CN101979551B - 玉米苹果酸脱氢酶基因启动子序列克隆和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种玉米苹果酸脱氢酶基因启动子序列克隆和应用，其方法是从玉米基因组中克隆胞质玉米苹果酸脱氢酶基因启动子序列，与目标基因编码区或其RNAi结构融合，构建植物表达结构，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和目标性状，选择抗逆性或经济性状明显提高的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质。

Description

玉米苹果酸脱氢酶基因启动子序列克隆和应用

技术领域

本发明属植物生物工程育种领域，具体说，涉及克隆一种玉米高强度表达基因的启动子并利用其构建融合基因，进而通过转基因途径改变植物性状的方案及应用。

背景技术

植物基因工程的发展依赖于具有不同特性启动子的克隆和应用。目前植物基因工程中常用的启动子一般为组成型启动子，如双子叶转基因植物中常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合酶基因Nos启动子，单子叶转基因植物中常使用的玉米Ubi1启动子和水稻肌动蛋白基因Act1启动子。组成型启动子具有驱动基因在各种组织持续、恒定表达的特点，可产生大量的异源蛋白质，这在培育抗虫抗除草剂基因工程中有重要意义。然而，在不需要转基因表达的植物器官中大量表达也造成了不必要的浪费。另外，有报道表明，重复使用同一种启动子启动两个或者两个以上外源基因在细胞内同时表达，可引起基因沉默现象发生。因此，开发新的启动子在转基因生物研究中意义重大。

植物基因启动子克隆和改造的工作已有大量报道。如Gu等(2006)克隆出玉米β-葡萄糖苷酶基因(ZmGLU1)的启动子，用该启动子启动gus基因表达，在转基因烟草中观察到GUS蛋白在根中高水平表达。Luo等(2006)从水稻的圆锥花序中分离出了绒毡层特异性RTS基因，该基因启动子含有一些与其他花药特异性启动子相同的顺式作用元件，能够驱动目的基因在转基因植物中组织特异性表达，引起转基因植物产生雄性不育。Tittarelli等(2007)从小麦中一个候选的高亲和力磷转运体-TaPT2基因的ATG上游的579bp的片段，利用该片段与gus基因构建融合基因，转入小麦后可在低磷条件下特异地启动gus报告基因在小麦根中活跃表达。Gutha等(2008)将水稻OsDREB1B抗逆基因745bp的启动子区域与gus融合后转化拟南芥和烟草，转基因植株的组织化学观察显示，报告基因gus的表达受甘露醇、NaCl、PEG、冷、ABA和水杨酸多种胁迫相互的诱导。

苹果酸脱氢酶(MDH，malate dehydrogenase)(EC1.1.1.37)是催化L-苹果酸脱氢与草酰乙酸相互转化的酶，主要参与TCA循环、光合作用、C4循环等代谢途径。苹果酸脱氢酶可分为NAD-依赖性的MDH(NAD-MDH)和NADP-依赖性的MDH(NADP-MDH)，广义上也包括以NAD+或NADP+作为受体而生成丙酮酸和碳酸的苹果酸酶(EC1.1.1.38-40)。在所有真核生物和大部分细菌中，MDH通常形成同源二聚体，在少数细菌中为四聚体.不同来源的MDH催化机制和它们的动力学性质十分类似，显示了它们具有高度的结构相似性。MDH的功能多样，包括线粒体中的能量提供和植物的活性氧代谢，也是生物糖代谢中的关键酶之一。

