CN109055578B - 一种plag1基因snp标记辅助快速检测黄牛生长性状的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PLAG1基因SNP标记辅助快速检测黄牛生长性状的方法及其应用:以待测黄牛全基因组DNA为模板,PCR扩增黄牛PLAG1基因的部分片段;对扩增片段酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,实现对黄牛PLAG1基因第48308位为C>T的碱基多态性位点的检测;关联分析确定TC和CC基因型与黄牛生长性状密切相关,可作为分子遗传标记用于黄牛分子标记辅助选择育种中,从而加快建立遗传资源优良的黄牛种群。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种黄牛PLAG1基因单核苷酸多态性(SNP)的检测方法、检测试剂盒及其在黄牛分子育种中的应用。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander提出的一类遗传标记系统,就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的变化而引起的多态性,主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs,基因编码区内的SNPs(cSNPs)比较少,因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5,但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义,因此倍受关注。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。
分子育种,即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS),是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择,进而实现对畜禽的综合性状进行品种改良,它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法进行新品种选育。在畜禽育种中,通过与生长性状密切相关,并且紧密连锁的DNA标记的选择,达到早期选种和提高育种值准确性的目的,从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。近年来发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法,最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等。
多形性腺瘤基因(pleomorphic adenoma gene,PLAG)家族作为锌指蛋白的新亚科,包括PLAG1、PLAGL1和PLAGL2 3个成员(Kas,1997),三者在结构上高度同源,但各自具有不同的功能。PLAG家族3种蛋白可识别特定的DNA序列,因其N端的DNA结合域高度同源,而C端具有反式激活的功能域。PLAG家族蛋白虽然在结构上高度同源,但它们与DNA的结合能力导致它们的功能不同。PLAG1基因是最常见的存在于唾液腺的多形性腺瘤中的突变基因,它的作用与抑制基因p53相似,可调节细胞周期和细胞凋亡,并且与新生婴儿短暂性的糖尿病有一定关系。PLAGL1基因似乎起着抑制肿瘤抑制因子的作用,发现在乳腺和垂体肿瘤中发生突变,调节细胞凋亡和G1细胞周期停滞。PLAG1基因敲除小鼠表现出生长阻止的侏儒症状。已知的PLAG1基因的不同基因型影响IGF2的转录水平,PLAG1与IGF2第3启动子结合并激活转录,促进IGF2的转录表达,而IGF2在调节肌肉细胞的生长发育过程中具有重要作用,目前尚未见到SNP与PLAG1功能相关性的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PLAG1基因SNP标记辅助快速检测黄牛生长性状的方法及其应用,通过对黄牛PLAG1基因上与经济性状关联的SNP进行检测,加快具有优质经济性状的黄牛种群的建立。
为达到上述目的,本发明采用了以下技术方案:
一种黄牛PLAG1基因SNP的检测方法,包括以下步骤:以待测黄牛(例如,皮南牛)全基因组DNA为模板,以引物对P为引物,通过PCR扩增黄牛PLAG1基因的部分片段,对PCR扩增得到的片段用限制性内切酶SacⅡ进行酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳;根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛PLAG1基因中第48308位(参考序列为AC_000170.1)SNP位点的基因型。
优选的,所述引物对P为:
上游引物:5’-CCTTTGCCTGTTGCTTTCCC-3’;
下游引物:5’-GCGCGTATCAGTCAGGACAT-3’。
优选的,所述PCR扩增的反应程序为:95℃预变性4~5min;94℃变性30s,64.5℃退火30s,72℃延伸80s,34个循环;72℃延伸10min。
优选的,所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0%的琼脂糖凝胶。
优选的,所述SNP位点的基因型中,CC基因型经过电泳表现为502bp和126bp两个条带,TT基因型表现为628bp一个条带,TC基因型表现为502bp、126bp及628bp三个条带。
一种黄牛PLAG1基因SNP的检测试剂盒,包括上述引物对P。
上述黄牛PLAG1基因SNP的检测方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的,所述SNP位点的TC、CC基因型可作为皮南牛生长性状的DNA标记。
优选的,所述生长性状选自体高、十字部高、体斜长和胸围中的一种或多种。
本发明的有益效果体现在:
