CN111394445A

CN111394445A - 用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用

Info

Publication number: CN111394445A
Application number: CN202010142821.4A
Authority: CN
Inventors: 汪亚平; 陈昆慈; 黄容; 欧密; 杨诚; 赵建; 何利波; 李勇明; 廖兰杰
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111394445B

Abstract

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，公开了用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用，本发明通过全基因组测序和一个生物信息分析流程，开发了斑鳢性别特异的标记，针对该特异性序列，可以利用HRM检测技术对斑鳢的XX、XY和YY性别进行鉴定，经验证准确率达100%。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，可为其它鱼类性别标记发掘、乌斑杂交鳢性控育种和杂交鳢养殖产业的发展提供帮助。

Description

用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用。

背景技术

斑鳢(Channa maculata)主要分布于我国珠江水系及海南省各水系，乌鳢(Channaa rgus)主要分布于长江及长江以北各水系，它们同属鲈形目、鳢科、鳢属。乌鳢在淡水经济鱼类中体型中等偏大，是一种凶猛的肉食性鱼类；斑鳢相对于乌鳢体型较小，同样以肉食性鱼类为主要摄食特征，但经过人工驯养后，也能摄食人工配合饲料。

中国水产科学研究院珠江水产研究所、广东省中山市三角镇惠农水产种苗繁殖场以乌鳢为母本，斑鳢为父本，通过差异化亲鱼培育促进亲本性腺发育同步化和一对一配对，杂交获得F1，即为乌斑杂交鳢。在相同养殖条件下，杂种优势明显，与母本和父本相比，体重分别提高37.6％和123.7％，可全程摄食人工饲料，抗寒能力明显提高，可在山东等地越冬养殖。适宜在我国黄河以南人工可控的淡水水体中养殖。2014年，乌斑杂交鳢通过全国水产原种和良种审定委员会审定，品种登记号为GS-02-002-2014。近年来，鳢的养殖产量逐步提升，2017年养殖产量达48万吨。乌斑杂交鳢中的雄性个体生长比雌性快100～200％。全雄杂交鳢具有生长快、个体大、经济价值高的优点，养殖效益将大幅度提高。养殖全雄杂交鳢比相同数量的普通杂交鳢预计每亩可增收3～5万元，具有重大经济意义。培育全雄杂交鳢的前提条件是需要开发其性别特异的分子标记，尤其是早期可以区分YY超雄个体的分子标记。

为了得到高质量的斑鳢DNA性别特异分子标记，本发明通过全基因组测序和一个生物信息分析流程，开发了斑鳢性别特异的标记。针对该特异性序列，结合chelex100 DNA提取、常规PCR扩增和HRM检测技术对斑鳢的性别进行鉴定，经验证准确率达100％。

发明内容

本发明的目的在于提供用于斑鳢性别鉴定的Indel标记，所述标记涉及到的序列为SEQ ID NO.3所示。

本发明的另一个目的在于提供包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列在鉴定斑鳢性别中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了用于斑鳢性别鉴定的检测引物。

本发明的最后一个目的在于提供了用于斑鳢性别鉴定的检测引物在鉴定斑鳢性别中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

斑鳢性别鉴定的Indel标记的获得：

利用图1所示的生物信息分析流程，获得了斑鳢性别染色体中的一个Indel标记，其为一段15个碱基的核苷酸序列：GTCTGTGCTCCACCC；在斑鳢的X染色体中含有这段序列，在Y染色体中则没有，因此可针对包含有这段indel标记的序列进行检测，以此来鉴别斑鳢性别。

包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列在鉴定斑鳢性别中的应用，包括利用本领域的常规方式，对包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列设计引物，进行检测；或使用其余测序等方式进行检测。

以上所述的应用中，本发明涉及到的包含SEQ ID NO.3所示序列为SEQ ID NO.2所示，因此可针对SEQ ID NO.2中，SEQ ID NO.3序列的上下游序列设计引物，进行斑鳢性别的鉴定；

以上所述的应用中，针对SEQ ID NO.3序列的上下游序列设计引物的其中一对为：

CMYSPE-F:CGGAGATAGATTTCGGCATT

CMYSPE-R:GGCTAACAGAGAATATCATACG。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明提供的性别鉴定的Indel标记，解决了斑鳢早期XX、XY和YY性别鉴定的难题，可以对斑鳢的XX、XY和YY性别进行鉴定，经验证准确率达100％。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点。本发明可为鱼类性别特异性标记发掘、杂交鳢性控育种和鳢养殖产业的发展提供帮助。

附图说明：

图1为开发斑鳢性别鉴定的Indel标记的生物信息分析流程。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

斑鳢性别鉴定的Indel标记的获得：

1)在繁殖季节通过解剖观察性腺的方式鉴定出斑鳢雌鱼和雄鱼各24尾，剪取尾鳍并提取其全基因组DNA。

2)将16尾雌性DNA等量混合为雌性混合池，16尾雄性DNA等量混合为雄性混合池。将雌性、雄性混合池以及剩下的8尾雌性和8尾雄性样品共18个样品，在Illumina Hiseq XTen平台进行全基因组测序。将原始数据过滤后的所有clean reads从5′端开始逐一进行AC、AG、AT、GA、GC和GT六种碱基起始的60bp片段化电子酶切，起始碱基不符合要求则向后位移。8尾雌性和8尾雄性样品的clean reads同样按照这个方法进行60bp片段化的酶切。