高等生物中苹果酸脱氢酶至少有两个同工酶，一个为细胞质苹果酸脱氢酶，一个为线粒体苹果酸脱氢酶，均为2个相同亚基组成的同源二聚体。前者在细胞质中参与柠檬酸循环中催化草酰乙酸形成苹果酸，也可催化苹果酸形成草酰乙酸的反应。草酰乙酸是一个非常重要的中间产物，联接多条重要的代谢途径，是氨基酸形成所需的碳骨架的主要来源之一。细胞质苹果酸脱氢酶与线粒体的能量代谢也密切相关，参与线粒体三羧酸循环的主要底物草酰乙酸不能由细胞质直接进入线粒体，必须在细胞质中经苹果酸脱氢酶催化再生成苹果酸再进入三羧酸循环。在高等植物中，苹果酸脱氢酶至少以5种同工酶形式存在：(1)细胞质NAD依赖性(cyMDH)，(2)线粒体NAD依赖性(mitMDH)，(3)叶绿体NAD依赖性(chMDH)，(4)微体NAD依赖性(micMDH)和(5)叶绿体NADH依赖性。苹果酸脱氢酶是一种高活性的酶，也存在于一些细胞的乙醛酸体中(gMDH)。叶绿体苹果酸脱氢酶主要参与维持胞液与基质间的平衡；胞质苹果酸脱氢酶和过氧化物酶体苹果酸脱氢酶在苹果酸-冬氨酸穿梭中起作用；线粒体苹果酸脱氢酶主要参与TCA循环；乙醛酸体苹果酸脱氢酶在β-氧化中行使功能；根瘤苹果酸脱氢酶主要参与氮固定和同化作用(Schulzeet al.，2002)。苹果酸脱氢酶在C₄植物光合作用中担负非常重要的功能。一些C₄旱生植物如玉米、甘蔗等，为保证有足够浓度的CO₂参与C₃光合碳还原循环，进入叶组织的CO₂首先在叶肉细胞中与烯醇式磷酸丙酮酸反应生成草酰乙酸，草酰乙酸经苹果酸脱氢酶作用生成苹果酸，然后被输送到维管束细胞，并进一步由苹果酸酶或磷酸烯醇式磷酸丙酮酸羧激酶作用释放出CO₂，后者再进入C₃循环。在玉米中，mit-MDH、chMDH、micMDH和chnMDH已有较广泛研究(MM.Goodman等，1981；MK.Hayes等，1991；MC.Metzler等，1998)。在玉米基因组中，有5个独立的遗传位点分别编码NAD依赖性的苹果酸脱氢酶。在每一遗传位点上可有多个等位基因。编码线粒体MDHs的3个位点(Mdhl，Mdh2，and Mdh3)分别位于染色体8、6、3上，只要它们中一个位点的等位基因具有正常活性，玉米胚胎发生正常。编码cyMDH的2个遗传位点(Mdh4和Mdh5)分别位于染色体1和5上，若一个位点的基因功能丧失，则植株发育异常。然而，关于cyMDH基因的功能和基因表达的分子调节机制了解的很少。胡建广等(1999)从玉米cDNA文库中克隆出苹果酸脱氢酶基因并进行了结构分析。该基因全长1287bp(AF007581)，推导的氨基酸序列与龙须海棠和拟南芥同一编码基因的氨基酸序列同源性分别为90％和84％。

NAD/NADP-苹果酸酶(NAD-ME/NADP-ME)是C4植物光合途径的关键酶之一，也划归为苹果酸脱氢酶一族。最近，李平等采用RT-PCR技术对籽粒苋NAD-ME基因进行克隆，获得了籽粒苋NAD-ME基因的cDNA序列。结果表明，该序列开放可读框长度为1872bp，编码623个氨基酸；多序列比对和进化树分析表明，该基因核苷酸序列与其他植物已报道的NAD-ME/NADP-ME基因的核苷酸序列一致性高达75.1％～80.6％，其氨基酸序列与其他植物的NAD-ME/NADP-ME蛋白一致性为73.2％～80.3％。对推断氨基酸序列的蛋白保守区、疏水性/亲水性、潜在跨膜片段、信号肽、蛋白固有无序化和蛋白二级结构分析表明，该蛋白具有苹果酸酶的保守区、兼具亲水性和疏水性，并且含有无序结构域，可能是一种跨膜的非分泌性蛋白。

苹果酸是游离铝离子的有效螯合剂，而苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸形成苹果酸。已从苜蓿、豌豆等植物中克隆了苹果酸脱氢酶基因并进行了转基因研究(Faske et al.，1997；Tesfaye et al.，2001)。在苜蓿中超量表达苜蓿根瘤特异性的苹果酸脱氢酶增加了叶片和根中的有机酸含量，增加了根际有机酸的分泌量，同时也增加了转基因苜蓿对铝的耐受性(Tesfaye et al.，2001)。罗小英等(2004)将根瘤苹果酸脱氢酶基因转入苜蓿，在苜蓿中超量表达苹果酸脱氢酶基因，在20μmol·L^-1Al³⁺处理下转基因苜蓿较对照表现出明显提高的铝耐受性，株系根相对伸长量比对照高出3.6％～22.5％，表明超量表达MDH基因提高了转基因苜蓿对铝毒的耐受性。