本发明根据已公布牛PLAGl基因的序列设计引物,分别以2个黄牛品种的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,针对PLAGl基因第48308位存在的SNP,在进行PCR扩增后,通过酶切及琼脂糖凝胶电泳,能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。通过将PLAG1基因的第48308位SNP位点与黄牛部分生长性状进行关联分析,发现其基因型对黄牛(例如,皮南牛)的体高、十字部高、胸围等有显著影响(P<0.05),使得PLAG1基因的SNP检测结果可以用于黄牛生长性状的标记辅助选择育种中,从而快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
附图说明
图1为PCR扩增产物片段的琼脂糖凝胶电泳图,其中:泳道P1、P2、P3分别代表不同黄牛个体的PCR扩增产物;M为Marker I,条带自下而上分别为100、200、300、400、500,及600bp。
图2为PCR扩增产物混合测序结果图,其中:箭头所指处为位于牛PLAG1基因参考序列AC_000170.1第48308位(C>T单碱基突变),自上至下分别为CC、TT和TC基因型的测序结果。
图3为PCR扩增产物酶切后琼脂糖凝胶电泳图,其中:M为Marker I,条带自下而上分别为400、500,及600bp。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明,所述实施例是对本发明的解释而不是限定。
本发明首先根据NCBI公布的PLAG1基因序列设计引物,分别以2个黄牛品种的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,混合PCR产物并对其测序。然后,进行测序图分析和序列比对,筛查出SNP位点;其次,对待测黄牛群体进行多态位点的PCR-RFLP检测;最后,根据检测到的基因型,进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析,筛选出与黄牛生长性状密切相关的分子标记。
I地方黄牛品种PLAG1基因部分DNA序列的克隆和SNP筛查
1、黄牛样本采集
本发明具体以2个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象,具体的样本采集情况见表1:
表1.黄牛样本的采集
品种 | 样品数 | 样品名称 | 采集地 | 采样方式 | 采集时间 |
皮南牛 | 203 | 血样 | 河南省南阳市新野县 | 颈静脉采血 | 2016年1月 |
吉安牛 | 74 | 血样 | 江西省吉安市泰和县 | 颈静脉采血 | 2014年10月 |
2、血样中基因组DNA的提取
参考文献Sambrock et al(2002)方法。
3、扩增引物设计
以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛PLAG1基因序列(GenBank Accession No.AC_000170.1)为参考序列,利用Primer 5.0设计PCR引物对P,其引物序列如下(引物设计完成时间2017年8月):
上游引物:5’-CCTTTGCCTGTTGCTTTCCC-3’;
下游引物:5’-GCGCGTATCAGTCAGGACAT-3’;
该引物对P扩增了黄牛PLAG1基因第14内含子区域。
4、PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法,即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数,算出各种反应组分的总量,加入到1个1.5mL离心管中,充分混匀后瞬时离心,再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中,然后加入提取的基因组DNA作为模板,再瞬时离心后进行PCR扩增;PCR反应体系的组成见表2:
表2.PCR反应体系
PCR反应程序:
5、PCR产物测序
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳,然后进行PCR产物的切胶回收和测序。把以上2个品种PCR扩增产物混合后送生工生物工程有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析发现如图2中的TC双峰,筛查到了黄牛PLAG1基因的1个SNP位点,位于黄牛PLAG1基因对应于参考序列的第48308位。
其中,由于突变位点前基因序列中存在大量T碱基,因此通过下游引物反向测序,原基因序列为TTCTCCGCGGATGGACCCAA(C为突变位点,C>T突变),反向测序基因序列应为TTGGGTCCATCCGCGGAGAA(G为突变位点,G>A突变)。
II、黄牛PLAG1基因多态性的PCR-RFLP检测
1、PCR反应条件
PCR扩增体系和反应条件参照上述第I部分,PCR扩增产物的3%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,可以清晰的看到628bp的条带。
2、PCR-RFLP检测
对于PCR扩增后的产物用限制性内切酶SacⅡ在37℃水浴中酶切7~8小时,酶切后进行3%琼脂糖凝胶电泳,然后进行PCR产物的切胶回收和测序验证。
其中,电泳条件为:300V电压下电泳5min,然后200V电压下电泳2.5h,银染检测电泳结果,用Bio-RAD凝胶成像分析系统照相分析,并记录其基因型。
由于黄牛为二倍体动物,当发生突变时,可形成不同的基因型,可以通过酶切、电泳进行判别,如图3所示,根据条带的带型能够将三种基因型(CC、TC、TT)区分开(与测序结果一致),即CC基因型为502bp和126bp两个条带(126bp条带在图3中未显示),TT基因型(突变纯合基因型)为628bp一个条带,TC基因型为502bp、126bp及628bp三个条带,从而检测位点多态性。
III、黄牛PLAG1基因SNP位点基因效应的关联分析
1、群体中多态性检测
利用上述的SNP检测方法对203头皮南牛及74头吉安牛分别判定基因型。
2、SNP位点的频率统计分析
