周后即有不定根形成。将烟草无菌苗移温室栽，长有6-8片真叶时，分别涂抹50μg/ml 的Kan溶液。继续培养一周观察烟草叶片的变化，敏感的植株叶片发生黄化，而抗性植株生长正常。

该实验分别获得了转未甲基化及具有50个甲基化位点的AaICE1s基因的烟草植株31棵和28棵。4℃低温处理条件下，转未甲基化及具有50个甲基化位点的AaICE1s基因的烟草植株的耐寒性较野生型植株分别提高了1.1和2.7倍。

实施例6. 真核表达载体的构建

一般地含有35S 启动子的植物表达载体比较适合外源基因向双子叶植物的转移，启动效率很强，容易在转基因后代中转录和表达。终止子较常用的是胭脂碱合成酶基因终止子NOS，标记基因可以是新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（luc）、绿色荧光蛋白基因(gfp)或者β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）等等。以植物表达载体pBI121- AaICE1的构建为例：利用DNA重组技术，将AaICE1基因克隆至植物表达载体pBI121中，通过酶切、电泳鉴定AaICE1基因已成功构建到植物表达载体pBI121中；然后将重组质粒pBI121- AaICE1通过冻融法导入根癌农杆菌GV3101中，Kan平板筛选阳性克隆，生长的单菌落进行PCR鉴定，证明重组质粒已转入根癌农杆菌GV3101中。对于不同的植物可选择不同的表达载体，也可对其进行重组和改造，例如替换或增加启动子、终止子或标记基因。

实施例7. 转不同耐冷性种群AaICE1基因及AaICE1s基因拟南芥的获得

目前常用的转基因方法主要有农杆菌介导转化法、激光微束穿刺法、PEG法、电击法、微注射法和花粉介导法等。以花粉管介导法为例介绍转AaICE1基因拟南芥的获得。将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液（OD=0.8）中5分钟，同时轻轻旋转。将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态，暗室培养24小时。种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。收集到的拟南芥种子于4℃春化2天，种子消毒后在含有Kan 50μg/ml抗生素的平板上进行培养。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。将筛选到的植株移植到蛭石：泥炭土：珍珠岩为9:3:1的基质中，覆盖薄膜2-3天。

实施例8. 转AaICE1基因拟南芥植株分子鉴定

对筛选到的转基因拟南芥一代和二代植株提取DNA，分别进行目的基因AaICE1的扩增，上游引物为根据35S启动子设计，下游引物为AaICE1基因的特异性引物。结果显示，AaICE1基因已经转移到拟南芥中，且可以稳定遗传，转基因二代植株发生部分转基因沉默，基因表达与基因沉默符合3:1。

实施例9. 转不同耐冷种群AaICE1基因及AaICE1s基因拟南芥植株耐寒性比较

将野生型和转基因二代拟南芥植株在光照培养室内正常培养至苗龄4周后，4℃冷适应3天，0℃放置1小时，-4℃放置4小时，然后每小时下降2℃，直至-8℃，处理24h后，23℃培养5 d，观察野生型和转基因拟南芥二代植株的低温伤害情况，每个处理重复3次，统计培养5 d后的低温伤害指数。结果显示，野生型植株全部死亡，低温伤害指数为1；转耐冷种群AaICE1基因拟南芥（SEQ ID NO：26）低温伤害指数为0.61，转中度耐冷种群AaICE1基因拟南芥（SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25）低温伤害指数分别为0.77和0.74，转冷敏感种群AaICE1基因（SEQ ID NO：23）拟南芥低温伤害指数为0.89，转AaICE1s基因拟南芥（SEQ ID NO：27）低温伤害指数为0.90。

实施例10. 转不同耐冷种群AaICE1基因拟南芥植株冷诱基因表达量

测定野生型与转不同耐冷性种群AaICE1基因二代拟南芥材料在4℃低温胁迫下内外源冷响应基因ICE1、CBF3、COR47的表达量。结果显示，转基因拟南芥中内源ICE1基因正常表达，外源基因AaICE1在转基因拟南芥中可以表达，转基因拟南芥中冷响应基因CBF3、COR47的表达量高于野生型拟南芥。转不同耐冷性种群AaICE1基因拟南芥中冷响应基因表达量不同，表现为转黄果树种群AaICE1基因拟南芥中ICE1、CBF3、COR47表达量最高而转百色种群AaICE1基因拟南芥中表达量最低。

实施例11.真核表达载体和转基因拟南芥中AaICE1基因甲基化位点比较

对真核表达载体和转基因拟南芥中AaICE1基因甲基化位点比较发现，真核表达载体中AaICE1基因的甲基化程度显著降低，而转基因拟南芥中AaICE1基因的甲基化程度均明显升高。紫茎泽兰耐冷性种群、中度耐冷种群和冷敏感种群中AaICE1基因及合成AaICE1s基因（核苷酸序列为SEQ ID NO：7～11）的甲基化程度分别为3.32%、4.05%或4.18%、4.38%及0%，而在真核表达载体中AaICE1基因（核苷酸序列为SEQ ID NO：16～24）胞嘧啶的甲基化程度在2.12%-2.39%之间；转基因拟南芥中AaICE1基因（核苷酸序列为SEQ ID NO：23～27）胞嘧啶的甲基化程度分别为4.12%、4.91%或5.05%、5.38%及4.32%。

真核表达载体和转基因拟南芥中AaICE1基因甲基化位点与紫茎泽兰AaICE1基因甲基化位点相比，具有部分相同位点。真核表达载体和转基因拟南芥中，AaICE1基因甲基化位点中有50%-65%与紫茎泽兰AaICE1基因甲基化位点相同。

实施例12. 转不同耐冷性种群AaICE1基因香蕉的获得

以香蕉胚性悬浮细胞系为转化受体，取在继代培养10d的香蕉ECS，离心去上清后，每1mL细胞密实体积ECS加入40mL含有不同耐冷性种群AaICE1基因的农杆菌GV3101，(27±1)℃，黑暗静置1-2h，然后将其进行共培养。共培养条件为：黑暗条件下，(27±1)℃，50 r/min转速下振荡培养24h，然后将培养物静置去上清，再加入40mL 的液体培养基，将转速提高至110r/min，连续共培养7d。将共培养完成后的培养物静置去上清，加入香蕉ECS液体筛选培养基40 mL，(27±1)℃，转速100 r/min振荡培养，每10-14d继代一次，连续继代3 代以上。继代的方法是：取前一代 0.1-0.5 mL细胞密实体积的ECS加入到新鲜液体筛选培养基中继续振荡培养。同时，将每代继代剩余的ESC以及原共培养完成后的ESC用半固体筛选培养基进行筛选作为对照。采用半固体筛选时，先用含头孢霉素(Cef) 500 mg/L的M2培养基洗涤2-3次，无菌纸吸干多余培养基，转接到半固体筛选培养基上进行胚诱导，每个月更换一次体胚诱导培养基直到胚成熟。取液体筛选培养3代以后的ECS静置去上清，然后将其均匀铺于体胚诱导培养基M3上，黑暗培养2-3个月，每个月更换一次体胚诱导培养基直到胚成熟，将成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基上，光/暗(12h/12h)条件下培养至体胚萌发得到小苗，然后将小苗转移至生根培养基上，光/暗(12h/12 h)条件下进行培养，即获得完整的转化植株。本实验共获得19株转基因植株。4℃低温处理条件下，转紫茎泽兰耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY、冷敏感种群BSG及合成ICE1基因（AaICE1s基因）香蕉植株的耐寒性较野生型香蕉分别提高了2.0、1.6、1.5、0.9和0.8倍。

