CN109182336A - 海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子，包括包含其元件的DNA表达盒。本发明通过扩增太平洋海洋杆菌R‑5321(Oceanobacillus picturae strain R‑5321)苹果酸脱氢酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可广泛用于太平洋海洋杆菌属(Oceanobacillus picturae)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。有利于促进今后的太平洋海洋杆菌属细菌的菌株改良和代谢工程的研究。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种海洋低温苹果酸脱氢酶的启动子、终止子，包括包含其元件的DNA表达盒。
背景技术
微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有强大的生物合成能力。海洋占据了地表的70％，蕴藏着丰富未知的海洋资源，是巨大的资源宝库。而海洋微生物更具有自身优势。其生产环境(高压、高盐、低温、低营养、低光照等)决定其产生的酶具有在低温和高盐环境下能够继续保持较高的活力。对海洋微生物低温酶的研究和开发，已经在国内外引起了广泛的关注。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其代谢产物的生产高效、快捷、具有反应条件温和、可控性强、易于大规模生产等特点，可作为一个优良的细胞工厂。
海洋微生物具有一种重要的生态功能-生物修复，作为海洋生态系统的重要组成，在海洋环境中，它们能够降解包括金属，石油产品，脂肪族和芳香族碳氢化合物，工业溶剂，农药及其它代谢物等化学物质。其中太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)便在其中扮演着重要的角色。在清除海洋环境污染物及海洋自净中发挥重要的作用。
MDHs(低温苹果酸脱氢酶)作为生物体中心代谢途径的关键酶，在遗传变异和个体发育等具有重要的研究价值，并在临床诊断、工业检测具有广泛应用，市场需求量与日俱增，价值巨大。自上世纪50年代，就已经有学者从动物心肌中分离出MDHs。现阶段，市场上商业化的MDHs来源主要是猪、兔、牛的心肌、肝脏、骨骼肌中提取。原料成本低、来源广，但提取工艺繁琐，产品酶活较低。因此，拓展新的来源显得尤为重要。而海洋微生物是巨大的资源宝库。从中筛选新型的、低温的、高活性的目的MDHs产生菌株显得尤为重要。
目前，未见适合于太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)的启动子序列的报道，也未见适用于太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)遗传操作系统，也未见高效的MDHs基因克隆载体，这些都制约了靶向性的菌株改造。因此，分离能够在太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)中启动报告基因表达的苹果酸脱氢酶启动子成为研究的热点。
发明内容
鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可通用于太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)中外源基因表达的启动子和终止子的DNA表达盒。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
海洋低温苹果酸脱氢酶启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述海洋低温苹果酸脱氢酶启动子用于构建能够在太平洋海洋杆菌属(Oceanobacillus picturae strain)中表达的重组表达载体的应用，其中克隆了包含所述海洋低温苹果酸脱氢酶启动子的重组表达载体的太平洋海洋杆菌属细菌菌株构成太平洋海洋杆菌细菌属遗传操作系统。
一种DNA表达盒，其含有如SEQ ID NO：1所示的海洋低温苹果酸脱氢酶启动子的核苷酸序列。
上述DNA表达盒，其还含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架。
上述DNA表达盒，所述编码目的基因的开发阅读框架的cDNA序列具有如SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列。
上述DNA表达盒，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架，其序列之间为多克隆位点，并且包含选择性标记基因。
上述启动子终止子来源如下：
(A)一种具有太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段：
(1)具有如SEQ ID NO：1所示序列的全部序列或包含3’-末端起1350bp以内的部分序列；
(2)具有如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1350bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，
(3)或对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。
(B)一种来自太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)的DNA片段，所述DNA片段可作为终止子：具有如下：
(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列；
(2)具有可与(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。
(C)一种可完成靶基因在太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)中转录起始和转录终止的DNA分子，它具有上述(A)所述的具有太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)转录启动子活性的DNA序列，或同时具有上述(A)所述的具有太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)转录启动子活性的DNA序列，和(B)所述的DNA片段，且(B)所述的DNA片段位于(A)所述的DNA序列的下游，与其相邻1-1000个核苷酸的DNA片段。
(D)本发明涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子；连接的DNA表达盒，以便于所述靶基因能够在太平洋海洋杆菌(Oceanobacillus picturae strain)中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。优选地，所述目的基因的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列
与现有技术相比，本发明的有益效果为：为太平洋海洋杆菌属的细菌提供了启动子、终止子遗传转化方法，将有利于促进今后的太平洋海洋杆菌属细菌的菌株改良和代谢工程的研究。
附图说明
图1表示MDH简并PCR产物(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准；
