CN101967479A

CN101967479A - 与鸡后期体重相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN101967479A
Application number: CN2010105214047A
Authority: CN
Inventors: 张细权; 谢亮; 聂庆华; 贾晓鹿
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2011-02-09

Abstract

本发明公开了与鸡后期体重相关的分子标记及其应用。本发明与鸡后期体重相关的分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO:1~4所示，其中，SEQIDNO:1、2和4的第501bp处有一个T→C突变，SEQIDNO:3的第501bp处有一个G→A突变。本发明分子标记与鸡后期(7周龄以后)体重呈显著相关，且该4个分子标记位点连锁紧密。本发明分子标记为鸡后期体重的筛选提供了新的方法。

Description

与鸡后期体重相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及家禽分子标记制备领域，具体涉及与鸡后期体重相关的分子标记及其应用。

背景技术

畜禽生长发育是一项极其复杂的生命活动，受到许多基因的控制，如IGFs轴相关基因和垂体-下丘脑生长轴相关基因等。关于鸡的生长发育，科学家们进行了许多卓越的工作。也取得了很大的成果，到目前为止，鸡QTL数据库中与各生产性状相关的QTLs共有1,863个，而其中与鸡生长性状相关的QTLs就达到了1,162个（http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/GG/summary）。大部分生长性状已经定位到了不同染色体的不同区域，但这些QTLs的跨度通常都很大，有的甚至包括整条染色体，这对揭示生长性状的遗传基础还是远远不够的。虽然已经进行了大量的研究，但畜禽生长发育的分子遗传机理仍然不是很清楚。

近几十年来，检测特定表型性状与基因变异关系的关联研究一直是动物遗传育种研究的重要内容，也取得了丰硕的成果。比较典型的例子就是性连锁矮小鸡（sex-linked dwarf chicken）的矮小表型是由生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）基因中的单碱基突变或是3′端1773bp缺失引起，矮小鸡的胫长比正常鸡的短约三分之一，但并不对其生产性能产生不利影响（欧阳建华，2006）。矮小基因已经成功运用于生产实践当中，如中国农业大学成功培育了节粮小型褐壳蛋鸡——“农大褐3号”（宁中华等，1996）。然而，以前的关联研究只能分析少数基因的少数变异对疾病或性状的影响，主要集中于候选基因研究以及用微卫星进行相关性状的数量性状座位（quantitative trait loci，QTLs）定位，只能对某个或少数几个基因进行研究，无法对影响特定表型性状的基因组区域进行综合分析，用微卫星或少量的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）进行QTLs定位，定位结果往往有很大的置信区间，获得的QTLs图谱清晰度很差，不能满足精确定位致因突变或基因（causative mutation & gene）的要求能够检测分布于整个基因组而不是局限于特定基因内的成千上万甚至百万个SNPs与某一性状的关联，该方法比传统方法更适合鉴定引起表型差异的普通SNPs，中等或大的，甚至是小的遗传效应都能被检测到（McCarthy et al，2008；Benyamin et al，2009）。

鸡FOXO1基因的研究很少，但在猪、人和鼠等哺乳动物中的研究很多。FOXO1是一种FOXO 叉头型转录因子，在禁食或严重的糖尿病时表达显著上调，FOXO1基因超表达转基因小鼠与正常小鼠相比较，体重更轻，骨骼肌总量更少，而且肌肉颜色更白（Kamei et al，2004）。对FOXO1基因超表达转基因小鼠肌纤维的分析表明超表达引起I型（红肌）和II型（白肌）肌纤维显著变细，并显著减少骨骼肌中I型肌纤维的数量，FOXO1基因负调控骨骼肌总量和I型肌纤维相关基因的表达（Kamei et al，2004）。最新的研究表明用皮质类固醇（corticosteroid）处理的小鼠与空白对照小鼠相比FOXO1基因随给药时间的增加表达量逐步升高，而体重明显下降，肌肉中胰岛素样生长因子I（Insulin-like growth factor-I，IGF-I）基因mRNA表达也显著降低（Cho et al，2010）。猪FOXO1基因研究表明该基因参与脂肪代谢并是前脂肪细胞分化的负调控因子，而且FOXO1基因表达上调能降低MyoD 基因的表达，进而负调控肌肉的发育和骨骼肌的量（杨燕军等，2008a；Pang et al，2009）。在以Ⅰ型纤维为主的比目鱼肌中表达丰度显著高于以Ⅱb 型纤维为主的趾长伸肌中的表达丰度，表明FOXO1基因与Ⅰ型肌纤维的含量成反比（杨燕军等，2008b），与人类的研究结果相类似。

发明内容

本发明的目的在于根据现有鸡后期体重筛选中存在的困难，提供一种与鸡后期体重相关的分子标记。

本发明另一目的在于提供上述与鸡后期体重相关的分子标记的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

与鸡后期体重相关的分子标记，暂命名为GGaluGA055291、rs13973515、GGaluGA055359和GGaluGA055379，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~4所示，其中，SEQ ID NO:1、2和4的第501bp处有一个T→C突变，SEQ ID NO:3的第501bp处有一个G→A突变。