半定量RT-PCR检测表明，玉米cyMDH基因叶、茎、根中均表达，然而，叶中的表达强度远高于茎中和根中的，推测cyMDH表达与光合作用有关。苜蓿和水稻cyMDH基因的表达也表现出同样的趋势。在埃西斯创新有限公司申请的一份国际专利(PCT/GB97/03245)中，拟通过转基因减少NAD依赖性cyMDH活性，增加转基因植株的淀粉含量。目前，克隆cyMDH基因并构建过表达载体和RNAi结构以及玉米遗传转化等工作受到不同实验室的关注，有望在近期内揭示不同cyMDH基因功能及其表达调节机制。张觅等(2008)分别提取香橙根、茎、叶等组织RNA，经过变性凝胶电泳后转膜。以CjMDH因序列为探针进行的Northern分析发现，CjMDH基因在香橙的根和叶中检测到表达信号，在根中表达较强，在茎中没有观察到明显的杂交信号，表明该基因在根和叶中优势表达。定量PCR分析结果与Northern杂交结果一致，CjMDH基因在根中表达高于叶和茎，在根中的相对表达量分别是茎和叶的11倍和3倍，其表达强度是否与根系的有机酸分泌强度有关尚需研究。

尽管苹果酸脱氢酶具有重要的生理生化功能，但迄今为止，在谷类作物中尚未见该基因启动子克隆和应用的报道。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一个高效表达的植物基因启动子---玉米苹果酸脱氢酶基因启动子并将其用于植物转基因实践，产生工程植物。

本发明所述的玉米苹果酸脱氢酶基因启动子(PZmMDH)的克隆和应用方法是，从玉米基因组中克隆出的PZmMDH序列，然后将1500bp脱氧核苷酸链全长或部分重组到目标基因正义或反义编码序列之前，或与目标基因RNAi结构连接，构建能在植物细胞表达的融合基因。再将融合基因插入到植物表达载体中，采用转基因技术将融合基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株目标性状的检测、分析，选择出表明限制发生明显改变的个体进行温室或田间鉴定，从中筛选出目标性状明显改善的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。

本发明克隆出玉米胞质苹果酸脱氢酶基因启动子并进行了序列分析，检测了胞质苹果酸脱氢酶基因在玉米根系和叶片中的表达强度；将该启动子和蔗糖转运体基因、Bt毒蛋白基因、质膜ATP酶基因、碳酸酐酶(carbonic anhydrase)基因等分别融合，再将后者重组到植物表达载体中，转入玉米骨干自交系，获得了抗虫、或高光效、或产量性状有明显改变的转基因玉米。

其中，所述PZmMDH序列来自玉米cyMDH基因，该基因位于栽培玉米1号染色体上。

其中，所述PZmMDH序列可来自玉蜀黍属不同种和玉米种的不同亚种，也可是人工合成的序列一致和相近DNA片段。

其中，所述用于构建融合基因的PZmMDH序列为SEQ ID No.1所示的1500bp的全长序列，也可以为部分序列，也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸链。

其中，所述应用方法是通过融合基因及植物表达载体的构建应用PZmMDH序列启动目标DNA序列在植物细胞内转录，通过植物转基因技术获得性状变化的转基因植株及后代。

本发明所说的植物包括高等植物和低等植物。其中，包括各类作物和经济植物、观赏植物、生态植物、杂草等；包括被子植物、裸子植物等；包括草本植物和木本植物。

本发明所说的融合基因由PZmMDH序列和目标基因正义或反义编码序列、或RNAi结构和植物基因的3′尾巴区构成。该融合基因能在植物细胞中有效表达。

玉米胞质苹果酸脱氢酶基因表达强度的检测

采用实时定量RT-PCR检测胞质苹果酸脱氢酶基因在玉米根、叶中的表达强度，以Actin 1为内参。在玉米根中，该基因表达强度约为Actin 1的70倍。在玉米幼叶和老叶中，该基因的表达强度约为Actin 1的24倍和16倍。即在玉米营养器官中该基因表现出高强度表达。

玉米PZmMDH序列的克隆

以玉米胞质苹果酸脱氢酶基因编码区序列为探针，筛选玉米基因组文库，获得一个带有开放读码框5`上游1500bp的克隆，采用PCR方法克隆出该片段并测序，与GeneBank数据库中的序列进行比对，确定了该序列对应于玉米自交系B73染色体1的克隆CH201-486J20和ZMMBBc0486J20(登陆号AC213624.3)中的一段序列。全序列如下(SEQ ID No.1)：

