CN105838798A

CN105838798A - 鸡mhc b-g座位全序列测定和snp检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105838798A
Application number: CN201610280765.4A
Authority: CN
Inventors: 屠云洁; 邹剑敏; 束婧婷; 章明; 单艳菊; 姬改革; 龚建森; 张笛
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2016-04-30
Filing date: 2016-04-30
Publication date: 2016-08-10

Abstract

本发明公开了鸡MHC B‑G座位全序列测定和SNP检测方法及试剂盒，属于生物技术领域。检测方法包括：（1）引物设计：设计鸡MHC B‑G座位全序列测定的特异性引物，特异性引物包括SEQ ID NO 1‑12；（2）DNA提取：从鸡全血中提取DNA；（3）PCR扩增；（4）琼脂糖胶电泳检测；（5）对目的片段进行克隆、测序；（6）SNP分析：所获序列用Clustalw软件进行比对，与Genbank基因序列进行比较，统计单倍型和单核苷酸多态性（SNP）。试剂盒，包括6对特异性引物信息SEQ ID NO 1‑12，灭菌双蒸水，dNTP，Taq酶，PCR扩增缓冲液。本发明为测定鸡MHC B‑G座位基因全序列，分析鸡MHC B‑G座位遗传多样性提供了技术平台。

Description

鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及MHC B-G座位全序列测定试剂盒及其SNP检测方法，本发明主要用于分析鸡MHC B-G座位全序列遗传多样性，属于生物技术领域。

背景技术

鸡MHC位于16号染色体上，又称为B复合体，分为2个区域，一个是含有典型MHC基因的BF/BL区域和决定红细胞抗原的BG区域，BF/BL区分别相当于哺乳动物基因的I类抗原和Ⅱ类抗原；B-G区编码产物又称Ⅳ类抗原，为禽类所特有；另一个是遗传不连锁的基因簇Y(Restriction fragment polymorphism-Rfp-)(Schierman and Nordskog，1961)。鸡MHCB-G座位全长6425bp，存在丰富的变异位点，获得MHC B-G座位全长序列，并进行SNP分析对于研究鸡免疫能力及群体遗传多样性具有重要意义。

MHC基因的变异可反映基因组水平的变异，通过MHC基因的变异分析，可有效地评估品种遗传多样性的水平。MHC基因的变异水平常常被认为是脊椎动物机体免疫系统识别外来寄生物(细菌、病毒、寄生虫等)能力的重要部分。因此，MHC基因被认为是群体遗传学和保护遗传学研究中最新的基因系统(Frangoulis et al.,1999；Jacob et al.,2000)。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是可遗传的变异中最常见的一种。本发明采用PCR扩增原理，克隆、测序，序列分析和同源性比较，并进行序列拼接，分析基因SNP位点。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种MHC B-G座位全序列测定试剂盒及SNP检测方法，其特征在于准确性高、快速、价格低廉。

本发明的第一个目的是提供一种MHC B-G座位全序列SNP检测方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：设计鸡MHC B-G座位全序列测定的特异性引物，特异性引物包括SEQID NO 1-12，SEQ ID NO 1-12见表1；

表1 MHC B-G座位引物信息

(2)DNA提取：从鸡全血中提取DNA；

(3)以步骤(2)提取的DNA进行PCR扩增，获得目的片段；MHC B-G座位特异性引物在梯度PCR仪上进行；

(4)PCR反应结束后，琼脂糖胶电泳检测反应是否成功，是否是目的片段；

(5)对目的片段进行克隆、测序

PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，使用胶回收试剂盒回收，连接到pMD18—T载体上，转化于DH5a大肠杆菌感受态细胞，涂布于Amp/X–gal-IPTG/LB平板上克隆，挑取单个白色菌落进行培养，挑选鉴定为阳性的克隆，送生物公司双向测序；

(6)SNP分析

通过chromas软件读取,通过双向重复测序进行校正，所获序列用Clustalw软件进行比对，与Genbank基因序列进行比较，统计单倍型和单核苷酸多态性(SNP)。

