CN107988385B - 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 - Google Patents

一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 Download PDF

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

本发明公开了一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒：基于PCR技术，以肉牛(郏县红牛)的血液基因组DNA池为模板，利用特异引物对P1扩增牛PLAG1基因的Indel位点，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果将不同个体分为缺失型、正常型以及杂合型，本发明提供的方法建立在肉牛PLAG1基因Indel位点与生长性状之间的关联性基础上，方法不仅简单，快速，便于推广应用，而且有利于加快肉牛分子标记辅助选择育种工作。

Description

一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒
技术领域
本发明属于分子遗传学研究领域，具体涉及一种检测肉牛(郏县红牛)PLAG1基因Indel标记的方法，该方法利用基因组DNA进行PCR，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果分型。
背景技术
遗传学标记在遗传学的建立和发展过程中具有举足轻重的作用，随着遗传学的进一步发展和分子生物学的异军突起，遗传标记先后相应经历了形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记四个发展阶段。前三个阶段是以基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映。而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映，能够直接反映DNA分子水平上的差异，再加之其多态性高、数量多，且标记表现为显性或共显性，因而其理论与应用价值不可估量。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
插入/缺失(insertion-deletion,InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基(Weber et al,2002)。InDel是同源序列比对产生空位(gap)的现象，但大多数情况下无法获知祖先序列(Fan et al,2007)，很难判断空位位点是哪个序列发生了插入突变，或哪个序列发生了缺失突变，所以一般统称它们为插入/缺失突变。InDel标记基于PCR扩增技术，本质上属于长度多态性标记(Hytenet al,2010)。InDel标记因其稳定性好、多态性高、分型系统简单(Jander et al,2002)，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。
根据InDel的大小，可将其分为3类：(1)小InDel：1-543nt；(2)微InDel：<50nt；(3)结构变异：>10,000nt。不同种类的InDel产生机制不同。微InDel通常是由于模板或引物“打滑”造成的，结构变异通常是大片段的插入/缺失，其产生机制与拷贝数变异类似。基因组结构变异主要通过四种机制产生：非等位同源重组、非同源末端连接、复制叉停滞与模板交换及通过L1介导的反转录转座。
沃森和克里克描述DNA双螺旋的结构后不久，Fresco和Alberts描述了含有不成对核苷酸的双链DNA分子模型。随后，Streisinger等提出了现在的经典假设，即移码突变由重复DNA序列中的链滑移导致，从而产生含有最终插入或缺失的不成对碱基的错配中间体。
InDel标记是基于基因组中插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，目前大多是利用电泳平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。当InDel位于某种限制性内切酶的酶切位点上时，可转化为扩增片段酶切长度多态性(CAPS)，先用该限制性内切酶酶切后再电泳分型(Konieczny&Ausubel,1993)。InDel长度变化较大，选择InDel位点时，应优先选择多态性差异5-20bp的InDel，这类InDel引物设计的成功率高，而且便于检测。为了节约高通量分型检测成本，Salathia等(2007)利用InDel阵列对拟南芥Landsbergerecta与Columbia两种生态型进行InDel分型，通过比较基因组杂交精确分析InDel多态性。也有研究利用测序技术进行InDel分型，错误率远低于1％(Bhangale et al,2005)，但成本偏高。
多形性腺瘤基因1(pleiomorphicadeno-ma gene 1,PLAGL1)是多形性腺瘤基因(pleio-morphic adenoma gene,PLAG)家族成员之一，其他成员包括PLAGL2和LAGL1。PLAG家族蛋白主要作为核蛋白转录调节因子对机体多种重要基因表达发挥调控作用。PLAG1基因是在唾液腺的多形性腺瘤中最常见的突变基因，可调节细胞凋亡和细胞周期，其作用与抑癌基因p53相似，并且还与新生儿短暂性糖尿病有关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法，包括以下步骤：以肉牛(例如，郏县红牛)的全血基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增获得包含插入/缺失(Indel)位点的肉牛PLAG1基因部分片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果判定肉牛PLAG1基因Indel位点的基因型，从而将不同肉牛个体分为缺失型、正常型或杂合型；
所述的引物对P1为：
上游引物F1：5'-TCCGAACAACAGGTGAGGGAGAAAT-3'
下游引物R1：5'-CCACTTCAGGGGTGCTCTAGGTTTG-3'。
所述的PLAG1基因的插入/缺失位点位于牛PLAG1基因参考序列AC-000171.1的25020872-25020890位，共19bp。
所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果判定肉牛PLAG1基因Indel位点的基因型具体为：正常型表现为142bp的一条条带；杂合型表现为142bp和123bp的两条条带；缺失型表现为123bp的一条条带。
所述的PCR扩增采用的反应体系为：10ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L的引物对P1所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×Taq PCR StarMix 5μL和ddH2O 3μL。