图2表示pMDH启动子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准；
图3表示MDHt终止子DNA片段(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳的结果，泳道M为分子量标准。
具体实施方式
在发明中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。
启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将报告基因(如抗性基因)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因是否表达。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。
在发明中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。
本发明中的“太平洋海洋杆菌”，包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。
本发明中的启动子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起1350bp以内的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1350bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。
本发明中的终止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA 序列5’-末端的部分序列杂交的、目保持转录终止子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有50％以上同源性、且具有终止子活性的序列。
本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基因-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化为太平洋海洋杆菌属菌株，以便于目的基因表达，可以优选质粒载体作为介导载体。
本发明的启动子可以按照以下方面从太平洋海洋杆菌中分离。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连TakaRa公司完成。
实施例1
太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)基因组DNA的提取
将太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)由平板接种到5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，pH 7.2)中，于25℃、150r/min摇床培养16h，再以5％接种量将菌液分别转接到100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于25℃、150r/min摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，5000rpm离心4min，收集菌体。使用TIANGEN公司TIANamp Bacteria DNA试剂盒，并按照其标准步骤提取基因组DNA。
基因组DNA 进行0.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的一条带。用紫外/可见光光谱仪分析基因组DNA样品，测得OD260/OD280＝1.8，表明基因组DNA质量很好。浓度为120ng/μl，共500μl，基因组DNA 样品冻存于-20℃，备用。
实施例2
太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)基因组总RNA 的提取
将太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)由平板接种到50ml牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，pH 7.2)中，于25℃、150r/min摇床培养16h，再以2％接种量将菌液分别转接到100ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于25℃、150r/min摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，5000rpm离心4min，收集菌体。使用TakaRa公司RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。
总RNA 进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的二条带。用紫外/可见光光谱仪分析基因组RNA样品，测得OD260/OD280＝2.01，表明总RNA质量很好。浓度为120ng/μl，共500μl，总RNA 样品冻存于-80℃，备用。
实施例3
太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)cDNA 第一链合成和MDH简并PCR
以太平洋海洋杆菌R-5321总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。
首先，将1.0μl总RNA(约2μg)，1.0μl引物SMART IV：5-GGAGGTCACACTCATGCCGAACACA CGGCCGGG-3′和1.0μloligo dT-接头引物CDSIII/3′：5-ATTGAGAATTGTCGAATTTAGTCGGAAATG-d(T)30N-1N-3′，2.0μl DEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TakaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于72℃保温2min，立即置于冰上冷却2min，将2.0μl5×第一链缓冲液(Clontech公司)，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTP(10mM)，1.0μl powerscript反转录酶(Clontech公司)加入到体系中，混匀。于42℃延伸反应60min，最后4℃结束反应，存于-20℃，备用。
设计合成两条简并引物:MDH-sense:5'-ATGGC(TATTA)AAAGAA(GTAA)AA(TA)TCAG(TAAT)CGG(ATC)AGG-3'(括号内的碱基在此位置随机出现，为简并碱基)和MDH-anti：5'-TTA(GATTCAG)TT(AAA)AATGTCC(TAAG)TATA(TT)GGGA-3'，(括号内的碱基在此位置随机出现，为简并碱基)以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行MDH基因的简并PCR扩增，10×PCR缓冲液5.0μl，dNTPs(10mM)1.0μl，上游引物(50mmol/l)1.0μl，下游引物(50mnol/l)1.0ul，rTaq酶(大连TakaRa)0.5μl，合成的cDNA第一链模板1.0μl，ddH2O 40.5μl，于94℃保温3min，然后于94℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到1.2kb左右的条带(图1)，利用DNA回收试剂盒(购自碧云天)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照大连TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体(购自大连TakaRa)，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，序列结果推测出的氨基酸序列经Blast分析，证实为苹果酸脱氢酶序列(MDH氨基酸序列)，如SEQ ID NO：5所示。苹果酸脱氢酶cDNA序列(MDH cDNA)如SEQ ID NO：4序列所示。