实施例13. 转不同耐冷性种群AaICE1基因水稻的获得

    选取成熟种子(去壳)用升汞法( 0.1%升汞浸泡15 min，灭菌水清洗干净) 消毒后，置于超净台上晾干，然后将胚放置于愈伤诱导培养基( 4.4 g/L MS + 2.5 mg/L 2,4-D + 600 mg /L干酪素+ 30g/L蔗糖+5g/L植物凝胶，KOH调至pH5.8，高压灭菌) 上进行愈伤培养，28 ℃培养2周后统计出愈率。将携带质粒 PBI121-AaICE1的农杆菌 GV3101接种到5 ml含50 mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28 ℃摇菌培养至对数生长期晚期，再以1:100 体积扩大培养，在 OD600为0.10时收集农杆菌菌体并重悬于侵染培养基中。按常规方法侵染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养侵染后，置于含25 mg/L 卡那霉素的传代培养基上，28℃暗培养12-16d后，转移至卡那霉素浓度为50 mg/L的继代培养基上继续筛选培养，在再分化培养基上分化得到卡那霉素抗性的阳性苗。转基因实验共获得转基因植株30棵。5℃冷处理条件下，转紫茎泽兰耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY、冷敏感种群BSG及合成ICE1基因水稻植株的耐寒性较野生型水稻分别提高了2.1、1.5、1.5、0.8和0.9倍。

实施例14. 转不同耐冷性种群AaICE1基因油菜的获得

以花粉介导法进行油菜转基因实验。进入油菜盛花期后，选取主茎或一次分枝上10-15个1-2d内将要开放的花蕾徒手去雄，并摘除所选茎或分枝上其他花蕾，然后套袋。同时在同一品种中选取第2天将开放的花序进行套袋,以备第2天取粉用。翌日上午当天开放的套袋植株的花粉约0.4 g，悬浮在25 ml 7.5%的蔗糖溶液中，进行第1次超声波处理，然后在溶液中加入20μg含不同耐冷性种群AaICE1基因的质粒DNA进行第2次超声波处理。第2次处理后，在溶液中加入10μL 1/10 000(W/V)硼酸，然后用处理过的花粉授在前一天去雄的油菜柱头上，套袋并挂牌，同时标注授粉花蕾数。授粉后5-6 d去袋，使处理的授粉株充分发育。采收种子。采收的种子种植后，至两片子叶伸展开时喷施50mg/L的Kan溶液，光照培养7d后，未转基因植株叶边缘变黄，而转基因植株正常生长。该实验共获得转基因植株43棵。-10℃处理条件下，转紫茎泽兰耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY、冷敏感种群BSG及合成ICE1基因油菜植株的耐寒性较野生型油菜分别提高了2.4、1.9、1.8、1.3和1.3倍。

实施例15. 转不同耐冷性种群AaICE1基因小麦的获得

采集扬花后12-14d的麦穗，取小麦幼穗中部大小一致的未成熟子粒，将幼胚接种在愈伤组织诱导培养基表面，25℃下暗培养，20d后转入相同培养基进行继代培养。将幼胚接种在MC培养基上，培养15-20d，待幼胚形成的愈伤组织发育完全后，放人4℃冰箱，冷处理2个月左右，然后在常温下继代培养。8月上中旬将愈伤组织转入MC+乙酰丁香酮(AS)0. 1mmol/L培养基中，培养5-7d开始转化。将幼胚愈伤组织转入工程菌感染液中0.5 -1.0 h，然后转移到MD培养基+AS 0.1mmol/L，共培养2d，用含有0.5g/L头孢唑林钠的无菌水冲洗愈伤组织，然后用无菌卫生纸吸干多余的液体，将愈伤组织转MD+500 mg/L Carb + 5 mg/L PPT培养基进行筛选，筛选出的抗性愈伤组织转入ME分化培养基+0.5g/L头孢唑林钠+PPT。分别在PPT 1、2、3mg/L的3个浓度下，通过6-8周的选择培养后，转入再生培养基MD+IAA 1mg/L+ZT 1mg/L，再生成苗。转基因实验共获得转基因植株23棵。-10℃处理条件下，转紫茎泽兰耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY、冷敏感种群BSG及合成ICE1基因小麦植株的耐寒性较野生型小麦分别提高了2.0、1.3、1.3、0.7和0.5倍。

实施例16. 转不同耐冷性种群AaICE1基因玉米的获得

温室条件下对受体材料以7d为周期分期播种，玉米试材按试验需要进行控制授粉，授粉后10-13d，取玉米幼胚作为转化受体。用次氯酸钠消毒玉米棒后，剥出幼胚 (剥幼胚时要谨慎，不要创伤胚)，用侵染液(加AS)清洗幼胚4遍，然后加入一定浓度的农杆菌菌液，放置10-30 min，取出后用灭菌滤纸吸干，放到共培养培养基上，在25℃(黑暗)共培养2-5d，然后将幼胚转移到静息培养基，在28℃条件下暗培养7d。侵染和共培养环节菌液浓度OD500=0.3-0.5，侵染时间10 min)、共培养时间3d。从静息培养基上把幼胚移入含有标记基因的抗性筛选培养基上，暗培养。每次继代注意淘汰呈褐色和水渍化的愈伤组织，并把生长正常的愈伤组织用镊子夹碎，分开选择培养。在继代筛选过程中注意经常观察发现污染或农杆菌复出的立即移出，未污染材料继续培养。另外，经常把出现褐化污染的组织块剔出或转移好的未被污染的组织块到新的相同培养基上。组织块膨大后，经常把大块组织剥小，连续继代筛选3次后，将选择到的抗性愈伤组织转到再生Ⅰ培养基上，恢复培养15d或更长时间(暗培养)。再将抗性愈伤组织转到再生Ⅱ培养基上发芽，培养条件为28℃，每日3000lx光强下，光照12h。待再生的玉米植株长到3片叶时，可将幼苗分移植到含生根培养基的瓶中，在室内培养。当幼苗长出较粗的根后，将幼苗从罐头瓶中取出，用水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小花盆中，当玉米又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中，待长出三四叶后提取叶片DNA进行PCR检测。确定含有转入的AaICE1基因。本实验共获得转基因玉米植株39棵。6℃低温处理条件下，转紫茎泽兰耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY、冷敏感种群BSG及合成ICE1基因玉米植株的耐寒性较野生型植株分别提高了2.3、1.6、1.7、1.0和1.1倍。

实施例17. 转不同耐冷性种群AaICE1基因棉花的获得

大量提取植物表达载体质粒DNA，选择次日将开放的花蕾进行自交。由于棉花是常异交植物，天然异交率在10%左右，因而外来花粉往往会造成品种间的混杂。在开花前一天，可见花冠快速伸长，黄色或乳白色的花冠呈指状突出于花蕾，次日即开放成为花朵。选择这样的花蕾，于指状花冠的前端用细线扎紧，并将细线的另一端系于铃柄，作为收获时的标记；在开花后20-24h左右即次日，选择果枝和花位较好的幼子房作为转化对象。一般选择每个果枝的第一和第二个果节位的花朵进行转基因操作。这些果节上的棉铃一般成铃率较高，有利于收获较多的种子；用50μl微量进样器作为微注射的工具。每次使用前和使用后，应以淡洗涤剂清洗，再用蒸馏水漂清；注射时，摘除或剥去花瓣，抹平花柱。在剥除花瓣时，注意不能损伤幼子房的表皮层，以免增加脱落率；用右手持微量注射器，左手轻扶摘除花瓣后的幼子房，从抹平花柱处沿子房的纵轴方向进针至子房长度的约三分之二处，并后退至约三分之一处。

花粉管通道法转化得到的棉花种子(T₀代)收获后于在温室盆栽幼苗，在2-3叶期，以Kan（50μg/ml）喷洒棉花叶片。一周后观察植株生长状况，拔除叶片表面有退绿斑点的植株。生长正常的被认为是获得抗性基因的植株。本实验共获得转基因植株44棵。4℃低温处理条件下，转紫茎泽兰耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY、冷敏感种群BSG及合成ICE1基因棉花植株的耐寒性较野生型植株分别提高了2.7、1.9、2.0、1.3和1.2倍。