所述的PCR扩增采用的反应程序为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；3)72℃延伸10min。
所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
上述检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法在肉牛分子标记辅助选择育种中的应用。
在肉牛(例如，郏县红牛)中，Indel标记为正常型(Normal)或杂合型(Median)的个体比缺失型(Loss)个体在生长性状上更优。
所述生长性状为尻长、腰角宽、胸深、坐骨端宽、胸围或荐高。
一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的试剂盒，包括用于PCR扩增肉牛插入/缺失(Indel)位点的引物对，该引物对为上述引物对P1。
本发明的有益效果体现在：
本发明根据发现于牛PLAG1基因的参考序列Chr 14:25020872-25020890区域的插入/缺失变异，以待测肉牛个体的基因组DNA为模板，利用PCR扩增获得PLAG1基因部分片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果即可将不同个体分为缺失型、正常型或杂合型。根据对上述区域内插入/缺失多态性的检测及其与肉牛(例如，郏县红牛)的重要生长性状的关联分析。表明该插入/缺失多态性位点可作为分子育种中肉牛生长性状选择的分子标记。同时，本发明方法与STR(short tandemrepeats)、SNP标记检测方法相比，具有准确性高、稳定性好的优点，同时避免了由于特异性和复杂性等各种原因而导致的后续结果分析不准确。
附图说明
图1为郏县红牛PLAG1基因上Indel位点(参考序列AC-000171.1的25020872-25020890位)PCR扩增片段的电泳图；图中最右边泳道为Marker，其余三个泳道为不同郏县红牛个体扩增结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。
本发明利用PCR对郏县红牛PLAG1基因的Indel标记进行检测并用于分子育种，通常包括以下步骤：
(1)利用NCBI数据库找到PLAG1基因序列，再用Primer5软件进行引物设计，并用PCR检测引物；
(2)采用普通PCR技术和琼脂糖凝胶电泳检测候选位点在群体中的分型情况，对不同个体进行分型标记；
(3)利用SPSS 20.0软件将不同分型类型与牛生长性状进行关联分析；
(4)根据不同类型进行生长性状优异的牛选育。
1、牛样本采集
本发明具体以190头郏县红牛作为检测对象，其中190头郏县红牛的血样样本采集自河南省平顶山市郏县红牛繁育中心及各村镇(采样时间：2012年8月)。
2、血样DNA的提取
①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。
②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。
③加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。
④将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。
⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。
⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。
⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。
⑧4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
⑨4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。
⑩干燥后的DNA溶液中加入80～100μL的TE溶解，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。
通过对不同牛种群的实验，本发明发现了位于牛PLAG1基因序列(参考序列：GenBank Accession No.AC-000171.1的25020872-25020890位区域)的内的一个Indel位点。
3、目标序列的扩增
以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛PLAG1基因序列(GenBankAccession No.AC-000171.1)为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR引物，PCR反应体系如表1所示，PCR反应程序如表2所示。
表1.PCR反应体系
Figure BDA0001493943860000051
表2.PCR反应程序(P1)
Figure BDA0001493943860000052
参见图1，牛为二倍体动物，扩增所得片段经浓度为3％的琼脂糖凝胶电泳分析，在琼脂糖凝胶电泳结果中，正常型(Normal)表现为142bp的一条条带；杂合型(Median)表现为142bp和123bp的两条条带；缺失型(Loss)表现为123bp的一条条带。
4、郏县红牛PLAG1基因Indel对生长性状的关联性分析
生产数据：体高、体长、十字部高、胸宽、尻长、腰角宽、胸深、坐骨端宽、胸围、荐高。
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 20软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：
Yijk＝u+Ai+Indelj+eijk
其中：Yijk为性状观察值，u为总体均值，Ai为第i头个体的年龄，Indelj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以平均值±标准误差形式表示。
表3.郏县红牛PLAG1基因Indel与生长性状的关联性分析
Figure BDA0001493943860000061
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。*P<0.05。括号里面的数值表示各种类型的频率。
关联分析结果表明(见表3)：在肉牛，例如郏县红牛中正常型个体和杂合型个体比缺失型个体在生长性状上更优。说明PLAG1基因的Indel位点(参考序列AC-000171.1的25020872-25020890位)可以作为一个提高郏县红牛生长性状的候选分子遗传标记。
5、上述Indel标记在牛选育中的应用
以确定的Indel标记作为候选分子遗传标记，通过对不同郏县红牛个体在Indel标记处的基因型进行检测，从而对郏县红牛进行分子标记辅助选择，加快郏县红牛品种改良的选育进程。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
tccgaacaac aggtgaggga gaaat 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ccacttcagg ggtgctctag gtttg 25