本发明采用Illumina公司（Illumina Inc.，美国圣地亚哥）的60K Infinium II chicken SNP Beadchip芯片对华南农业大学杏花鸡×隐性白羽洛克鸡全同胞资源群进行状GWAS研究，发现GGaluGA055291、rs13973515、GGaluGA055359和GGaluGA055379位点及鸡FoxO1A基因与鸡的后期（7周龄以后）体重有重要影响，这四个位点与49日龄、56日龄、70日龄、77日龄、84日龄以及91日龄体重存在有极显著的相关（P < 2.04×10^-6）。

本发明与鸡后期体重相关的分子标记的扩增方法如下：

（1）从被检测鸡群血液样本中提取鸡基因组DNA；

（2）采用Illumina公司（Illumina Inc.，美国圣地亚哥）的60K Infinium II chicken SNP Beadchip芯片对华南农业大学杏花鸡×隐性白羽洛克鸡全同胞资源群进行基因分型。SNP芯片分型的原理是利用特异探针与目的DNA序列结合，然后进行单碱基延伸反应，再通过标记物与荧光基团的免疫结合, 将待检测SNP 位点的信息转换成可以用扫描仪检测的荧光信号。

检测出SNP位点，所设计得到引物序列为：

GGaluGA055291位点的扩增引物如SEQ ID NO:5~6所示；

rs13973515位点的扩增引物如SEQ ID NO: 7~8所示；

GGaluGA055359位点的扩增引物如SEQ ID NO: 9~10所示；

GGaluGA055379位点的扩增引物如SEQ ID NO: 11~12所示。

（3）根据荧光信号进行基因型的判定，直接得到检测样品的基因型。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明分子标记与鸡后期（7周龄以后）体重呈显著相关，且该4个分子标记位点连锁紧密。本发明分子标记为鸡后期体重的筛选提供了新的方法。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2为芯片分型结果展示图，其中，左边区域表示CC型或AA型个体；中间区域表示CT型或AG型个体；右边区域表示TT型或GG型个体；

图3为4个分子标记在群体中的不同基因型展示图，其中，1为GGaluGA055291位点、2为rs13973515位点、3为GGaluGA055359位点和4为GGaluGA055379位点。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

1、鸡血样的采集和DNA的提取：

各生长性状测定完成后，采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1 mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL 2%无菌EDTA（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝剂的1.5 mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-80℃保存备用。

基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法（奥斯泊 F等，1998）：

（1）取全血30 μL置于1.5 mL离心管，分别加入470 μL 1 × SET缓冲液、12.5 μL 20% SDS和6 μL10 mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；

（2）取出样本于1.5mL离心管，加入500 μL饱和苯酚，轻摇20 min，10,000 rpm离心10 min；

（3）取上清，再次加入500 μL饱和苯酚，轻摇20 min，10,000 rpm离心10 min；

（4）取上清，加入500 μL氯仿-异戊醇（23：1）轻摇20 min，10,000 rpm离心10 min；

（5）取上清，加入1 mL冰无水乙醇（-20℃），来回摇摆以沉淀DNA，10,000 rpm离心10 min后倒出乙醇；

（6）用1 mL 75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；

（7）待DNA完全干燥后加入300 μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；

（8）存放于-20℃冰箱中保存备用。

2、芯片分型

委托加拿大DNA LandMarker公司进行实验样本的Illumina芯片分型；

（1）待测样本基因组DNA与芯片微珠上位点特异的的探针退火复性；

（2）加入不同标记荧光的ddNTP后进行单碱基延伸反应，再通过标记物与荧光基团的免疫结合, 将待检测SNP 位点的信息转换成可以用扫描仪检测的荧光信号；

（3）利用专用软件GenomeStudio进行基因分型，将荧光信号转换成基因型。

3、基因型判定及关联分析

根据芯片的结果判定该位点在检测群体中的基因型。

实施例2

对GGaluGA055291、rs13973515、GGaluGA055359和GGaluGA055379位点不同基因型与鸡生长性状进行关联分析的检测应用。四个位点的分析结果如表1所示。由表1可以得到各位点对鸡后期（7周龄以后）体重的影响达到了极显著水平（P < 2.04×10^-6）。

表1 四个位点与鸡后期（7周龄以后）体重的关联分析

Figure 2010105214047100002DEST_PATH_IMAGE001

备注：1：数字形式为科学记数法。

Claims

1.与鸡后期体重相关的分子标记，其特征在于所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~4所示，其中，SEQ ID NO:1、2和4的第501bp处有一个T→C突变，SEQ ID NO:3的第501bp处有一个G→A突变。

2.根据权利要求1所述的与鸡后期体重相关的分子标记，其特征在于扩增所述分子标记如SEQ ID NO:1所示的引物如SEQ ID NO:5~6所示；扩增所述分子标记如SEQ ID NO:2所示的引物如SEQ ID NO:7~8所示；扩增所述分子标记如SEQ ID NO:3所示的引物如SEQ ID NO:9~10所示；扩增所述分子标记如SEQ ID NO:4所示的引物如SEQ ID NO:11~12所示。

3.权利要求1或2所述的与鸡后期体重相关的分子标记在鸡后期体重筛选中的应用。