实施例18. 转不同耐冷性种群AaICE1基因烟草的获得

农杆菌活化；共培养：将侵染过的叶块摆放在铺有2层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L)上，25℃暗培养4天；抗性芽的筛选：将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA2mg/L+Kan100mg/L+Carb500mg/L)上，2-3周后即可生芽。生根：待抗性芽长到1cm左右时，将其转移到生根培养基(MS+Kan100 mg/L+Carb500mg/L)上，1-2周后即有不定根形成。将烟草无菌苗移温室栽，长有6-8片真叶时，分别涂抹50μg/ml 的Kan溶液。继续培养一周观察烟草叶片的变化，敏感的植株叶片发生黄化，而抗性植株生长正常。该实验共获得转基因植株31棵。4℃低温处理条件下，转紫茎泽兰耐冷种群HGG、中度耐冷种群DLY和JHY、冷敏感种群BSG及合成ICE1基因烟草的耐寒性较野生型植株分别提高了2.3、1.4、1.3、0.8和0.8倍。

实施例19.不同地区拟南芥耐寒性比较与ArICE1基因甲基化位点比较

对拟南芥种群At-1、At-2、At-5、At-7、At-13和At-14进行了耐寒性比较（同实施例1）和ArICE1基因甲基化位点检测。结果显示，拟南芥种群耐寒性与采集地的年均温显著相关，At-1耐寒性最强，At-2、At-5、At-7、At-13种群次之，At-14种群最弱（表2）。At-1、At-2、At-5、At-7、At-13和At-14种群ArICE1基因（核苷酸序列SEQ ID NO：12～17）的甲基化位点数分别为5个、6个、9个、12个、14个和20个，甲基化程度分别为0.24%、0.29%、0.44%、0.59、0.68%和0.98%。ArICE1基因的甲基化程度与种群耐寒性呈负相关关系，耐寒性强的种群ArICE1基因甲基化程度较低。

对拟南芥ICE1基因甲基化程度与种群耐寒性进行相关性分析，结果显示两者呈显著负相关关系，而进一步对拟南芥ICE1基因前1209bp内的甲基化程度与种群耐寒性进行相关性分析，显示负相关关系更为显著，说明ICE1基因的甲基化特别是前1209bp内的甲基化程度在调节种群耐寒性方面发挥重要作用。

表2  拟南芥采集样地自然地理信息、种群耐寒性及甲基化位点

注：括号内数字为3次重复实验的标准误，每列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

实施例20. 转不同拟南芥耐寒性种群ArICE1基因拟南芥植株的获得

用花粉管介导的转基因方法将At-1、At-7和At-14种群ArICE1基因转移到野生拟南芥中。盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液（OD=0.8）中5分钟，同时轻轻旋转。将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态，暗室培养24小时。种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。收集到的拟南芥种子于4℃春化2天，种子消毒后在含有Kan 50μg/ml抗生素的平板上进行培养。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡。将筛选到的植株移植到蛭石：泥炭土：珍珠岩为9:3:1的基质中，覆盖薄膜2-3天。低温处理条件下，转At-1、At-7和At-14种群ArICE1基因拟南芥植株的耐寒性较野生型植株分别提高了2.9、2.2和1.7倍。

<110>南京农业大学

<120>基因甲基化在调控基因表达方面的应用

<160> 25

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 1

<211> 1506

<212> DNA

<213> 紫茎泽兰（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

<400> SEQ ID NO: 1 

atgcttcccg ccggcggttc tatctggatg gccggagaac caagccaaga cgaaacatct      60

tcatggtcac ccacaaccca caacatcacc ggaattgaac ccactgcaac atcatgcaac     120

gacgctgacg accaccaccg catcaccacc aacgccacca gttattcatc tctcaccacc     180

ttgaaatcaa tgctggaaac cgaatggtat caccaccaca acaatctgaa tctcccttcc     240

gacggtaact ctctgttctt acccatggat tcatcgtctt cgtgttctcc gtcgcaatct     300

cataatcagt ttacccaatc ttcttacccc ttttttccac ccaaattcaa taacaatttg     360

aacaacccgt atgatctgcc gtttgatttc ggatgcgaat ctgctttctt accgaatcac     420

acttccaatt tgatgagttt tgctggttta tcttctcaaa atcacatccc catgccggag     480

atttcgtcca gttccgactt tccggcgacc aacaataaca acagcaacga caccggcgac     540

attgtaggac ccggtttcaa cccgaattta actgggttcg acggatttca cggcactgta     600

ccccaaactt cattgtttcc ggcgaggtct aaggttctcc ggccgcttga gatttctcca     660

ccggtcggag ctcagcctac actgtttcaa aaacgggcgg cgttacggca aagctcaggc     720

aaattgggtc cggttgaaaa tgaaaagaaa cggaagagaa gtgaggaaga tgaattcgat     780

gaaacgggta cgattgatgt ttctggattc aattacgatt ccgatgaaat tgaaccgatt     840

ggtgagcttg ctaacggaaa tggtgaaagc agttttgtta ccattggagg tgagaatcaa     900

agaggtaaga aaaaggggtt acctgcaaag aatttaatgg cggagagacg acggaggaag     960

aagctcaatg acagactgta tatgcttaga tcagttgtcc ccaaaattag caagatggat    1020

agagcttcga ttcttggtga cgcgattgat tacttgaagg aactactaca aaaaatcaat    1080

gatcttcata atgaacttga ggcaacacca caagggtctt tgatgcaaac ttcatcaagc    1140

atgcatcccc taacacccac ctcgccggcc cttctgcaac atgtcaaaga agaactatgt    1200

ccaaccgcca ccaacaacat tctcggcccc aaaaaccatc ttgcaaaggt cgaagtatat    1260

gcaaaagaag cgaggggtgt gaacatccac atgctgtgcg ggcgcagacc gggtctctta    1320

ctttctacat tgagggctct ggacaacctt gggctggaca ttcaacaagc tgtcataagc    1380

tgtttcaatg ggtttgcttt ggatgtattt cgagcccagc aatgtaggga agggcaggat    1440

atgttgcctg agcaaataaa agcagtgctt ctagagacag ctggatatca tcatggtgcc    1500

atttaa                                                                           1506     

<210> 2

<211> 1512

<212> DNA                                                                                                         

<213>紫茎泽兰（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

<400> SEQ ID NO: 2

atgcttcccg ccggcggttc tatctggatg gccggagaac caagccaaga cgaaacatct      60

tcatggtcac ccacaaccca caacatcacc ggaattgaac ccactgcaac atcatgcaac     120

gacgctgacg accaccacca ccaccgcatc accaccaacg ccaccagtta ttcatctctc     180

accaccttga aatcaatgct ggaaaccgaa tggtatcacc accacaacaa tctgaatctc     240

ccttccgacg gtaactctct gttcttaccc atggattcat cgtcttcgtg ttctccgtcg     300

caatctcata atcagtttac ccaatcttct tacccctttt ttccacccaa attcaataac     360

aatttgaaca acccgtatga tctgccgttt gatttcggat gcgaatctgc tttcttaccg     420

aatcacactt ccaatttgat gagttttgct ggtttatctt ctcaaaatca catccccatg     480

ccggagattt cgtccagttc cgactttccg gcgaccaaca ataacaacag caacgacacc     540

ggcgacattg taggacccgg tttcaacccg aatttaactg ggttcgacgg atttcacggc     600

actgtacccc aaacttcatt gtttccggcg aggtctaagg ttctccggcc gcttgagatt     660

tctccaccgg tcggagctca gcctacactg tttcaaaaac gggcggcgtt acggcaaagc     720

tcaggcaaat tgggtccggt tgaaaatgaa aagaaacgga agagaagtga ggaagatgaa     780

ttcgatgaaa cgggtacgat tgatgtttct ggattcaatt acgattccga tgaaattgaa     840

ccgattggtg agcttgctaa cggaaatggt gaaagcagtt ttgttaccat tggaggtgag     900

aatcaaagag gtaagaaaaa ggggttacct gcaaagaatt taatggcgga gagacgacgg     960

aggaagaagc tcaatgacag actgtatatg cttagatcag ttgtccccaa aattagcaag    1020

atggatagag cttcgattct tggtgacgcg attgattact tgaaggaact actacaaaaa    1080

atcaatgatc ttcataatga acttgaggca acaccacaag ggtctttgat gcaaacttca    1140

tcaagcatgc atcccctaac acccacctcg ccggcccttc tgcaacatgt caaagaagaa    1200

ctatgtccaa ccgccaccaa caacattctc ggccccaaaa accatcttgc aaaggtcgaa    1260

gtatatgcaa aagaagcgag gggtgtgaac atccacatgc tgtgcgggcg cagaccgggt    1320

ctcttacttt ctacattgag ggctctggac aaccttgggc tggacattca acaagctgtc    1380

ataagctgtt tcaatgggtt tgctttggat gtatttcgag cccagcaatg tagggaaggg    1440

caggatatgt tgcctgagca aataaaagca gtgcttctag agacagctgg atatcatcat    1500

ggtgccattt aa                                                                  1512