Claims (9)

1.一种检测郏县红牛PLAG1基因Indel标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以郏县红牛的基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增获得包含插入/缺失位点的郏县红牛PLAG1基因部分片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果将不同肉牛个体分为缺失型、正常型或杂合型；
所述的引物对P1为：
上游引物F1：5'-TCCGAACAACAGGTGAGGGAGAAAT-3'
下游引物R1：5'-CCACTTCAGGGGTGCTCTAGGTTTG-3'；
所述的正常型在琼脂糖凝胶电泳结果中表现为142bp的一条条带；杂合型表现为142bp和123bp的两条条带；缺失型表现为123bp的一条条带；
在郏县红牛中，正常型或杂合型的个体比缺失型个体在生长性状上更优。
2.根据权利要求1所述一种检测郏县红牛PLAG1基因Indel标记的方法，其特征在于：所述的插入/缺失位点位于牛PLAG1基因参考序列AC 000171.1的25020872-25020890位。
3.根据权利要求1所述一种检测郏县红牛PLAG1基因Indel标记的方法，其特征在于：所述的PCR扩增采用的反应体系包括10ng/μL模板DNA 1μL及10μmol/L的引物对P1所对应的上、下游引物各0.5μL。
4.根据权利要求1所述一种检测郏县红牛PLAG1基因Indel标记的方法，其特征在于：所述的PCR扩增采用的反应程序为：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；3)72℃延伸10min。
5.根据权利要求1所述一种检测郏县红牛PLAG1基因Indel标记的方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
6.如权利要求1所述的检测郏县红牛PLAG1基因Indel标记的方法在肉牛分子标记辅助选择育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：在郏县红牛中，正常型或杂合型的个体比缺失型个体在生长性状上更优。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的生长性状为尻长、腰角宽、胸深、坐骨端宽、胸围或荐高。
9.一种检测郏县红牛PLAG1基因Indel标记的试剂盒，其特征在于：包括用于PCR扩增肉牛插入/缺失位点的引物对P1，所述的引物对P1为：
上游引物F1：5'-TCCGAACAACAGGTGAGGGAGAAAT-3'
下游引物R1：5'-CCACTTCAGGGGTGCTCTAGGTTTG-3'。
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