TTGGATGTCATCGTATTTACTTACAGCGCTGGGTCTGATTGTAGCAGGACGAAGATTCACCAGGGTTATATTCTCTCTGTCGGATGAGCTTCTGGCTTCAGTCGACCTTGAAATCAGTCAAGAACAACTCTTCGAGTTATGTCTGCATCTTTTTCCTGGCGTTTTCCAGCCTATGATATTTTTCAACCTACAGGTCATTCGTAGTCGGCTTGATGTTGCTAGAGAAAATATCGGTGTTTCCTTTGAACCGACCATATGACACCGATCTGGTAAATCCAATCTCAGTTTTCCTAGCGGAGTCATCAAAAACTGTGTTGACGCAGATCTGGGCGCCAATCACTGGAGTTGTTCAGCTCGGCAAGCTAGGGCCGTCAATCTCTGCGGCGGCGCGGACGGTCCGCGGCCTAGGGCCAGATGGTCCGCGACCTAGACAACAGGAGCTGGGTTCCCTGCGCCGAGCCAGATGGTCCGCGCAAGCGTAGGGCGGCAACGTTCTCTATCGACACCTGGATCTCGCCCCTGGTAAGGGACTTCGTCAGGGAGGGAGATCATAGGGTTTGTCTTGGGATCGACATGACACCCAAGACGTCTCTAGACGACGTATAGTCGCGGTGAAGATTGAGATGAAGAAAGCTATGCTACTGGCTATTCATAGGACAAAAAAGTAAAGTACAGATTGATTGCTTTAATTAATGGTGTGGACAATCGACCATACCACATAAATAAAAATGTCATGTAAGCAGACTTAGAGTTTATTATTGTAATTGCTCTTACTCCCAAGTCCCAACCAAACATAGTAGTAAGAAAAAGTATCGTCACATCGCGTTTCCCTATCGGTCGAAGTAGCTTTCAAATCTTTAGATGTGTGGATAAAAAAACGGCTGGTGATCAAAGCCATCGGTACCTATCAAACCTATCACCAACCCTATCGTGAATGAGTGCCATCTTCCTCACGCCACGCTTCTCGAATCTCGAGAGACATCTCCTCCACAACGATAATGTCGCCGCTTCGGTCCTGTAAAACAGCTCGCAAGAAAAATGCAGAAATCAATCGAGCATCATCCAGCTTGCCAAGCTGCCATGCTGTCTAACTGACAGAAGGACCCCACCATCTTGCTCCACTCCGTACTACTGTACGTAGTATTCATCGCCGAAGCCGTGGGCGGTGGGCCAGCGCCCACAGCGTCAAGCGTCACGCCGTCACTTGCGAGTCTCCTGCCTAAAGACACACCAACCAATCAGAGCCAACATAGCACACTGACGTCAGGGGCCCGCTGGTGTCGGGCCAATTGTCAGTTACTGATAAGCACGCTGTCATTATCGGGGCGTGTGACAGTGGATTCCCAAGGCTTCCCCGTCACAGCGACGTTGTTAAATAGTGGCCACCCATTGCCGCGTTCTCTTCGCTATCCCTTGGTTGCCGCAGCCTCCAAAGCCACTCCCAAACCCCCGCTTCCAGAACCTTCTCGAAGCTCCCCGCCGCCTCCTCCACTCGCACCGATGGCGAAGGAACCAATGCGCGTGCTCGTCACTGGCGCCGCAGGTAC

玉米胞质苹果酸脱氢酶基因启动子序列的基本特征

在该启动子区域中，存在的转录调控元件有：22个CAAT-box，分别位于-210(P，即正义链)，-261(P)，-1163(P)，-1220(P)，-209(P)，-733(N，即反义链)，-208(N)，-645(P)，-107(P)，-261(P)，-448(P)，-794(P)，-1124(P)，-1163(P)，-1220(P)，-208(N)，-733(N)，-739(N)，-817(N)，-821(N)，-879(N)，-1459(N)；10个CGTCA基序，分别位于-237(N)，-1180(N)，-1126(P)，-962(P)，-683(P)，-305(P)，-297(P)，-312(P)，-140(P)，-234(P)；10个TGACG基序，分别位于-237(P)，-1180(P)，-1126(N)，-962(N)，-683(N)，-305(N)，-297(N)，-312(N)，-140(N)，-234(N)；7个Skn-1基序，分别位于-182(P)，-765(P)，-1197(P)，-1302(P)，-1489(P)，-922(N)，-1240(N)；4个Sp1元件，分别位于-334(P)，-1013(P)，-956(P)，-112(P)；2个CAT-box，位于-60(P)，-117(N)；2个MBS(MYB binding site)元件，位于-406(P)，-201(N)；2个GATA基序，位于-570(N)，-665(N)；2个I-Box I元件，位于-570(N)和-665(N)；2个TC-rich重复区，位于-1271(N)和-700(N)；2个TCT基序，位于-726(P)和-695(N)；as1、ATCT基序、3-AF3结合位点、BoxI元件、Box 4元件、C-box、CCGTCC-box、4cl-CMA2b、EIRE、GAG基序、GC基序、HSE、L-box、TCA元件、TCCC基序各1个，分别位于-234(P)、-1218(P)、-119(N)、-646(P)、-806(P)、-233(P)、-1104(N)、-575(P)、-658(N)、-514(N)、-48(P)、-41(P)、-575(P)、-1346(P)和-1346(P)。