<210> 3

<211> 501

<212> PRT

<213>紫茎泽兰（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

<400> SEQ ID NO: 3 

Met Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ile Trp Met Ala Gly Glu Pro Ser Gln

1               5                   10                  15     

Asp Glu Thr Ser Ser Trp Ser Pro Thr Thr His Asn Ile Thr Gly Ile

            20                  25                  30         

Glu Pro Thr Ala Thr Ser Cys Asn Asp Ala Asp Asp His His Arg Ile

        35                  40                  45             

Thr Thr Asn Ala Thr Ser Tyr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Lys Ser Met

    50                  55                  60                 

Leu Glu Thr Glu Trp Tyr His His His Asn Asn Leu Asn Leu Pro Ser

65                  70                  75                  80 

Asp Gly Asn Ser Leu Phe Leu Pro Met Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser

                85                  90                  95     

Pro Ser Gln Ser His Asn Gln Phe Thr Gln Ser Ser Tyr Pro Phe Phe

            100                 105                 110        

Pro Pro Lys Phe Asn Asn Asn Leu Asn Asn Pro Tyr Asp Leu Pro Phe

        115                 120                 125            

Asp Phe Gly Cys Glu Ser Ala Phe Leu Pro Asn His Thr Ser Asn Leu

    130                 135                 140                

Met Ser Phe Ala Gly Leu Ser Ser Gln Asn His Ile Pro Met Pro Glu

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Ser Ser Asp Phe Pro Ala Thr Asn Asn Asn Asn Ser Asn

                165                 170                 175    

Asp Thr Gly Asp Ile Val Gly Pro Gly Phe Asn Pro Asn Leu Thr Gly

            180                 185                 190        

Phe Asp Gly Phe His Gly Thr Val Pro Gln Thr Ser Leu Phe Pro Ala

        195                 200                 205            

Arg Ser Lys Val Leu Arg Pro Leu Glu Ile Ser Pro Pro Val Gly Ala

    210                 215                 220                

Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Leu Arg Gln Ser Ser Gly

225                 230                 235                 240

Lys Leu Gly Pro Val Glu Asn Glu Lys Lys Arg Lys Arg Ser Glu Glu

                245                 250                 255    

Asp Glu Phe Asp Glu Thr Gly Thr Ile Asp Val Ser Gly Phe Asn Tyr

            260                 265                 270        

Asp Ser Asp Glu Ile Glu Pro Ile Gly Glu Leu Ala Asn Gly Asn Gly

        275                 280                 285            

Glu Ser Ser Phe Val Thr Ile Gly Gly Glu Asn Gln Arg Gly Lys Lys

    290                 295                 300                

Lys Gly Leu Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys

305                 310                 315                 320

Lys Leu Asn Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile

                325                 330                 335    

Ser Lys Met Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Asp Tyr Leu

            340                 345                 350        

Lys Glu Leu Leu Gln Lys Ile Asn Asp Leu His Asn Glu Leu Glu Ala

        355                 360                 365            

Thr Pro Gln Gly Ser Leu Met Gln Thr Ser Ser Ser Met His Pro Leu

    370                 375                 380                

Thr Pro Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln His Val Lys Glu Glu Leu Cys

385                 390                 395                 400

Pro Thr Ala Thr Asn Asn Ile Leu Gly Pro Lys Asn His Leu Ala Lys

                405                 410                 415    

Val Glu Val Tyr Ala Lys Glu Ala Arg Gly Val Asn Ile His Met Leu

            420                 425                 430        

Cys Gly Arg Arg Pro Gly Leu Leu Leu Ser Thr Leu Arg Ala Leu Asp

        435                 440                 445            

Asn Leu Gly Leu Asp Ile Gln Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly

    450                 455                 460                

Phe Ala Leu Asp Val Phe Arg Ala Gln Gln Cys Arg Glu Gly Gln Asp

465                 470                 475                 480

Met Leu Pro Glu Gln Ile Lys Ala Val Leu Leu Glu Thr Ala Gly Tyr

                485                 490                 495    

His His Gly Ala Ile           

            500                      

<210> 4

<211> 503

<212> PRT

<213>紫茎泽兰（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

<400> SEQ ID NO: 4

Met Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ile Trp Met Ala Gly Glu Pro Ser Gln

1               5                   10                  15     

Asp Glu Thr Ser Ser Trp Ser Pro Thr Thr His Asn Ile Thr Gly Ile

            20                  25                  30         

Glu Pro Thr Ala Thr Ser Cys Asn Asp Ala Asp Asp His His His His

        35                  40                  45             

Arg Ile Thr Thr Asn Ala Thr Ser Tyr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Lys

    50                  55                  60                 

Ser Met Leu Glu Thr Glu Trp Tyr His His His Asn Asn Leu Asn Leu

65                  70                  75                  80 

Pro Ser Asp Gly Asn Ser Leu Phe Leu Pro Met Asp Ser Ser Ser Ser

                85                  90                  95     

Cys Ser Pro Ser Gln Ser His Asn Gln Phe Thr Gln Ser Ser Tyr Pro

            100                 105                 110        

Phe Phe Pro Pro Lys Phe Asn Asn Asn Leu Asn Asn Pro Tyr Asp Leu

        115                 120                 125            

Pro Phe Asp Phe Gly Cys Glu Ser Ala Phe Leu Pro Asn His Thr Ser

    130                 135                 140                

Asn Leu Met Ser Phe Ala Gly Leu Ser Ser Gln Asn His Ile Pro Met

145                 150                 155                 160

Pro Glu Ile Ser Ser Ser Ser Asp Phe Pro Ala Thr Asn Asn Asn Asn

                165                 170                 175    

Ser Asn Asp Thr Gly Asp Ile Val Gly Pro Gly Phe Asn Pro Asn Leu

            180                 185                 190        

Thr Gly Phe Asp Gly Phe His Gly Thr Val Pro Gln Thr Ser Leu Phe

        195                 200                 205            

Pro Ala Arg Ser Lys Val Leu Arg Pro Leu Glu Ile Ser Pro Pro Val

    210                 215                 220                

Gly Ala Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Leu Arg Gln Ser

225                 230                 235                 240

Ser Gly Lys Leu Gly Pro Val Glu Asn Glu Lys Lys Arg Lys Arg Ser

                245                 250                 255    

Glu Glu Asp Glu Phe Asp Glu Thr Gly Thr Ile Asp Val Ser Gly Phe

            260                 265                 270        

Asn Tyr Asp Ser Asp Glu Ile Glu Pro Ile Gly Glu Leu Ala Asn Gly

        275                 280                 285            

Asn Gly Glu Ser Ser Phe Val Thr Ile Gly Gly Glu Asn Gln Arg Gly

    290                 295                 300                

Lys Lys Lys Gly Leu Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg

305                 310                 315                 320

Arg Lys Lys Leu Asn Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro

                325                 330                 335    

Lys Ile Ser Lys Met Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Asp

            340                 345                 350        

Tyr Leu Lys Glu Leu Leu Gln Lys Ile Asn Asp Leu His Asn Glu Leu

        355                 360                 365            

Glu Ala Thr Pro Gln Gly Ser Leu Met Gln Thr Ser Ser Ser Met His

    370                 375                 380                

Pro Leu Thr Pro Thr Ser Pro Ala Leu Leu Gln His Val Lys Glu Glu

385                 390                 395                 400

Leu Cys Pro Thr Ala Thr Asn Asn Ile Leu Gly Pro Lys Asn His Leu

                405                 410                 415    

Ala Lys Val Glu Val Tyr Ala Lys Glu Ala Arg Gly Val Asn Ile His

            420                 425                 430        

Met Leu Cys Gly Arg Arg Pro Gly Leu Leu Leu Ser Thr Leu Arg Ala

        435                 440                 445            

Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp Ile Gln Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe

    450                 455                 460                

Asn Gly Phe Ala Leu Asp Val Phe Arg Ala Gln Gln Cys Arg Glu Gly

465                 470                 475                 480

Gln Asp Met Leu Pro Glu Gln Ile Lys Ala Val Leu Leu Glu Thr Ala

                485                 490                 495    

Gly Tyr His His Gly Ala Ile         

            500

 

<210> 5

<211> 2046

<212> DNA                                                                                                         

<213>拟南芥（Arabidopsis thalianaL.）

<220>

<400> SEQ ID NO: 5

atcaaaaaaa aagtttcaat ttttgaaagc tctgagaaat gaatctatca ttctctctct      60

ctatctctat cttccttttc agatttcgct tcttcaattc atgaaatcct cgtgattcta     120

ctttaatgct tctctttttt tacttttcca agtctctgaa tattcaaagt atatatcttt     180

tgttttcaaa cttttgcaga attgtcttca agcttccaaa tttcagttaa aggtctcaac     240

tttgcagaat tttcctctaa aggttcagac tttggggtaa aggtgtcaac tttggcgatg     300

ggtcttgacg gaaacaatgg tggaggggtt tggttaaacg gtggtggtgg agaaagggaa     360

gagaacgagg aaggttcatg gggaaggaat caagaagatg gttcttctca gtttaagcct     420

atgcttgaag gtgattggtt tagtagtaac caaccacatc cacaagatct tcagatgtta     480

cagaatcagc cagatttcag atactttggt ggttttcctt ttaaccctaa tgataatctt     540

cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt     600

gacccttctc agcaaaatca gttcttgtca actaacaaca acaagggttg tcttctcaat     660

gttccttctt ctgcaaaccc ttttgataat gcttttgagt ttggctctga atctggtttt     720

cttaaccaaa tccatgctcc tatttcgatg gggtttggtt ctttgacaca attggggaac     780

agggatttga gttctgttcc tgatttcttg tctgctcggt cacttcttgc gccggaaagc     840

aacaacaaca acacaatgtt gtgtggtggt ttcacagctc cgttggagtt ggaaggtttt     900

ggtagtcctg ctaatggtgg ttttgttggg aacagagcga aagttctgaa gcctttagag     960

gtgttagcat cgtctggtgc acagcctact ctgttccaga aacgtgcagc tatgcgtcag    1020

agctctggaa gcaaaatggg aaattcggag agttcgggaa tgaggaggtt tagtgatgat    1080

ggagatatgg atgagactgg gattgaggtt tctgggttga actatgagtc tgatgagata    1140

aatgagagcg gtaaagcggc tgagagtgtt cagattggag gaggaggaaa gggtaagaag    1200

aaaggtatgc ctgctaagaa tctgatggct gagaggagaa ggaggaagaa gcttaatgat    1260

aggctttata tgcttagatc agttgtcccc aagatcagca aaatggatag agcatcaata    1320

cttggagatg caattgatta tctgaaggaa cttctacaaa ggatcaatga tcttcacaat    1380

gaacttgagt caactcctcc tggatctttg cctccaactt catcaagctt ccatccgttg    1440

acacctacac cgcaaactct ttcttgtcgt gtcaaggaag agttgtgtcc ctcttcttta    1500

ccaagtccta aaggccagca agctagagtt gaggttagat taagggaagg aagagcagtg    1560

aacattcata tgttctgtgg tcgtagaccg ggtctgttgc tcgctaccat gaaagctttg    1620

gataatcttg gattggatgt tcagcaagct gtgatcagct gttttaatgg gtttgccttg    1680

gatgttttcc gcgctgagca atgccaagaa ggacaagaga tactgcctga tcaaatcaaa    1740

gcagtgcttt tcgatacagc agggtatgct ggtatgatct gatctgatcc tgacttcgag    1800

tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt    1860

tcttctcaac tttttttctt atgtcataac ttcaatctaa gcatgtaatg caattgcaaa    1920

tgagagttgt ttttaaatta agcttttgag aacttgaggt tgttgttgtt ggatacataa    1980

cttcaacctt ttattagcaa tgttaacttc catttatgtt tcatcttaaa gctatgctca    2040

agaatt                                                                           2046

<210> 6

<211> 495

<212> PRT

<213>拟南芥（Arabidopsis thalianaL.）

<220>

<400> SEQ ID NO: 6

Met Gly Leu Asp Gly Asn Asn Gly Gly Gly Val Trp Leu Asn Gly Gly

1               5                   10                  15     

Gly Gly Glu Arg Glu Glu Asn Glu Glu Gly Ser Trp Gly Arg Asn Gln

            20                  25                  30         

Glu Asp Gly Ser Ser Gln Phe Lys Pro Met Leu Glu Gly Asp Trp Phe

        35                  40                  45             

Ser Ser Asn Gln Pro His Pro Gln Asp Leu Gln Met Leu Gln Asn Gln

    50                  55                  60                 

Pro Asp Phe Arg Tyr Phe Gly Gly Phe Pro Phe Asn Pro Asn Asp Asn

65                  70                  75                  80 

Leu Leu Leu Gln His Ser Ile Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Pro Ser

                85                  90                  95     

Gln Ala Phe Ser Leu Asp Pro Ser Gln Gln Asn Gln Phe Leu Ser Thr

            100                 105                 110        

Asn Asn Asn Lys Gly Cys Leu Leu Asn Val Pro Ser Ser Ala Asn Pro

        115                 120                 125            

Phe Asp Asn Ala Phe Glu Phe Gly Ser Glu Ser Gly Phe Leu Asn Gln

    130                 135                 140                

Ile His Ala Pro Ile Ser Met Gly Phe Gly Ser Leu Thr Gln Leu Gly

145                 150                 155                 160

Asn Arg Asp Leu Ser Ser Val Pro Asp Phe Leu Ser Ala Arg Ser Leu

                165                 170                 175    

Leu Ala Pro Glu Ser Asn Asn Asn Asn Thr Met Leu Cys Gly Gly Phe

            180                 185                 190        

Thr Ala Pro Leu Glu Leu Glu Gly Phe Gly Ser Pro Ala Asn Gly Gly

        195                 200                 205            

Phe Val Gly Asn Arg Ala Lys Val Leu Lys Pro Leu Glu Val Leu Ala

    210                 215                 220                

Ser Ser Gly Ala Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Met Arg

225                 230                 235                 240

Gln Ser Ser Gly Ser Lys Met Gly Asn Ser Glu Ser Ser Gly Met Arg

                245                 250                 255    

Arg Phe Ser Asp Asp Gly Asp Met Asp Glu Thr Gly Ile Glu Val Ser

            260                 265                 270        

Gly Leu Asn Tyr Glu Ser Asp Glu Ile Asn Glu Ser Gly Lys Ala Ala

        275                 280                 285            

Glu Ser Val Gln Ile Gly Gly Gly Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly Met

    290                 295                 300                

Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn

305                 310                 315                 320

Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met

                325                 330                 335    

Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Asp Tyr Leu Lys Glu Leu

            340                 345                 350        

Leu Gln Arg Ile Asn Asp Leu His Asn Glu Leu Glu Ser Thr Pro Pro

        355                 360                 365            

Gly Ser Leu Pro Pro Thr Ser Ser Ser Phe His Pro Leu Thr Pro Thr

    370                 375                 380                

Pro Gln Thr Leu Ser Cys Arg Val Lys Glu Glu Leu Cys Pro Ser Ser

385                 390                 395                 400

Leu Pro Ser Pro Lys Gly Gln Gln Ala Arg Val Glu Val Arg Leu Arg

                405                 410                 415    

Glu Gly Arg Ala Val Asn Ile His Met Phe Cys Gly Arg Arg Pro Gly

            420                 425                 430        

Leu Leu Leu Ala Thr Met Lys Ala Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp Val