实施例4
太平洋海洋杆菌R-5321基因组DNA的扩增
根据实施例3中获得的苹果酸脱氢酶cDNA序列，设计1对基因特异性引物，MDH-p1：5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTATTAAAAGAAGTAAAATATCAGTAATCGGATCAGG-3'和MDH-p2：5'-GCAGATTCAGTTAAAAATGTCCTAAGTATATTGGGACACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGC-3'，太平洋海洋杆菌R-5321的基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，得到约1.6kb的PCR产物(未显示)。PCR扩增产物按照实施例3的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体，并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO：3所示的DNA序列(MDH阅读框架)。经与实施例3中获得的苹果酸脱氢酶cDNA序列比对，证实该基因片段为其苹果酸脱氢酶基因组DNA序列(gDNA)，其中含有4个内含子和5个外显子。
实施例5
染色体步移获得MDH基因5’翼侧序列(启动子)
本实施例利用Genome Walking Kit(购自大连TakaRa)完成。
根据实施例3中得到的MDH DNA序列，设计3条Specific Primer(基因特异性引物)分别为MDH-SP1：5-ATGGCTATTAAAAGAAGTAAAATATCAGTAATCGGATCAGG-3’，MDH-SP2：5’-TTCCTTTTTATCAAAACTCCCTTGGCATGC-3’和MDH-SP3：5’-ATGTCCATCTGGTGTGTTATAATTGGCTTA-3’，做为下游引物，按照试剂盒说明书进行以下操作。1.1st PCR反应
以实施例4中精制的基因组DNA为模板，进行第一轮扩增。
反应体系50μl：10×LAPCR buffer II(Mg2+plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，MDH-SP1(10μmol/l)1.0μl，太平洋海洋杆菌R-5321基因组DNA模板(120ng/μl)1.0μl，ddH2O加至50μl。
反应条件：先进行5个高温退火温度的高特异性反应，然后进行1个极低退火温度的低特异性反应；然后进行热不对称PCR：2个高退火温度(65℃)的高特异性反应和1个低退火温度(44℃)的低特异性反应交替循环，共15次。具体参数如下：94℃1min，98℃1min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，共5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。
2.2nd巢式PCR反应
反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg2+plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，lst PCR反应产物1.0μl，MDH-SP2(10μmol/l)1.0μl，ddH2O加至50μl。
反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。
3.3rd巢式PCR反应
反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg2+plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，2nd巢式PCR反应产物1.0μl，MDH-SP3(10μmol/l)1.0μl，ddH2O加至50μl。
反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。
3rd巢式PCR反应产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带(如图2所示)，利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，证实为预期的pMDH基因序列。
实施例6
染色体步移获得MDH基因3’翼侧序列(终止子)
本实施例也是利用Genome Walking Kit(购自大连TakaRa)完成。
根据实施例4中得到的MDH DNA序列，设计3条Specific Primer(基因特异性引物)分别为MDH-SP11：5-GCAGATTCAGTTAAAAATGTCCTAAGTATATTGGGA-3’，MDH-SP22：5’-ATGCGTTATACTAGAATCGAGAAAAGAAACA-3’和MDH-SP33：5’-ATGGAA AAG A TGCT AGCAAATAA-3’，做为上游引物，按照试剂盒说明书进行3’翼侧染色体步移操作，除Specific Primer分别由MDH-SP1，MDH-SP2，MDH-SP3依次更换为MDH-SP11，MDH-SP22，MDH-SP33外，其它同实施例5。
3rd巢式PCR反应产物(如图3所示)利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化，经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，证实为预期的苹果酸脱氢酶终止子(MDHt)基因序列。
实施例7
MDH启动子-开放阅读框架-终止子全长基因获得
根据实施例5和实施例6中获得的启动子和终止子序列，重新设计一对引物进行LsFBA“启动子-开放阅读框架-终止子”全长基因的扩增。pMDH-p2：5-ATGCTTTTTATCA AAACTCCCTTGGCATGC-3’，MDHt-p2：5-GTT GTTCCAGCTATTATTGGGCTATCCCTGCGCC-3’。
以实施例4中制备的太平洋海洋杆菌R-5321基因组DNA为模板进行PCR扩增。
PCR体系(50μl)：10×Speed buffer(大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(10mmol/l)1.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，SpeedSTARTM HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司)0.5μl，基因组DNA模板(120ng/μl)2μl，ddH2O加至50μl。
