CN111471774B - 半滑舌鳎性别甄别用共显性长indel分子标记及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记及方法，属于水产生物鉴定方法技术领域，包括一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记，以及分子标记的检测方法，方法包括：获取候选INDEL位点、将筛选出的INDEL位点结合引物设计技术获得能扩增包含该INDEL的同源等位DNA片段的扩增子引物对、对设计好的候选引物对进行基因组特异性筛选、验证引物的有效性，以及利用电泳实验验证INDEL标记是否可鉴定出雌雄半滑舌鳎。相比于现有技术中鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，本技术方案的方法在保证准确率和高检出率的前提下，操作更快捷，成本更低廉，更重要的是：电泳条带差异更大、更便于性别基因型的确定。

Description

半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记及方法

技术领域

本发明涉及本发明属于水产生物技术中的海水鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，具体地说，是一种基于半滑舌鳎性染色体Z/W之间的长INDEL位点进行的甄别其性别和真伪雄鱼的共显性高效分子标记，以及低浓度琼脂糖凝胶电泳检测方法，即一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记及方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)，属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是我国海域特有的一种暖温性近海大型底层鱼类，主要分布于以黄海、渤海的沿岸地区。由于半滑舌鳎自然资源量少，味鲜鲜美，口感爽滑，营养丰富，因此具有广阔的养殖前景，是重要的名贵海水养殖鱼类。

半滑舌鳎作为比目鱼，雌性个体的生长速率是雄性个体的3倍以上(《半滑舌鳎的性腺分化和温度对性别决定的影响》邓思平，陈松林，田永胜等，2013)，而雄鱼具有生长缓慢、个体体型小的特点，降低了半滑舌鳎的养殖产量，同时使养殖成本增加。半滑舌鳎养成中雄鱼甚至可以达到80％—90％。研究发现在80％—90％比例的雄鱼中有部分是伪雄鱼。进一步地，有研究表明半滑舌鳎性别决定机制为性染色体Z和W，其中同型染色体ZZ为遗传雄性个体，异型染色体ZW型为遗传雌性个体(《半滑舌鳎染色体核型分析》周丽青，2005)。半滑舌鳎正常雄鱼具有ZZ型的染色体，正常雌鱼具有ZW型的染色体。而伪雄鱼遗传的是雌性染色体，基因型都是ZW型，但从其体貌特征和生殖器官上均表现为雄性特征，也可以像雄鱼一样产生可育精子和繁育后代，而且如果用伪雄鱼作为父本，那么后代也会遗传父本的特征成为伪雄鱼，这样通过逐代积累，就导致了半滑舌鳎养殖群体中生理雌性的比例的失衡即雄鱼越来越多，雌鱼越来越少，从而严重影响半滑舌鳎养殖产量。因此，对快速鉴定半滑舌鳎性别尤其是真伪雄鱼甄别的高效分子标记和检测方法的开发，对其遗传性别鉴定及生产养殖，具有重要的科学意义和应用价值。

在半滑舌鳎性别特异分子标记筛选和遗传性别鉴定方面，前人通过AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)标记技术分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记(《半滑舌鳎雌性特异aflp标记csef783的克隆及其在遗传性别鉴定中的应用》冯洪雨，陈松林，李静，田永胜等，2009)，由于AFLP标记是显性遗传，应用中不能区分ZW雌性和WW超雌个体，难以避免假阴性的结果，从而对ZZ雄鱼和ZW雌鱼产生误判。通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星scaffold68-2标记筛选(《半滑舌鳎性别特异微卫星标记的SCAR转化及其应用》刘洋等，农业生物技术学报，2014)，可针对共显性性别特异标记位点设计引物对半滑舌鳎遗传性别进行鉴定，但实际应用中微卫星内INDEL短(小于50bp)，导致来自Z染色体和W染色体的两种PCR扩增产物片段长度差异较小，对在凝胶电泳判定其长短时造成不小的困难。同时该技术检测中需用浓度为4％的琼脂糖凝胶以助于区分小的长度差异的条带(如小于50bp)，而高浓度的琼脂糖又不易配制、电泳用时长、费用高等问题，这都进一步限制了该方法的推广。