        435                 440                 445            

Gln Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Ala Leu Asp Val Phe

    450                 455                 460                

Arg Ala Glu Gln Cys Gln Glu Gly Gln Glu Ile Leu Pro Asp Gln Ile

465                 470                 475                 480

Lys Ala Val Leu Phe Asp Thr Ala Gly Tyr Ala Gly Met Ile  

                485                 490                 495    

<210> 7

<211> 1506

<212> DNA

<213> 紫茎泽兰HGG种群（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

<221> modified_base

<222>(12,33,51,120,123,139,222,239,253,281,330,368,485,506,537,552,579,619,640,644,662,666,694,698,701,706, 716,731,751,777,785,791,816,822,836,847,855,941,949,952,1028,1041,1043,1174,1212,1224,1294,1305,1310,1370)

<223> m5c

<400> SEQ ID NO: 7 

atgcttcccg ccggcggttc tatctggatg gccggagaac caagccaaga cgaaacatct      60

tcatggtcac ccacaaccca caacatcacc ggaattgaac ccactgcaac atcatgcaac     120

gacgctgacg accaccaccg catcaccacc aacgccacca gttattcatc tctcaccacc     180

ttgaaatcaa tgctggaaac cgaatggtat caccaccaca acaatctgaa tctcccttcc     240

gacggtaact ctctgttctt acccatggat tcatcgtctt cgtgttctcc gtcgcaatct     300

cataatcagt ttacccaatc ttcttacccc ttttttccac ccaaattcaa taacaatttg     360

aacaacccgt atgatctgcc gtttgatttc ggatgcgaat ctgctttctt accgaatcac     420

acttccaatt tgatgagttt tgctggttta tcttctcaaa atcacatccc catgccggag     480

atttcgtcca gttccgactt tccggcgacc aacaataaca acagcaacga caccggcgac     540

attgtaggac ccggtttcaa cccgaattta actgggttcg acggatttca cggcactgta     600

ccccaaactt cattgtttcc ggcgaggtct aaggttctcc ggccgcttga gatttctcca     660

ccggtcggag ctcagcctac actgtttcaa aaacgggcgg cgttacggca aagctcaggc     720

aaattgggtc cggttgaaaa tgaaaagaaa cggaagagaa gtgaggaaga tgaattcgat     780

gaaacgggta cgattgatgt ttctggattc aattacgatt ccgatgaaat tgaaccgatt     840

ggtgagcttg ctaacggaaa tggtgaaagc agttttgtta ccattggagg tgagaatcaa     900

agaggtaaga aaaaggggtt acctgcaaag aatttaatgg cggagagacg acggaggaag     960

aagctcaatg acagactgta tatgcttaga tcagttgtcc ccaaaattag caagatggat    1020

agagcttcga ttcttggtga cgcgattgat tacttgaagg aactactaca aaaaatcaat    1080

gatcttcata atgaacttga ggcaacacca caagggtctt tgatgcaaac ttcatcaagc    1140

atgcatcccc taacacccac ctcgccggcc cttctgcaac atgtcaaaga agaactatgt    1200

ccaaccgcca ccaacaacat tctcggcccc aaaaaccatc ttgcaaaggt cgaagtatat    1260

gcaaaagaag cgaggggtgt gaacatccac atgctgtgcg ggcgcagacc gggtctctta    1320

ctttctacat tgagggctct ggacaacctt gggctggaca ttcaacaagc tgtcataagc    1380

tgtttcaatg ggtttgcttt ggatgtattt cgagcccagc aatgtaggga agggcaggat    1440

atgttgcctg agcaaataaa agcagtgctt ctagagacag ctggatatca tcatggtgcc    1500

atttaa                                                                           1506

<210> 8

<211> 1506

<212> DNA

<213> 紫茎泽兰JHY种群（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

<221> modified_base

<222>(32,51,89,139,222,239,253,281,327,330,340,368,390,498,503,506,510,534,537,552,563,579,591,596,619,623,640,644,662,666,694,698,701,706,716,731,751,777,785,791,816,822,836,847,855,941,949,952,972,1028,1041,1043,1174,1212,1224,1294,1303,1305,1310,1344, 1370)

<223> m5c

<400> SEQ ID NO: 8 

atgcttcccg ccggcggttc tatctggatg gccggagaac caagccaaga cgaaacatct      60

tcatggtcac ccacaaccca caacatcacc ggaattgaac ccactgcaac atcatgcaac     120

gacgctgacg accaccaccg catcaccacc aacgccacca gttattcatc tctcaccacc     180

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<210> 9

<211> 1506

<212> DNA

<213> 紫茎泽兰DLY种群（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

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<223> m5c

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<210> 10

<211> 1506

<212> DNA

<213> 紫茎泽兰BSG种群（Ageratina adenophorumSpreng.）

<220>

<221> modified_base

<222>(32,51,89,129,139,153,201,222,239,243,253,281,290,293,330,340,368,380,390,396,413,476,498,503,506,510,534,537,552,563,591,596,619,623,640,644,662,666,694,698,701,706,716,731,751,777,785,791,816,822,836,847,855,941,949,952,1028,1041,1043,1174,1212,1294,1303,1305, 1344,1370)

<223> m5c

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atgcttcccg ccggcggttc tatctggatg gccggagaac caagccaaga cgaaacatct      60

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gacgctgacg accaccaccg catcaccacc aacgccacca gttattcatc tctcaccacc     180

ttgaaatcaa tgctggaaac cgaatggtat caccaccaca acaatctgaa tctcccttcc     240

gacggtaact ctctgttctt acccatggat tcatcgtctt cgtgttctcc gtcgcaatct     300

cataatcagt ttacccaatc ttcttacccc ttttttccac ccaaattcaa taacaatttg     360

aacaacccgt atgatctgcc gtttgatttc ggatgcgaat ctgctttctt accgaatcac     420

acttccaatt tgatgagttt tgctggttta tcttctcaaa atcacatccc catgccggag     480

atttcgtcca gttccgactt tccggcgacc aacaataaca acagcaacga caccggcgac     540

attgtaggac ccggtttcaa cccgaattta actgggttcg acggatttca cggcactgta     600

ccccaaactt cattgtttcc ggcgaggtct aaggttctcc ggccgcttga gatttctcca     660

ccggtcggag ctcagcctac actgtttcaa aaacgggcgg cgttacggca aagctcaggc     720

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gaaacgggta cgattgatgt ttctggattc aattacgatt ccgatgaaat tgaaccgatt     840

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agaggtaaga aaaaggggtt acctgcaaag aatttaatgg cggagagacg acggaggaag     960

aagctcaatg acagactgta tatgcttaga tcagttgtcc ccaaaattag caagatggat    1020

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gcaaaagaag cgaggggtgt gaacatccac atgctgtgcg ggcgcagacc gggtctctta    1320

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<210> 11

<211> 1506

<212> DNA

<213> 合成的ICE1基因（AaICE1s）

<220>

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tccgaggacg ccaggggcgg cgaggacagc ggcgccaaga aggagtcgaa cgccaacagc     960

acggtcaccg gcgacgggaa ggggaagaag aaggggatgc cggccaagaa cctcatggcg    1020

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<210> 12

<211> 2046

<212> DNA

<213> 拟南芥At-1种群（Arabidopsis thalianaL.）

<220>

<221> modified_base

<222> (43,51,1468,1690,1896)