反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃1.0min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，证实为预期的pMDHt(苹果酸脱氢酶)基因全长序列，该重组载体命名为T-MDH。
序列表
<110> 大连大学
<120> 海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> 太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)
<400> 1
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tggaagggat agcgtccaag tgcatggcta cttgatcacg acccttcata agttctttta 1200
caacaaattg agaacaacga agaacagcag gtcctgaaac accaaaatgg gtgaaaagca 1260
tgtccatctg gtgtgttata attggcttaa attcggttcc tttttttgtt aagtacagag 1320
ttgttccagc tattattggg ctatccctgc 1350
<210> 2
<211> 1000
<212> DNA
<213> 太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)
<400> 2
gaccaagatc acctaaatac gtttcaattg aagaaagata aaagagatag ctagacacag 60
ataacgggga atgcgttata ctagaatcga gaaaagaaac aggaggtttt taacaatgac 120
acaaggaaca aaaattacag ttgaaaacgg aaaaatgaat gtcccagacg ttccagtaat 180
tccttttatt gaaggagatg gaactggccc ggatatttgg gctgcagcta gcagtgtaat 240
tgaggctgct gttgagaagg cttcaatggc acgaagaaaa tagaatggtt agaagtattt 300
gctgtcaaaa agcattcgac cagacagggg aatgctgcca aaggatactc ttgtaaaatc 360
aatgaataca aaattgcaat taaaggaccg cttactacac caattggtgg tggtattcgt 420
tcattaaacg ttgctttacg tcaagagctt gacttattca catgcttgcg tcctgtacga 480
tattttgaag gtgtaccatc tccagttaaa cgaccagaag atgtagatat ggtttcttcc 540
gtgaaaatac agaagatatc tatgcaggga ttgaatggca aaaaggttca gatgatgtta 600
aaaaggttat tgaattcctt aaaaatgaga tgaatgtaag caacattcgc ttccctgaaa 660
cgtctggtat tggtgtgaag ccagtatctg aagagggtac aaaacgccta gtacgttcaa 720
gtattgaata tgcactgaat gaaggacgta agagtgttac tttagtacat aaaggtaaca 780
ttatgaaatt tacagaaggt gcttttaaag catggggata tgaagtagct gaagaagaat 840
ttggtgataa agtcttcact tgggctgaat atgatcattg tagagaaaag atggaaaaga 900
tgctagcaaa taaagcacag gacgaagctt tagcatcagg caaaatctta gttaaggatt 960
caattgccga cattttctta caacagattt agaccgaaag 1000
<210> 3
<211> 942
<212> DNA
<213> 太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)
<400> 3
atggctatta aaagaagtaa aatatcagta atcggatcag gcttcactgg agcaacaact 60
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gaggatccga caaaaggaaa agcattggac atgcttgaag caagtccagt acaaggtttt 180
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attacagctg ggattgctag aaaaccaggc atgagtcgtg acgatttagt taatacaaat 300
gctaaaataa tgaagactgt agccaaggaa gtcgttaaat attctcctga tacctttatc 360
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ccaaaagaac ggcgtaattg gtcaatctgg tgtattggac acagctcgtt tccgtacatt 480
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<211> 613
<212> DNA
<213> 太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)
<400> 4
atggctatta aaagaagtaa aatatcagta atcggatcag gcttcactgg agcaacaact 60
gctttgtttt gatgcgaaga ttacaggtac gtctaattat gaggaaacta aagtcgtgac 120
gatttagtta atacaaatgc taaaataatg aagactgtag ccaaggaagt cgttaaatat 180
tctcctgata cctttatcgt agtgttaaca aatcctgttg acgccatgac gtatactata 240
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cgtcgtgtta taccatctat tgcttactta gaaggagagt atggttacag cgatatttac 480
ttaggagtgc caacagtgct tgggtggaaa aggtattgaa gaaatcattg aacttgattt 540
aactgaagaa gaaagaactg cgcttgataa atcagcagat tcagttaaaa atgtcctaag 600
tatattggga taa 613
<210> 5
<211> 312
<212> PRT
<213> 太平洋海洋杆菌R-5321(Oceanobacillus picturae strain R-5321)
<400> 5
Met Ala Ile Lys Arg Ser Lys Ile Ser Val Ile Gly Ser Gly Phe Thr
1 5 10 15