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率:
PYY=NYY/N
其中,PYY代表某一位点的YY基因型频率,NYY表示群体中具有YY基因型的个体数;N为检测群体的个体总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率:
Py=(2Nyy+Nyy1+Nyy2+…+Nyyi…+Nyyn)/2N
其中,Py表示等位基因y频率,Nyy表示群体中具有yy基因型的个体数量,Nyyi表示群体中具有yyi基因型个体数量,y1-yn为等位基因y的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。
表3.黄牛种群中PLAG1基因多态位点的基因型和等位基因频率
3、基因效应的关联分析
对性状记录比较全面的皮南牛的不同基因型个体与其生长性状的相关性进行了显著性检验(见表4)。
1)测定的体尺数据主要包括:体高(24月龄)、体斜长、十字部高、胸围、腰角宽、尻长等性状。
2)关联分析一般线性的模型:调用SPSS 17.0软件一般线性模型GLM(Generallinear models procedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。统计模型如下:
Yijk=μ+Ai+Tj+Eijk,
其中:Yijk:个体表型记录;μ:总体均数;Ai:年龄效应;Tj:基因型效应;Eijk:随即误差。
从表4可以看出基因型为TC、CC的皮南牛个体在体高、十字部高、体斜长和胸围上显著差异于基因型为TT的个体(P<0.05)。在这几项指标中,TC、CC基因型的值均高于TT基因型。因此,黄牛PLAG1基因单核苷酸多态位点(参考序列AC_000170.1第48308位)中TC、CC为优势基因型,可以作为DNA标记。由此,在育种工作中,应当选择黄牛PLAG1基因为TC、CC基因型的个体,从而加快具有优质经济性状的黄牛种群的建立。
表4.皮南牛PLAG1基因不同基因型之间最小二乘均值差异显著性检验
注:表中数值为平均值±标准误;在同一行中标有a、b、c为差异显著水平P<0.05
本发明的优点是:首次提供了在中国黄牛群体的PLAG1基因中存在的新的SNP位点,并且阐明了该位点的多态性与黄牛生长性状的相关性。本发明检测方法简单、成本低,检测结果直接、可靠,适用于对PLAG1基因的大规模的筛查和诊断。
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种PLAG1基因SNP标记辅助快速检测黄牛生长性状的方法及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cctttgcctg ttgctttccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcgcgtatca gtcaggacat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> AC_000170.1
<400> 3
ttctccgcgg atggacccaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> AC_000170.1
<400>4
ttgggtccat ccgcggagaa 20
Claims (4)
1.一种黄牛PLAG1基因SNP的检测方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用,其特征在于:
以待测黄牛基因组DNA为模板,通过PCR扩增黄牛PLAG1基因的部分片段,对PCR扩增得到的片段用限制性内切酶SacⅡ进行酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳;根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛PLAG1基因参考序列AC_000170.1中第48308位SNP位点的基因型;
所述SNP位点的基因型的电泳结果为:CC基因型表现为502bp和126bp两个条带,TT基因型表现为628bp一个条带,TC基因型表现为502bp、126bp及628bp三个条带;
所述SNP位点的TC、CC基因型可作为皮南牛生长性状的DNA标记;
所述生长性状选自体高、十字部高、体斜长和胸围中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述PCR扩增采用的引物对为:
上游引物:5’- CCTTTGCCTGTTGCTTTCCC -3’;
下游引物:5’- GCGCGTATCAGTCAGGACAT -3’。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述PCR扩增的反应程序为:95℃预变性4~5 min;94℃变性30 s,64.5℃退火30 s,72℃延伸80 s,34个循环;72℃延伸10 min。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0%的琼脂糖凝胶。
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A novel SNP of PLAG1 gene and its association with growth traits in Chinese cattle;Jia-Lin Zhong et al;《Gene》;20181218;第689卷;第166-171页 * |
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中国三个黄牛品种ASB-3基因多态性及其遗传效应与mRNA表达研究;阎建宇;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)农业科技辑》;20161115(第11期);D050-23 * |
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