因此，研发一种基于长INDEL多态位点的共显性PCR分子标记来解决上述技术问题尤为必要。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术中，半滑舌鳎性别难以甄别的问题，本发明提供一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记及方法，通过设计一种独特的生物分子标记，即一种新型长INDEL多态位点的共显性PCR分子标记，配合特定的鉴定方法和步骤，以获得较为明显的区分证明，解决上述技术问题。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记，所述分子标记为半滑舌鳎ZW性染色体基因组序列中的性别特异性INDEL位点。

优选地，所述性别特异性INDEL位点的长度为779bp。

优选地，所述INDEL位点的标记检测引物序列为：

CS-SEX-PF取5′-GCAGCAACCACATCCTCAGT-3′；

CS-SEX-PR取5′-CAGGAACATGCAGTAGGACA-3′。

一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记的检测方法，其步骤包括：

S1、取用公用ZW染色体基因组序列，并采用生物信息学进行ZW等位基因序列的比对，获取候选INDEL位点；

S2、将S1中筛选出的INDEL位点结合Primer3Plus在线引物设计软件设计出能扩增包含该INDEL的同源等位DNA片段的扩增子引物对；

S3、对设计好的候选引物对进行基因组特异性筛选；

S4、以半滑舌鳎基因组DNA为模板PCR扩增多态性位点的等位序列用以验证引物的有效性；

S5、电泳实验验证INDEL标记是否可鉴定出雌雄半滑舌鳎。

优选地，所述S1中所有以半滑舌鳎性别特异性微卫星对应的目标片段的基因组序列为研究目标，使用该方法筛选到大于200bp的候选INDEL位点。

优选地，所述S3中筛选出基因组特异性引物对为：

CS-SEX-PF取5′-GCAGCAACCACATCCTCAGT-3′；

CS-SEX-PR取5′-CAGGAACATGCAGTAGGACA-3′。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明基于已公开的无知识产权的半滑舌鳎ZW性染色体基因组序列分析，寻找到半滑舌鳎Z染色体和W染色体上长于200bp的INDEL多态性位点，并基于此INDEL成功设计出基因组特异性PCR扩增子CS-SEX-PF和CS-SEX-PR标记引物，只需通过普通低浓度(1％)琼脂糖凝胶电泳实验即可实现雌雄性别鉴定(通过分别扩增Z染色体和W染色体上1.4kb和621bp的特异PCR产物)；相比于现有技术中鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，本技术方案的方法在保证准确率和高检出率的前提下，操作更快捷，成本更低廉，更重要的是：电泳条带差异更大、更便于性别基因型的确定。

附图说明

图1为本发明的半滑舌鳎的INDEL位点利用1％琼脂糖浓度测得的形态学雄性(真雄鱼)个体电泳单带结果图；

图2为本发明的半滑舌鳎的INDEL位点利用1％琼脂糖浓度测得的形态学雌性(含伪雄鱼)个体电泳道双带结果图；

图中：M为DNA marker

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例对本发明进一步阐述。

本实施例所采用的基因组序列源于半滑舌鳎全基因组测序数据，该数据为中国水产科学研究院黄海水产研究所水产基因组与细胞工程研究室完成，且以上数据已公开发表，并无产权保护。

一种基于长INDEL多态位点的共显性PCR分子标记的检测方法，包括以下步骤：

S1：根据公用的无ZW染色体基因组序列，并通过生物信息学进行ZW等位基因序列的比对，筛选到一段大小为779bp的INDEL多态性位点。

S2：根据此INDEL位点，结合Primer3Plus软件设计引物，具体设计参数为：

1)扩增片段长度应选择500-600bp；

2)引物长度20个nt(Nucleotide，核苷酸，表示引物序列长度的单位)；

3)Tm(Melting Temperature，为引物退火复性为双链DNA时的温度)值选择60℃。

S3：设计好的引物通过生物信息学工具筛选出基因组特异性引物对：

CS-SEX-PF：5′-GCAGCAACCACATCCTCAGT-3′

CS-SEX-PR：5′-CAGGAACATGCAGTAGGACA-3′

S4：利用酚-氯仿提取法从经过鉴定已知性别的半滑舌鳎鱼鳍组织中提取基因组DNA。

具体步骤：

1)用剪刀剪取半滑舌鳎鳍条组织约40μg，晾干后，放入1.5mL的离心管中。向离心管中加入300μL组织裂解液(10mmol/LTris-CI，pH8.0；100mmol/L EDTA，pH8.0；100mmol/LNaCl；0.5％SDS)，用剪刀剪碎鳍条组织；

