CN112899376B - 一种foxo1基因snp标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种FOXO1基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用。具体技术方案为：一种影响藏鸡性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于藏鸡FOXO1基因对参考序列Genbank Accession No.NC_006088.5的第3187位点的碱基处，突变碱基为T或G。本发明首次发现，藏鸡FOXO1基因第3187位处，如果发生T‑G突变，会直接关系到是否出现BTSI‑V2酶切位点；且GT基因型的个体，各方面的经济性状均有明显提升。因此，利用该突变位点可简单、快速、准确、高效地检测藏鸡的经济性状，并可直接应用到藏鸡选育中，以提升藏鸡的经济性能。

Description

一种FOXO1基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种FOXO1基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA序列由于单个核苷酸的变化而引起的多态性，主要包括碱基的转换、颠换、插入和缺失等。SNP属于第三代分子标记，具有高密度、和易于检测等优点，已广泛应用于生物遗传多样性及分子遗传育种研究。
分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection，MAS)，是借助DNA分子标记对育种材料进行选择，进而实现对畜禽性状的品种改良。在畜禽育种中，如果选出与经济性状密切相关的DNA标记，则有望提高选种准确性，提高选育效率和效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种FOXO1基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种影响藏鸡性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于藏鸡FOXO1基因对参考序列(Genbank Accession No.NC_006088.5)的第3187位点的碱基处，突变碱基为T或G。
优选的，所述SNP分子标记的基因型为GG、GT或TT中的任意一种。
相应的，所述SNP分子标记在检测藏鸡经济性状或藏鸡选育中的应用。
相应的，包含所述SNP分子标记的试剂盒或检测试纸或检测试剂。
优选的，所述试剂盒或检测试纸或检测试剂中至少包括用于扩增所述SNP分子标记的特异性引物对。
优选的，所述引物对包括：
上游引物：5'-CCAAAATCCCTGTTGAGCA-3'；
下游引物：5'-AATATGCCCATCGCAAAGG-3'。
相应的，所述试剂盒或检测试纸或检测试剂在检测藏鸡性状中的应用。
优选的，包括如下步骤：
(1)获取待检测藏鸡的血液；
(2)从血液中提取基因组DNA；
(3)将基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(4)将PCR扩增产物进行酶切、电泳、分析，确定待测藏鸡的所述SNP分子标记的基因型。
优选的，所述PCR扩增的反应体系包括：2×Buffer、扩增所述SNP分子标记的特异性引物对、Taq DNA聚合酶、DNA模板。
优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；再进行36个如下循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后，再72℃延伸10min。
本发明具有以下有益效果：本发明首次发现，藏鸡FOXO1基因第3187位处，如果发生T-G突变，会直接关系到是否出现BTSI-V2酶切位点；且GT基因型的个体，各方面的经济性状均有明显提升。因此，利用该突变位点可简单、快速、准确、高效地检测藏鸡的经济性状，并可直接应用到藏鸡选育中，以提升藏鸡的经济性能。
附图说明
图1为藏鸡三个品系样本的FOXO1基因第3187位点测序峰图，框内为突变位点；
图2为藏鸡FOXO1基因酶切电泳结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种藏鸡FOXO1基因SNP标记检测经济性状的方法。该检测方法主要针对第3187位T到G的颠换突变进行。PCR扩增藏鸡FOXO1基因内含子区该处如果没有发生对应突变，则没有BTSI-V2酶切位点，当由T突变成G时，形成BTSI-V2酶切位点，则可被BTSI-V2酶切。从而可简单、快速、准确、高效地检测藏鸡个体的SNP，并应用到藏鸡的分子育种上。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：藏鸡FOXO1基因部分DNA序列的克隆和SNP筛查1、本发明以藏鸡三个品系的种群作为检测对象，样本采集情况如表1所示。每个样本单独进行检测，例如阿藏1系的60个样本，每个样品都单独检测。
表1样本采集情况对照表
Figure GDA0003634265750000031
2、参考文献Sambrock et al(2002)方法提取藏鸡血液样本基因组DNA。以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的鸡FOXO1基因序列(Genbank AccessionNo.NC_006088.5)为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR引物对P，引物序列具体如下：
上游引物：5'-CCAAAATCCCTGTTGAGCA-3'；
下游引物：5'-AATATGCCCATCGCAAAGG-3'。
所述引物序列扩增了藏鸡FOXO1基因第1内含子区域。再进行PCR扩增。采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，计算得出各种反应组分的总量，加入1.5mL离心管中，充分混匀后离心，再分装到每个PCR管中，然后加入模板DNA，再离心后进行PCR扩增，PCR反应体系如表2所示。所述DNA模板为表1中各藏鸡个体样品的基因组DNA。
表2PCR反应体系
体系成分 体积(μL)
2xBuffer(内含Mg<sup>2+</sup>、dNTPs等) 10.0
上游引物(10μmol/L) 0.5
下游引物(10μmol/L) 0.5
Taq DNA聚合酶(2.0U/μL) 0.5
DNA模板(50ng/μL) 1
灭菌超纯水(H<sub>2</sub>O) 7.5
PCR反应程序为：95℃预变性5min。进行36个如下循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s。循环结束后，再72℃延伸10min。
将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行切胶回收和测序。把上述藏鸡三个品系样本PCR扩增产物混合后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析发现如图1中的GT双峰，从而筛查到藏鸡FOXO1基因的1个SNP位点，位于藏鸡FOXO1基因对参考序列(Genbank Accession No.NC_006088.5)的第3187位。
实施例二：藏鸡FOXO1基因多态性的PCR-RFLP检测
1、PCR反应。PCR产物扩增体系和反应条件参照实施例一进行，PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱(图2)可以清晰看到414bp的条带。图2中，泳道1和3为GG基因型，表现为307bp和97bp，泳道2和5为GT基因型，表现为414bp、307bp和97bp；泳道4为TT基因型，表现为414bp；泳道6为MarkerⅡ，表现为100bp、300bp、500bp、700bp、900bp和1200bp。
2、PCR-RFLP检测。将步骤1获得的PCR扩增产物利用限制性内切酶BTSI-V2在37℃水浴中酶切6～8小时，然后进行2.5％琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为：点样后120V电压电泳30min，待不同大小的DNA片段清晰分离后，在Bio-RAD凝胶成像分析系统拍照分析，并记录每个样本的基因型。
结果如图2所示，根据条带的带型能够将三种基因型(GG、GT、TT)明显区分，GG基因型为307bp和97bp两条条带，GT基因型为414bp、307bp和97bp三条条带(GT的97bp条带较浅)，TT基因型为414bp一条条带。
实施例三：藏鸡FOXO1基因SNP位点效应的关联分析
1、群体中多态性检测。参照实施例一的SNP检测方法对表1中180只藏鸡分别判定基因型。
随后进行SNP位点的频率统计分析。基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：PAA＝NAA/N。其中，PAA代表某一位点的AA基因型频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的个体总数量。基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率：PA＝(2NAA+NAA1+NAA2+…+NAAi+…+NAAn)/2N。其中PA为等位基因A的频率，NAA为群体中具有AA基因型的个体数，NAAi为群体中具有AAi基因型的个体数，i为自然数，A1、A2……An为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。
表3藏鸡群体中FOXO1基因多态位点的基因型和等位基因频率
Figure GDA0003634265750000051
2、基因效应的关联分析。对藏鸡各品系不同基因型的个体与其经济性状的相关性进行了显著性检验。测定的经济性状主要包括：体斜长、龙骨长、胸深、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重等性状。关联分析的一般线性模型：SPSS 26.0软件中的一般线性模型GLM(General linear models procedure)对各基因型对经济性状的影响进行显著性检验。统计模型为：Yijkl＝μ+Si+Gj+Tl+Eijkl。其中，Yijkl为个体表型值，μ为总体均值，Si为品系效应，Gj为性别效应，Tl为基因型效应，Eijkl为随机误差。结果如表4所示。表4中各数值为平均值±标准误；在同一行中标有A、B、C为差异极显著(P＜0.01),标有a、b、c为差异显著(0.01＜P＜0.05)。
表4藏鸡FOXO1基因第3187位SNP与其经济性状的关联分析
Figure GDA0003634265750000061
从表4中可以看出：藏鸡FOXO1基因第3187位的SNP位点与其经济性状显著相关，3种基因型在体斜长、龙骨长、胸深、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重上存在显著差异。并且在三个品系中，GT基因型均为优势基因型，对藏鸡的体斜长、龙骨长、胸深、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重均有显著地提高，证明第3187位的SNP突变可作为一个提高藏鸡经济性状的分子标记。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 西南民族大学
阿坝藏族羌族自治州畜牧科学技术研究所
<120> 一种FOXO1基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 上游引物(扩增SNP分子标记)
<400> 1
ccaaaatccc tgttgagca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 下游引物(扩增SNP分子标记)
<400> 2
aatatgccca tcgcaaagg 19