玉米PZmMDH序列与目标基因的重组

采用常规的分子克隆技术将玉米PZmMDH全长或部分序列重组到目标基因正义或反义编码序列之前，或与目标基因RNAi结构连接，构建能在植物细胞表达的融合基因。这类融合基因可通过原生质体为受体的遗传转化和基因枪轰击法产生转化细胞及植株，也可将其插入植物双元表达载体系统的mini-Ti质粒，如pROK2或pCam系列质粒上用于农杆菌为中介的遗传转化。也可将PZmMDH全长或部分序列直接插入到植物表达载体中的目标基因编码区之前，形成融合基因。可根据受体植物种类和所需基因的表达强度及可调控程度，在融合基因中可引入分别适合于单、双子叶植物或不同低等生物的增强子或抑制子序列，或对特点信号发生反应的序列。融合基因可选择不同3′尾巴区，也可在编码区插入不同内含子、在编码框下游插入增强子序列。重组质粒可分别导入大肠杆菌或农杆菌中增殖或/和保存。目标基因可为：碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)基因、Bt毒蛋白基因、除草剂抗性基因和糖转运体基因等。

用含有玉米PZmMDH序列的植物表达载体转化植物

根据转基因受体材料选用不同转基因方法获得转基因植物。

常用的转化方法主要有2类：1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、聚乙二醇诱导法、电融合法、硅碳纤维法等直接将质粒DNA导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系胚性愈伤组织为材料采用基因枪轰击法进行遗传转化。

玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-15天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.8mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。

采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl₂、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。

在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将材料转入加有选择剂(如1-5ppm除草剂绿黄隆)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交结实。转基因植株采用PCR检测法筛选，Southern blotting验证。通过数代分子检测和自交结实产生纯系，在通过抗性鉴定和田间选择获得转基因优异材料。

转基因玉米植株的性状检测及利用

将转玉米PZmMDH序列融合基因的玉米种子和未转基因的对照自交系的种子播在的花盆和大田，分别在苗期(3～7叶期)、雌雄穗发育期(9～13叶期)、开花授粉期和成熟期进行转基因性状和植株生理指标的检测。综合多方面的测试结果，选出优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。

具体实施方式

实施例1：转PZmMDH::TPT1正义基因创造小麦高光效材料

植物细胞质与叶绿体基质间的磷转运主要是由磷酸丙糖/磷酸转运体(Triose-phosphate/phosphate translocator，TPT)来负责，该转运体可以将磷由细胞质转运到叶绿体中；与此同时，等摩尔的磷酸丙糖3-PGA从叶绿体基质转运到细胞质中。而当细胞质的磷浓度降低时，TPT转运体的活性受到抑制，从而导致代谢物在叶绿体中的积累。该实例所用的TPT基因为玉米ZmTPT1基因。

1.融合基因及植物表达载体的构建

用特异性引物以玉米基因组DNA为模板进行PCR反应，分别获得PZmMDH和ZmTPT1编码框及3`端序列。扩增产物电泳分析。采用AXYGEN回收Kit回收PCR扩增产生的DNA片段，具体操作见试剂盒说明书。将回收片段定量，选用EasyVector Systems Kit(Promega，USA)对PCR片段进行克隆。连接反应体系为：2×Ligationbuffer 5μL；DNA fragment XμL；T-easy Vector 1μL；T4DNA ligase 1μL；ddH₂O补足10μL。混匀反应物，4℃连接过夜，连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化菌经LB固体平板(50μg/mL Amp；80μg/mL X-gal；0.5mM IPTG)培养，挑取白色单菌落提取质粒DNA，酶切鉴定，阳性克隆送交上海博尚公司进行测序。对测序结果进行分析。

碱裂解法大量制备分别含有PZmMDH和PZmTPT1序列的质粒，聚乙二醇沉淀法纯化(参照《分子克隆实验指南III》24-28页)。用紫外分光光度计检测质粒DNA的浓度和纯度(OD260/OD280≈1.6-1.8)，调整浓度为1μg/μL。这些质粒用很少的限制性内切酶酶切，确保目标片段完整。酶切所用缓冲液参照TaKaRa产品说明选择。一般1μg质粒至少加1U的酶，37℃温育2h以上。