2)向离心管中加入300μL组织裂解液，30μL蛋白酶K(20mg/mL)、5μL RNaseA(终浓度约100μg/ml)，充分混匀后于55℃水浴消化至半透明状，中途定时摇晃离心管以加快消化速度；

3)向离心管中加入600μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混合后轻轻摇晃约10min，然后放入4℃冷冻离心机中，12000r/min离心10min；

4)轻轻取出离心管，用剪好口的枪头从离心管内缓慢吸取约400μL上清液，转入新的离心管中，向吸取的上清液中加入等体积(400μL)的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，轻轻摇晃约10min以充分混匀，然后放入已提前预冷至4℃的冷冻离心机中，12000r/min离心10min；

5)小心取出离心管，用剪口的枪头缓慢吸取250μL上清液，转入新的离心管中，向离心管中加入2倍体积(500μL)预冷过的无水乙醇，沉淀DNA，轻轻上下摇晃离心管，可见白色絮状DNA沉淀出现；然后放入已提前预冷至4℃的冷冻离心机中，12000r/min离心5min，用移液器移走上层液；

6)离心管中的DNA沉淀用70％乙醇洗2次，放置在室温下晾干，最后加60μL ddH2O溶解DNA，-20℃贮存备用。

S5：Taq酶反应体系及PCR反应程序如下：

表中：dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸。

PCR反应程序所需环境参数为：第1步：94℃、5min；第2步：94℃、30s；第3步：60℃、30s；第4步：72℃、1min 30s；第5步：回到第2步，30次循环；第6步：72℃、7min；第七步：4℃保存。

S6：琼脂糖凝胶电泳；

1)配制1％浓度的琼脂糖；

2)取5ul PCR产物加入1ul 6×Loading Buffer(电泳上样缓冲液)；

3)140V 20min凝胶成像仪下记录鉴定结果。

S7：通过琼脂糖凝胶电泳结果判断半滑舌鳎性别，其中：电泳单带结果为遗传雄性个体，电泳道双带结果为遗传雌性个体。

结果显示，所取样品中可清晰分辩ZW雌性含有621bp和1400bp两种DNA条带，ZZ雌性仅有1400bp条带。

表一：60条半滑舌鳎INDEL标记鉴定结果。

以半滑舌鳎形态学性别鉴定结果为比照，确定本技术鉴定结果的准确度。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的普通技术人员应当了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都应落入要求保护的本发明内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

CS-SEX-PF：5′-GCAGCAACCACATCCTCAGT-3′；

CS-SEX-PR：5′-CAGGAACATGCAGTAGGACA-3′。

CS-SEX-PF：5′-GCAGCAACCACATCCTCAGT-3′；

CS-SEX-PR：5′-CAGGAACATGCAGTAGGACA-3′。

Claims (3)

1.一种检测半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对序列为：

CS-SEX-PF取5′-GCAGCAACCACATCCTCAGT-3′；

CS-SEX-PR取5′-CAGGAACATGCAGTAGGACA-3′。

2.一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记的检测方法，其步骤包括：

S1、取用ZW染色体基因组序列，并采用生物信息学进行ZW等位基因序列的比对，获取候选INDEL位点；

S2、将S1中筛选出的INDEL位点结合引物设计技术，获得能扩增包含该INDEL的同源等位DNA片段的扩增子引物对；

S3、对设计好的候选引物对进行基因组特异性筛选；

S4、以半滑舌鳎基因组DNA为模板PCR扩增多态性位点的等位序列用以验证引物的有效性；

S5、电泳实验验证INDEL标记是否可鉴定出雌雄半滑舌鳎；

所述S3中筛选出基因组特异性引物对为：

CS-SEX-PF取5′-GCAGCAACCACATCCTCAGT-3′；

CS-SEX-PR取5′-CAGGAACATGCAGTAGGACA-3′。

3.根据权利要求2所述的一种半滑舌鳎性别甄别用共显性长INDEL分子标记的检测方法，其特征在于：所述S1中所有以半滑舌鳎性别特异性微卫星对应的目标片段的基因组序列为研究目标，使用该方法筛选到大于200bp的候选INDEL位点。

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