3)雌性、雄性混合池间的片段化数据进行比对获得两混合池特有的片段，以及共有的片段。在两混合池特有片段中，查看是否在8尾雌性和8尾雄性片段化的数据中出现。结果发现仅来源于8尾雄性的片段远多于8尾雌性的片段，以此判断斑鳢为XX/XY性别决定类型。

4)接下来从一条测序的雄鱼clean data数据中，调出所有仅来源于8尾雄性片段的reads序列，采用Velvet软件组装为雄性特异的Contigs。将这些Contigs与雌性混合池的60bp片段进行比对。挑出含有indels且罚分>45的候选Contigs。

5)将这些候选Contigs与8尾雌性和8尾雄性样品的clean reads比对。使用IGV软件，进行可视化Manual check。判断indels位点在8尾雄鱼中是否都是杂合的，在8尾雌鱼中是否都是纯合的。如果是则在indels的左右两侧，设计共有引物，进行有效性验证，最终获得雄性Y染色体中的含有Indel标记序列的CMYSPE序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，雌性中的X染色体中的对应序列为SEQ ID NO.2所示，较之于雄性的标记序列插入了GTCTGTGCTCCACCC(SEQ ID NO.3所示)，因此，可针对斑鳢中包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列设计引物进行斑鳢性别鉴定。

6)生物信息分析流程如图1所示。

实施例2：

SEQ ID NO.3所示序列在斑鳢性别鉴定中的应用过程：

1)针对包含SEQ ID NO.3所示序列的核苷酸序列设计引物：

CMYSPE-F:CGGAGATAGATTTCGGCATTCMYSPE-R:GGCTAACAGAGAATATCATACG

2)基因组DNA提取：

将150μl 5％浓度的chelex100加入装有尾鳍的96孔板，58℃消化1小时，100℃煮沸8分钟，4000转离心5分钟，取1μl上清作为PCR反应模板。

3)PCR扩增：

在96孔板配置反应体系，反应体系为10×Buffer(Mg²⁺plus)1μl；LC Green 1μl；dNTP(10mM each)0.2uL；CMYSPE-F(10mM)0.2uL；CMYSPE-R(10mM)0.2uL；Taq(5U/uL)0.1uL；模板DNA 1μl，最后补充ddH₂O至10μl。PCR反应条件均为94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，40个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。

超雄个体中的扩增得到的特异性序列为：

CGGAGATAGATTTCGGCATTTGCTTTCGCACTGTATTAACGACGGTCTACCTTAGACAATCGGACATCTTTATGTGTCGTATGATATTCTCTGTTAGCC；

雌性个体中扩增得到的特异性序列为：

CGGAGATAGATTTCGGCATTTGCTTGTCTGTGCTCCACCCTCGCACTGTATTAACGACGGTCTACCTTAGACAATCGGACATCTTTATGTGTCGTATGATATTCTCTGTTAGCC；

雄性个体中扩增得到的特异性序列为：

和CGGAGATAGATTTCGGCATTTGCTTGTCTGTGCTCCACCCTCGCACTGTATTAACGACGGTCTACCTTAGACAATCGGACATCTTTATGTGTCGTATGATATTCTCTGTTAGCC。

针对上述的PCR扩增产物，可利用本领域的常规方案，对扩增产物进行检测。

在本发明中，是利用HRM对扩增结果进行检测，PCR反应结束后，将96孔板直接放入LightScanner 96仪器板槽中进行HRM扫描，设置起始扫描温度68℃，终止扫描温度94℃，点击“Start Run”开始扫描；扫描结束后，得到分离曲线。

该曲线可完整分离出斑鳢的雌性个体、雄性个体和超雄个体。

实施例3：

SEQ ID NO.3所示序列在斑鳢性别鉴定中的应用过程：

1)收集已知性别的斑鳢个体雌雄各24尾，超雄10尾，采集鳍条组织样本保存于96孔板中冷冻保存，利用chelex100煮沸法提取其基因组DNA。

2)利用实施例2的方法对上述斑鳢DNA样本进行PCR扩增。

3)PCR扩增产物进行HRM分型。

4)HRM分型结果显示，利用本发明提供的Indel标记进行鉴定的结果，与已知结果完全一致，鉴定的准确率达到了100％。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atttatcatc cttgtaatag cggagataga tttcggcatt tgctttcgca ctgtattaac 60

gacggtctac cttagacaat cggacatctt tatgtgtcgt atgatattct ctgttagcct 120

ctatatcagc tcacc 135

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttatcatc cttgtaatag cggagataga tttcggcatt tgcttgtctg tgctccaccc 60

tcgcactgta ttaacgacgg tctaccttag acaatcggac atctttatgt gtcgtatgat 120

attctctgtt agcctctata tcagctcacc 150

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctgtgctc caccc 15

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggagataga tttcggcatt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggctaacaga gaatatcata cg 22

Claims

1.一种分离自斑鳢的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的核苷酸序列在斑鳢性别鉴定中的应用。

3.针对包含权利要求1所述序列的核苷酸序列设计的引物。

4.针对SEQ ID NO.2中，SEQ ID NO.3序列的上下游序列设计的引物。

5.权利要求2或权利要求3或权利要求4所述的引物在斑鳢性别鉴定中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，所述的引物为：CMYSPE-F: CGGAGATAGATTTCGGCATT和CMYSPE-R: GGCTAACAGAGAATATCATACG。