酶切质粒片段采用琼脂糖凝胶电泳分离，根据TIANGEN回收试剂盒说明书回收DNA片段，用凝胶成像系统中Smartview2001软件的Analysis功能对回收DNA片段进行定量。

回收的载体DNA片段经去磷酸化处理以防止自身环化。PZmMDH::TPT1融合基因构建采用常规的DNA重组技术。获得融合基因后，将其插入到Gateway质粒载体系统中的入门载体上。然后通过体外重组反应将入门载体上的融合基因引入到植物表达载体(即目标载体，已引入除草剂草甘膦抗性基因epsps)中。在体外重组试验中，一般入门载体50-150ng，目标载体150ng，补足TE buffer(PH8.0)至8μL。混匀后加入LR重组酶II混合物2μL，混匀，25℃温浴至少1小时或过夜。温浴放置结束后加入1μL蛋白激酶K终止反应，混匀，37℃温浴10分钟。反应混合物直接用于大肠杆菌的转化或冷冻保存。

从携带目标载体的大肠杆菌中小规模制备质粒DNA，用限制性内切酶酶切和PCR鉴定重组质粒。然后从入选克隆的大量培养物中大量制备目标质粒用于农杆菌转化。

氯化钙法制备感受态农杆菌，在室温下加入1μg目标质粒DNA，混匀后冰浴30min，置液氮速冻1min，经37℃保温3min后，加入1mLYEP培养基后摇匀，28℃下振荡(150rpm)培养3h。5000rpm离心3min收集菌体，加入100μL YEP液体培养基重悬，涂布于含50μg/mL利福平和相应抗生素的YEP平板上，28℃暗培养2-3d，待转化菌落长到合适大小，挑取单菌落进行培养和鉴定。入选菌落通过扩大培养后用于植物遗传转化。

2.小麦无菌苗获得

小麦优良品种的种子，用70％乙醇浸泡8分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(25-28℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥用于遗传转化。

3.农杆菌培养及活化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因bar和PZmMDH::TPT1融合基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

4.小麦无菌苗转化

(1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，将露出茎尖生长锥的萌发种子浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa大气压下处理8-15分钟。

(2)浸染后的种子用无菌滤纸吸干，种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2天，培养温度为20-22℃。然后将无菌苗(萌发种子)放在加有抗生素头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上继续培养3天。

(3)将培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温15-23℃，夜温12-18℃，隔3天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

5.转化植株筛选与定植

转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂(Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9.6ml-10.8ml

以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后5天后停止生长，15天左右死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间自交结籽。

6.转基因植株子代分析

T1代植株长到3叶期用10.8ml

水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田自交结实。T2代植株继续采用PCR技术跟踪外源基因，采用光合测定仪测定叶片净光合速率，并进行Southern blotting验证和采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。选出转基因纯系后进行产量性状的观测，选择优异株系进入生物安全性实验和玉米育种。

实施例2：转PZmMDH::Bt毒蛋白基因创造玉米抗虫自交系及应用

1.PZmMDH::Bt毒蛋白融合基因及植物表达载体的构建

融合基因构建采用常规的DNA重组技术。根据已克隆的PZmMDH和Bt毒蛋白基因序列，采用PCR方法引入合适的酶切位点，通过限制性内切酶消化和粘性末端连接，产生融合基因。经测序验证融合基因构建正确后，将其重组到植物表达载体中，并用于转化农杆菌，获得其Ti质粒T-DNA区含有转基因植物选择标记和目标基因的工程菌株。后者可用于植物遗传转化。

2.受体系统的建立

以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、DH4866等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有：

种子萌发培养基：KNO₃1900mg/l，NH4NO₃1650mg/l，CaCl₂·2H₂O440mg/l，MgSO₄·7H₂O 370mg/l，KH₂PO₄·H₂O 170mg/l，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l，ZnSO₄·7H₂O 10mg/l，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/l，H₃BO₃10mg/l，KI0.83mg/l，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/l，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8～6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。

A培养基：种子萌发培养基附加6-BA4.5～9.0μmol/l和2，4-D 1.0～3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。

B培养基：种子萌发培养基附加6-BA4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。

成苗培养基：种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。

生根培养基：种子萌发培养基附加IBA2.8～3.6μmol/l，用于无根小苗生根。

基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。

种子灭菌和萌发：玉米种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10--15分钟，然后用无菌水洗涤3--5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30---40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23---30℃)下1--2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。

茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化：萌发种子的胚芽伸长止3---5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下(24--27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6--10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为1.0μmol/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2--3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5--6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。

3.以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生

将带有双元载体(Mini--Ti质粒带有选择剂抗性基因bar和PZmMDH::Bt)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5--20倍用于转化。

取继代后培养13--20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7--12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。

将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22--28℃，夜温15--21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。

4.转基因植株的抗性检测和选择利用

取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。将转基因植株套袋自交结实。将来自不同T0植株的T1种子播在温室或具有防护设施的田间，出苗后取叶片采用酶联免疫检测方法测定Bt毒蛋白表达量，然后人工接种亚洲玉米螟卵块，观测植株抗虫性。Bt毒蛋白检测和人工接虫试验采用本领域所用的常规技术和试剂盒。T1代筛选出的抗虫植株继续套袋自交，对其子代继续进行分子生物学鉴定和抗虫性检测。通过数代自交纯合和抗性检测及选择，最终获得抗虫玉米自交系。该自交系可用于配制玉米抗虫杂交种。

实施例3：转PZmMDH::CA1基因创制高光效玉米自交系及应用

大量研究得出，在C3植物中，C3循环是在单细胞中完成的，大气中的CO₂直接通过Rubisco催化的羧化反应进入Calvin循环，而C4循环是在叶肉细胞和维管束鞘细胞中协同完成。首先，在叶肉细胞中，CO₂以HCO₃ ^-的形式为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)催化固定，形成C4二羧酸-草酰乙酸(OAA)，OAA再被还原为苹果酸(Mal)，然后通过胞间连丝转移到维管束鞘细胞中，再迅速在脱羧酶的催化下重新释放CO₂，参与Calvin循环，形成糖类；其次，在释放CO2的同时产生的丙酮酸(pyruvate，Pyr)又转移到叶肉细胞的叶绿体中，在丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)的催化下生成无机碳的受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，使光合反应循环进行。由于PEPCase对其底物CO₂有较高的亲和力，所以C4植物固定CO₂的能力远大于C3植物。C4植物光合作用的起始步骤是在碳酸酐酶(CA，carbonic anhydrase)催化下将CO₂快速转换成HCO₃ ^-，为PEPCase固定碳提供前体(HCO₃ ^-)(Hatch和Bumell 1990)。在缺少细胞质CA的条件下，C4植物的光合作用估计将会降低到原来的万分之一。C4植物中的绝大多数CA均定位在叶肉细胞的细胞质中，并在那里催化空气中的CO₂进入叶中形成C4光合途径的前体HCO₃ ^-(Ludwig等1998)。Caemmerer等(2004)将编码细胞质CA的cDNA反义基因导入C4双子叶植物(Flaveria bidentis)后，转基因植株的CO₂同化率降低，以致植株生长需要更多的CO₂。用光谱技术测定T1代植株叶中CA活性和CO₂同化速率之间数量关系的结果表明，当CA活性不及野生型的20％时CO₂同化速率急剧下降，在正常条件下生长不正常。本实例则是将来自玉米的ZmCA1基因与PZmMDH融合，再将融合基因插入到植物表达载体中用于玉米转基因，获得了在高光低CO₂环境中光合速率比未转基因对照明显提高的转基因材料。

1.融合基因及植物表达载体的构建

用特异性引物以玉米基因组DNA为模板进行PCR反应，分别获得PZmMDH和ZmCA1编码框序列。采用AXYGEN回收Kit回收PCR扩增产生的DNA片段，对PCR片段进行克隆。通过酶切和测序鉴定，挑选序列正确的DNA片段进行融合基因的构建。采用碱裂解法结合聚乙二醇沉淀大量制备分别含有PZmMDH和ZmCA1编码框序列的质粒，用紫外分光光度计检测质粒DNA的浓度和纯度(OD260/OD280≈1.6-1.8)，调整浓度为1μg/μL。然后选用合适的限制性内切酶酶切质粒，确保目标片段完整。酶切所用缓冲液参照TaKaRa产品说明选择。一般1μg质粒至少加1U的酶，37℃温育2h以上。

酶切质粒片段采用琼脂糖凝胶电泳分离，根据TIANGEN回收试剂盒说明书回收DNA片段，用凝胶成像系统中Smartview2001软件的Analysis功能对回收DNA片段进行定量。