<223> m5c

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ctttaatgct tctctttttt tacttttcca agtctctgaa tattcaaagt atatatcttt     180

tgttttcaaa cttttgcaga attgtcttca agcttccaaa tttcagttaa aggtctcaac     240

tttgcagaat tttcctctaa aggttcagac tttggggtaa aggtgtcaac tttggcgatg     300

ggtcttgacg gaaacaatgg tggaggggtt tggttaaacg gtggtggtgg agaaagggaa     360

gagaacgagg aaggttcatg gggaaggaat caagaagatg gttcttctca gtttaagcct     420

atgcttgaag gtgattggtt tagtagtaac caaccacatc cacaagatct tcagatgtta     480

cagaatcagc cagatttcag atactttggt ggttttcctt ttaaccctaa tgataatctt     540

cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt     600

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gaacttgagt caactcctcc tggatctttg cctccaactt catcaagctt ccatccgttg    1440

acacctacac cgcaaactct ttcttgtcgt gtcaaggaag agttgtgtcc ctcttcttta    1500

ccaagtccta aaggccagca agctagagtt gaggttagat taagggaagg aagagcagtg    1560

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cttcaacctt ttattagcaa tgttaacttc catttatgtt tcatcttaaa gctatgctca    2040

agaatt                                                                           2046

<210> 13

<211> 2046

<212> DNA

<213> 拟南芥At-2种群（Arabidopsis thalianaL.）

<220>

<221> modified_base

<222> (564,1046,1451,1468,1689,1690)

<223> m5c

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tttgcagaat tttcctctaa aggttcagac tttggggtaa aggtgtcaac tttggcgatg     300

ggtcttgacg gaaacaatgg tggaggggtt tggttaaacg gtggtggtgg agaaagggaa     360

gagaacgagg aaggttcatg gggaaggaat caagaagatg gttcttctca gtttaagcct     420

atgcttgaag gtgattggtt tagtagtaac caaccacatc cacaagatct tcagatgtta     480

cagaatcagc cagatttcag atactttggt ggttttcctt ttaaccctaa tgataatctt     540

cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt     600

gacccttctc agcaaaatca gttcttgtca actaacaaca acaagggttg tcttctcaat     660

gttccttctt ctgcaaaccc ttttgataat gcttttgagt ttggctctga atctggtttt     720

cttaaccaaa tccatgctcc tatttcgatg gggtttggtt ctttgacaca attggggaac     780

agggatttga gttctgttcc tgatttcttg tctgctcggt cacttcttgc gccggaaagc     840

aacaacaaca acacaatgtt gtgtggtggt ttcacagctc cgttggagtt ggaaggtttt     900

ggtagtcctg ctaatggtgg ttttgttggg aacagagcga aagttctgaa gcctttagag     960

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ggagatatgg atgagactgg gattgaggtt tctgggttga actatgagtc tgatgagata    1140

aatgagagcg gtaaagcggc tgagagtgtt cagattggag gaggaggaaa gggtaagaag    1200

aaaggtatgc ctgctaagaa tctgatggct gagaggagaa ggaggaagaa gcttaatgat    1260

aggctttata tgcttagatc agttgtcccc aagatcagca aaatggatag agcatcaata    1320

cttggagatg caattgatta tctgaaggaa cttctacaaa ggatcaatga tcttcacaat    1380

gaacttgagt caactcctcc tggatctttg cctccaactt catcaagctt ccatccgttg    1440

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ccaagtccta aaggccagca agctagagtt gaggttagat taagggaagg aagagcagtg    1560

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gataatcttg gattggatgt tcagcaagct gtgatcagct gttttaatgg gtttgccttg    1680

gatgttttcc gcgctgagca atgccaagaa ggacaagaga tactgcctga tcaaatcaaa    1740

gcagtgcttt tcgatacagc agggtatgct ggtatgatct gatctgatcc tgacttcgag    1800

tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt    1860

tcttctcaac tttttttctt atgtcataac ttcaatctaa gcatgtaatg caattgcaaa    1920

tgagagttgt ttttaaatta agcttttgag aacttgaggt tgttgttgtt ggatacataa    1980

cttcaacctt ttattagcaa tgttaacttc catttatgtt tcatcttaaa gctatgctca    2040

agaatt                                                                           2046

<210> 14

<211> 2046

<212> DNA

<213> 拟南芥At-5种群（Arabidopsis thalianaL.）

<220>

<221> modified_base

<222> (3,808,1109,1110,1122,1214,1582,1589,1704)

<223> m5c

<400> SEQ ID NO: 14 

atcaaaaaaa aagtttcaat ttttgaaagc tctgagaaat gaatctatca ttctctctct      60

ctatctctat cttccttttc agatttcgct tcttcaattc atgaaatcct cgtgattcta     120

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<220>

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tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt    1860

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<211> 2046

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cttcttcaac actctattga ttcttcttct tcttgttctc cttctcaagc ttttagtctt     600

gacccttctc agcaaaatca gttcttgtca actaacaaca acaagggttg tcttctcaat     660

gttccttctt ctgcaaaccc ttttgataat gcttttgagt ttggctctga atctggtttt     720

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tccattaagc atctgttgaa gcagagctag aagaactaag tccctttaaa tctgcaattt    1860

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<213> 转DLY种群AaICE1基因根癌农杆菌GV3101（Agrobacterium tumefaciens）

<220>

<221> modified_base

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cataatcagt ttacccaatc ttcttacccc ttttttccac ccaaattcaa taacaatttg     360

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ggtgagcttg ctaacggaaa tggtgaaagc agttttgtta ccattggagg tgagaatcaa     900

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agagcttcga ttcttggtga cgcgattgat tacttgaagg aactactaca aaaaatcaat    1080

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<223> m5c

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gacggtaact ctctgttctt acccatggat tcatcgtctt cgtgttctcc gtcgcaatct     300

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ccggtcggag ctcagcctac actgtttcaa aaacgggcgg cgttacggca aagctcaggc     720

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<211> 1506

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<221> modified_base

<222>(12,15,24,32,33,77,90,138,139,240,275,281,289,320,340,368,376,380,390,413,476,495,503,506,528,534,537,552,561,572,579,582,591,620,640,644,661,662,666,673,694,,706,731,751,777,785,791,816,822,836,855,870,941,949,952,976,1002,1118,1156,1163,1166,1174,1202,1205,1206,1224,1240,1251,1271,1299,1303,1305,1310,1411,1417,1463)

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agagcttcga ttcttggtga cgcgattgat tacttgaagg aactactaca aaaaatcaat    1080

gatcttcata atgaacttga ggcaacacca caagggtctt tgatgcaaac ttcatcaagc    1140

atgcatcccc taacacccac ctcgccggcc cttctgcaac atgtcaaaga agaactatgt    1200

ccaaccgcca ccaacaacat tctcggcccc aaaaaccatc ttgcaaaggt cgaagtatat    1260

gcaaaagaag cgaggggtgt gaacatccac atgctgtgcg ggcgcagacc gggtctctta    1320

ctttctacat tgagggctct ggacaacctt gggctggaca ttcaacaagc tgtcataagc    1380

tgtttcaatg ggtttgcttt ggatgtattt cgagcccagc aatgtaggga agggcaggat    1440

atgttgcctg agcaaataaa agcagtgctt ctagagacag ctggatatca tcatggtgcc    1500

atttaa                                                                           1506

<210> 26

<211> 1506

<212> DNA

<213> 转HGGAaICE1基因拟南芥（Arabidopsis thalianaoverexpressionAaICE1）

<220>

<221> modified_base

<222>(12,33,51,90,120,123,139,240,253,275,281,368,390,413,476,495,503,506,528,534,537,552,563,579,582,620,640,644,662,666,694,698,701,706,731,751,777,785,791,816,822,836,855,941,949,952,1041,1043,1163,1166,1206,1271,1299,1305,1310,1411)