Gly Ala Thr Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln Lys Glu Leu Gly Asp Val
20 25 30
Val Leu Val Asp Ile Pro Asn Met Glu Asp Pro Thr Lys Gly Lys Ala
35 40 45
Leu Asp Met Leu Glu Ala Ser Pro Val Gln Gly Phe Asp Ala Lys Ile
50 55 60
Thr Gly Thr Ser Asn Tyr Glu Glu Thr Lys Asp Ser Asp Leu Val Ile
65 70 75 80
Ile Thr Ala Gly Ile Ala Arg Lys Pro Gly Met Ser Arg Asp Asp Leu
85 90 95
Val Asn Thr Asn Ala Lys Ile Met Lys Thr Val Ala Lys Glu Val Val
100 105 110
Lys Tyr Ser Pro Asp Thr Phe Ile Val Val Leu Thr Asn Pro Val Asp
115 120 125
Ala Met Thr Tyr Thr Ile Phe Lys Glu Ser Gly Leu Pro Lys Glu Arg
130 135 140
Val Ile Gly Gln Ser Gly Val Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Thr Phe
145 150 155 160
Val Ala Gln Glu Leu Asn Leu Ser Val Lys Asp Ile Thr Gly Phe Val
165 170 175
Leu Gly Gly His Gly Asp Asp Met Val Pro Leu Ile Arg Tyr Ser Tyr
180 185 190
Ala Gly Gly Ile Pro Leu Glu Lys Leu Ile Ser Lys Glu Arg Leu Asp
195 200 205
Ala Ile Val Glu Arg Thr Arg Lys Gly Gly Gly Glu Ile Val Gly Leu
210 215 220
Leu Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Pro Ala Ala Ser Leu Thr Val
225 230 235 240
Met Ala Glu Ala Ile Leu Lys Asp Gln Arg Arg Val Ile Pro Ser Ile
245 250 255
Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Tyr Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Leu Gly Val
260 265 270
Pro Thr Val Leu Gly Gly Lys Gly Ile Glu Glu Ile Ile Glu Leu Asp
275 280 285
Leu Thr Glu Glu Glu Arg Thr Ala Leu Asp Lys Ser Ala Asp Ser Val
290 295 300
Lys Asn Val Leu Ser Ile Leu Gly
305 310
Claims (5)
1.海洋低温苹果酸脱氢酶启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
2.一种含有权利要求1所述的海洋低温苹果酸脱氢酶启动子的核苷酸序列的DNA表达盒。
3.如权利要求2所述的DNA表达盒，其特征在于，所述表达盒还含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQ ID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架。
4.如权利要求3所述的DNA表达盒，其特征在于，所述编码目的基因的开发阅读框架的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的DNA表达盒，其特征在于，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开发阅读框架，其序列之间为多克隆位点，并且包含选择性标记基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811043027.3A CN109182336A (zh) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811043027.3A CN109182336A (zh) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109182336A true CN109182336A (zh) | 2019-01-11 |
Family
ID=64915360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811043027.3A Pending CN109182336A (zh) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 海洋低温苹果酸脱氢酶启动子和终止子 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993008277A1 (en) * | 1991-10-16 | 1993-04-29 | Public Health Laboratory Service Board | Expression of polypeptides in e.coli under control of the e.coli mdh-gene promoter |
| CN101979551A (zh) * | 2010-10-09 | 2011-02-23 | 山东大学 | 玉米苹果酸脱氢酶基因启动子序列克隆和应用 |
-
2018
- 2018-09-07 CN CN201811043027.3A patent/CN109182336A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993008277A1 (en) * | 1991-10-16 | 1993-04-29 | Public Health Laboratory Service Board | Expression of polypeptides in e.coli under control of the e.coli mdh-gene promoter |
| CN101979551A (zh) * | 2010-10-09 | 2011-02-23 | 山东大学 | 玉米苹果酸脱氢酶基因启动子序列克隆和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SONG,L. ET AL.: "GenBank: CP020357.1", 《GENBANK》 * |
| 张蕾 等: "《植物发育生物学实验指导》", 30 November 2010, 武汉大学出版社 * |
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
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