回收的载体DNA片段经去磷酸化处理以防止自身环化。PZmMDH::CA1结构构建采用常规的DNA重组技术。获得融合基因后，将其插入到Gateway质粒载体系统中的入门载体上。然后通过体外重组反应将入门载体上的融合基因引入到植物表达载体(即目标载体，已引入除草剂草甘膦抗性基因epsps)中。在体外重组试验中，一般入门载体50-150ng，目标载体150ng，补足TE buffer(PH8.0)至8μL。混匀后加入LR重组酶II混合物2μL，混匀，25℃温浴至少1小时或过夜。温浴放置结束后加入1μL蛋白激酶K终止反应，混匀，37℃温浴10分钟。反应混合物用于大肠杆菌的转化。

从携带目标载体的大肠杆菌中小规模制备质粒DNA，用限制性内切酶酶切和PCR鉴定重组质粒。然后从入选克隆的大量培养物中大量制备目标质粒用于农杆菌转化。

氯化钙法制备感受态农杆菌，在室温下加入1μg目标质粒DNA，混匀后冰浴30min，置液氮速冻1min，经37℃保温3min后，加入1mLYEP培养基后摇匀，28℃下振荡(150rpm)培养3h。5000rpm离心3min收集菌体，加入100μL YEP液体培养基重悬，涂布于含50μg/mL利福平和相应抗生素的YEP平板上，28℃暗培养2-3d，待转化菌落长到合适大小，挑取单菌落进行培养和鉴定。入选菌落通过扩大培养后用于植物遗传转化。

2.玉米无菌苗的获得

套袋获取玉米骨干自交系如郑58、齐319、昌7-2等种子，用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上，在黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长至3-5厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。

3.农杆菌培养及活化

将带有双元载体(Mini-Ti质粒，该质粒带有PZmMDH::CA1和除草剂草甘膦抗性基因epsps)的根癌农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/L乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释到OD₆₀₀0.6用于玉米遗传转化转化。

4.玉米无菌苗转化

A.把菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，将露出茎尖生长锥的无菌苗顶端浸泡在菌液中2-5分钟(AGL15分钟，LBA44049分钟)。

B.浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，将根部插入改良MS培养基中于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃，然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

C.将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石和下层壤土的花盆中，蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温18-23℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

5.转化植株筛选与定植

转化植株长出3片叶后，喷洒草甘膦(浓度为未转基因植株死亡98％以上)水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株不掉液滴为宜。对照植株在喷洒后3天停止生长，15天左右开始死亡。转化处理后的植株，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。存活植株长到5叶期，将其定植到田间。

6.转基因植株的鉴定、管理和后代分析

抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting验证和RT-PCR检测。转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting检测和RT-PCR检测，从中选出转基因植株。同时对转基因植株进行套袋自交留种，分析下一代中转基因个体的比例，选出转基因纯合系。

7.转基因植株后代选择

T1代植株长到3叶期用未转基因植株全部死亡的除草剂草甘膦水溶液喷洒，观察统计抗性和敏感性个体比例；采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。存活植株移栽到大田，套袋自交。T2代植株除套袋自交结籽外，采用PCR技术检测外源基因进行Southern blotting验证，并采用RT-PCR技术检查转基因表达强度。对于入选的转基因株系测定植株在不同光强和温度下净光合速率的变化，测定3-7叶期小苗生长速率，测定单株产量和生物量，并以未转基因植株为对照。选出优良的转基因株系后在大田栽培条件下进行玉米产量性状的观测和比较，选择高光效高产株系进入生物安全性试验和玉米育种实验。

本实施例创造出了耐旱耐盐性显著提高的转基因玉米材料。

Claims (4)

1.一种玉米胞质苹果酸脱氢酶基因启动子序列在构建融合基因改变植物性状中的应用，其特征是，从玉米基因组中克隆出的序列为SEQ ID No.1所示的胞质苹果酸脱氢酶基因启动子与玉米磷酸丙糖/磷酸转运体基因TPT1、Bt毒蛋白基因、和玉米碳酸酐酶基因CA1分别构建成融合基因，重组到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，产生转基因植株。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，将玉米胞质苹果酸脱氢酶基因启动子序列与玉米磷酸丙糖/磷酸转运体基因TPT1融合构建植物表达结构，通过遗传转化获得光合效率比非转基因受体植株提高的转基因玉米。

3.如权利要求1所述的应用，其特征是，将玉米苹胞质果酸脱氢酶基因启动子序列与Bt毒蛋白基因融合构建植物表达结构体，通过遗传转化获得转基因抗虫玉米。

4.如权利要求1所述的应用，其特征是，将玉米胞质苹果酸脱氢酶基因启动子序列与玉米碳酸酐酶基因CA1融合构建植物表达结构，通过遗传转化获得低CO₂环境中光合效率比非转基因受体植株提高的转基因玉米。