<223> m5c

<400> SEQ ID NO: 26

atgcttcccg ccggcggttc tatctggatg gccggagaac caagccaaga cgaaacatct      60

tcatggtcac ccacaaccca caacatcacc ggaattgaac ccactgcaac atcatgcaac     120

gacgctgacg accaccaccg catcaccacc aacgccacca gttattcatc tctcaccacc     180

ttgaaatcaa tgctggaaac cgaatggtat caccaccaca acaatctgaa tctcccttcc     240

gacggtaact ctctgttctt acccatggat tcatcgtctt cgtgttctcc gtcgcaatct     300

cataatcagt ttacccaatc ttcttacccc ttttttccac ccaaattcaa taacaatttg     360

aacaacccgt atgatctgcc gtttgatttc ggatgcgaat ctgctttctt accgaatcac     420

acttccaatt tgatgagttt tgctggttta tcttctcaaa atcacatccc catgccggag     480

atttcgtcca gttccgactt tccggcgacc aacaataaca acagcaacga caccggcgac     540

attgtaggac ccggtttcaa cccgaattta actgggttcg acggatttca cggcactgta     600

ccccaaactt cattgtttcc ggcgaggtct aaggttctcc ggccgcttga gatttctcca     660

ccggtcggag ctcagcctac actgtttcaa aaacgggcgg cgttacggca aagctcaggc     720

aaattgggtc cggttgaaaa tgaaaagaaa cggaagagaa gtgaggaaga tgaattcgat     780

gaaacgggta cgattgatgt ttctggattc aattacgatt ccgatgaaat tgaaccgatt     840

ggtgagcttg ctaacggaaa tggtgaaagc agttttgtta ccattggagg tgagaatcaa     900

agaggtaaga aaaaggggtt acctgcaaag aatttaatgg cggagagacg acggaggaag     960

aagctcaatg acagactgta tatgcttaga tcagttgtcc ccaaaattag caagatggat    1020

agagcttcga ttcttggtga cgcgattgat tacttgaagg aactactaca aaaaatcaat    1080

gatcttcata atgaacttga ggcaacacca caagggtctt tgatgcaaac ttcatcaagc    1140

atgcatcccc taacacccac ctcgccggcc cttctgcaac atgtcaaaga agaactatgt    1200

ccaaccgcca ccaacaacat tctcggcccc aaaaaccatc ttgcaaaggt cgaagtatat    1260

gcaaaagaag cgaggggtgt gaacatccac atgctgtgcg ggcgcagacc gggtctctta    1320

ctttctacat tgagggctct ggacaacctt gggctggaca ttcaacaagc tgtcataagc    1380

tgtttcaatg ggtttgcttt ggatgtattt cgagcccagc aatgtaggga agggcaggat    1440

atgttgcctg agcaaataaa agcagtgctt ctagagacag ctggatatca tcatggtgcc    1500

atttaa                                                                           1506

<210> 27

<211> 1506

<212> DNA

<213> 转AaICE1s基因拟南芥（Arabidopsis thalianaoverexpressionAaICE1）

<220>

<221> modified_base

<222>(12,15,32,51,77,90,129,138,139,153,222,240,243,275,281,289,290,293,320,327,340,368,376,390,396,485,495,506,513,528,534,563,572,579,582,620,662,673,706,791,855,870,972,976,1002,1111,1118,1156,1163,1166,1174,1202,1205,1206,1224,1240,1251,1271,1299,1310,1339,1366,1370,1411,1417)

<223> m5c

<400> SEQ ID NO: 27 

atgcttcccg ccggcggttc tatctggatg gccggagaac caagccaaga cgaaacatct      60

tcatggtcac ccacaaccca caacatcacc ggaattgaac ccactgcaac atcatgcaac     120

gacgctgacg accaccaccg catcaccacc aacgccacca gttattcatc tctcaccacc     180

ttgaaatcaa tgctggaaac cgaatggtat caccaccaca acaatctgaa tctcccttcc     240

gacggtaact ctctgttctt acccatggat tcatcgtctt cgtgttctcc gtcgcaatct     300

cataatcagt ttacccaatc ttcttacccc ttttttccac ccaaattcaa taacaatttg     360

aacaacccgt atgatctgcc gtttgatttc ggatgcgaat ctgctttctt accgaatcac     420

acttccaatt tgatgagttt tgctggttta tcttctcaaa atcacatccc catgccggag     480

atttcgtcca gttccgactt tccggcgacc aacaataaca acagcaacga caccggcgac     540

attgtaggac ccggtttcaa cccgaattta actgggttcg acggatttca cggcactgta     600

ccccaaactt cattgtttcc ggcgaggtct aaggttctcc ggccgcttga gatttctcca     660

ccggtcggag ctcagcctac actgtttcaa aaacgggcgg cgttacggca aagctcaggc     720

aaattgggtc cggttgaaaa tgaaaagaaa cggaagagaa gtgaggaaga tgaattcgat     780

gaaacgggta cgattgatgt ttctggattc aattacgatt ccgatgaaat tgaaccgatt     840

ggtgagcttg ctaacggaaa tggtgaaagc agttttgtta ccattggagg tgagaatcaa     900

agaggtaaga aaaaggggtt acctgcaaag aatttaatgg cggagagacg acggaggaag     960

aagctcaatg acagactgta tatgcttaga tcagttgtcc ccaaaattag caagatggat    1020

agagcttcga ttcttggtga cgcgattgat tacttgaagg aactactaca aaaaatcaat    1080

gatcttcata atgaacttga ggcaacacca caagggtctt tgatgcaaac ttcatcaagc    1140

atgcatcccc taacacccac ctcgccggcc cttctgcaac atgtcaaaga agaactatgt    1200

ccaaccgcca ccaacaacat tctcggcccc aaaaaccatc ttgcaaaggt cgaagtatat    1260

gcaaaagaag cgaggggtgt gaacatccac atgctgtgcg ggcgcagacc gggtctctta    1320

ctttctacat tgagggctct ggacaacctt gggctggaca ttcaacaagc tgtcataagc    1380

tgtttcaatg ggtttgcttt ggatgtattt cgagcccagc aatgtaggga agggcaggat    1440

atgttgcctg agcaaataaa agcagtgctt ctagagacag ctggatatca tcatggtgcc    1500

atttaa                                                                             1506

Claims (10)

1.基因甲基化在调控基因表达方面的应用，其特征在于：所述调控基因表达通过分离克隆或合成不同甲基化水平的基因，进行转基因遗传操作，从而达到定量调控基因表达的目的。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述不同甲基化水平的基因为甲基化的植物ICE1基因；所述调控基因表达为调控冷转录响应基因CBF1、CBF2、CBF3、冷响应基因COR47的表达量。

3.一种冷诱导基因，该基因为甲基化的植物ICE1基因；所述植物ICE1基因为紫茎泽兰ICE1基因，核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2；或所述植物ICE1基因为拟南芥ICE1基因，核苷酸序列为SEQ ID NO：5。

4.根据权利要求3所述的冷诱导基因，其特征在于：所述植物ICE1基因为紫茎泽兰ICE1基因时，所述冷诱导基因的甲基化位点数为30～81个；

所述植物ICE1基因为拟南芥ICE1基因时，所述冷诱导基因的甲基化位点数为7～24个。

5.根据权利要求4所述的冷诱导基因，其特征在于：所述植物ICE1基因为紫茎泽兰ICE1基因时，所述冷诱导基因前1209bp区域的甲基化位点数为44～60个；

所述植物ICE1基因为拟南芥ICE1基因时，所述冷诱导基因前1209bp区域的甲基化位点数为3～14个。

6.根据权利要求5所述的冷诱导基因，其特征在于：所述冷诱导基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：7～27。

7.包含权利要求3至6任一所述冷诱导基因的表达载体。

8.权利要求1至6任一所述冷诱导基因在制备转基因植株方面的应用。

9.根据权利要求8所述冷诱导基因在制备耐寒植株方面的应用，其特征在于：包括以下步骤：

（1）利用DNA重组技术，构建含有所述冷诱导基因的植物转化质粒；

（2）将步骤（1）中构建的植物转化质粒导入植物组织，利用标记基因筛选含有所述冷诱导基因的植物细胞；

（3）将步骤（2）中筛选的植物细胞进行分化获得转化芽，经过生根培养获得植物种苗，即得所述耐寒植株。

10.一种冷诱导蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。