Claims (6)

1.一种影响藏鸡性状的SNP分子标记在检测藏鸡经济性状或藏鸡选育中的应用，其特征在于：所述藏鸡来自阿藏1系、阿藏2系或阿藏3系，所述SNP分子标记位于藏鸡FOXO1基因第3187位点的碱基处，突变碱基为T或G，其中，FOXO1基因的参考序列为Genbank AccessionNo.NC_006088.5；所述藏鸡经济性状或所述藏鸡选育的指标为：体斜长、龙骨长、胸深、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SNP分子标记的基因型为GG、GT或TT中的任意一种。
3.利用权利要求1或2所述SNP分子标记制备的试剂盒或检测试纸或检测试剂在检测藏鸡性状中的应用，其特征在于：所述藏鸡来自阿藏1系、阿藏2系或阿藏3系，所述试剂盒或检测试纸或检测试剂包括用于扩增所述SNP分子标记的特异性引物，还包括BTSI-V2限制性内切酶，所述藏鸡性状为：体斜长、龙骨长、胸深、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获取待检测藏鸡的血液；
(2)从血液中提取基因组DNA；
(3)利用扩增所述SNP分子标记的特异性引物将基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(4)将PCR扩增产物进行酶切、电泳、分析，确定待测藏鸡的所述SNP分子标记的基因型，所述酶切利用所述BTSI-V2限制性内切酶进行。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系包括：2×Buffer、扩增所述SNP分子标记的特异性引物对、Taq DNA聚合酶、DNA模板。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；再进行36个如下循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后，再72℃延伸10min。
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