本发明中步骤(3)PCR反应条件设置见表2：

表2 PCR扩增反应程序

6对引物的退火温度55-60℃。

BG1引物扩增对应基因序列

TCATATTCTCCCCACACTTCTTCCCCATATTCTTTCCAAATCCTCTTCCCCATCTCCTCCACCGTCTCTTTCTCACAGTCCTTCCTCTCTCTCCCTAAATTCTTCCCCCCTCCTCTTCTCCAGCACAGATGGCCTTCACATCGGGCTGCAACCACCCCAGTTTCACCCTCCCCTGGAGGACCCTCCTGCCTTATCTCGTGGCTCTGCACCTCCTCCAGCTGGGATCAGGTAGGGGTCTGTGGGGCTGCTGTGCCTGGCACAGGTGTTGCTGTGCCGCTCCATGCCCCACATTAACACAGACACCATCTCACCATCTCTCCGTGCCCTTCTCATTGCCCAGCCCAGCTCACGGTGGTGGCACCGAGCCTCCGTGTCACTGCCAACGTGGGACAGGATGTTGTGTTGCGCTGCCACTTGTCCCCATGCAAGGATGCTCGGAGCTCAGACATCAGATGGATCCAGCAGCGGTCCTCTCGGCTTGTGCACCACTACCGAAATGGAGTGGACCTGGGGCAGATGGAGGAATATAAAGGGAGAACAGAACTGCTCAGGGATGGTCTCTCTGATGGAAACCTGGATTTGCGCATCACTGCCGTGACCTCCTCTGATAGTGGCTCATACAGCTGTGCTGTGCAAGATGGTGATGCCTATGCAGAAGCTGTGGTGAACCTGGAGGTGTCAGGTCAGTGGCTAGGGTGTCTAAGGATGGAGAGCTGATGGATCGCAGCCTTTGGAAGTGGTCAGGGCTGAACAGCTCCATGAGATGCTGGAATTGCAGTGGGCGCACGCTGTGATTTGGAGATGGGTCTGCATGGATGAGGTGGTTGGGTTGGGTTTCTGGGATGGGTTTCTCCATGGCTCAGTGGCAGTGGGCACACAATGCTGAGCAGCTCCTCCACCTGTGCCAATGTGGAGATGCTGCTATTGTGTGTCACTGCTCCCTGCTTGCTGCCCCTTCGGGTTCTGTGATCTCCAGAAGTCAAAGTCATGCTTGTCTACATAAGGCAATGGAAAAGGAACCCTTGTCCTGATGTTTTTTTCAGATCCCTTTTCCCAGATCATCCTTTACTGGACAGTGGCTCTGGCTGTGATCATCACACTTCTGGTTGGGTCATTTGTCGTCAATGTTTTTCTCCATAGAAAGAAAGGTAAGCTGACAGTGGAGGGGATGGAGCACAGGGAGGTGTTGTGCATGGACAGGGATGGTCGGGGTGGTGCTGAGCTCTGGTCCATGGAGGTACACAGGAGGAGGAACGGTGACTTTTCATGGGATTCCCAGTGCTCATTAAATAACATTTGCCTTTCTTTTTGGGAATAAAGGAAGGGGAAAAAGGATAGTGGTAAGGGTGGG。

BG2引物对应的基因片段序列

TGGGTCATTTGTCGTCAATGTTTTTCTCCATAGAAAGAAAGGTAAGCTGACAGTGGAGGGGATGGAGCACAGGGAGGTGTTGTGCATGGACAGGGATGGTCGGGGTGGTGCTGAGCTCTGGTCCATGGAGGTACACAGGAGGAGGAACGGTGACTTTTCATGGGATTCCCAGTGCTCATTAAATAACATTTGCCTTTCTTTTTGGGAATAAAGGAAGGGGAAAAAGGATAGTGGTAAGGGTGGGCAGATAGGAATGTGGCTGGACTGTGGGGCAGGTGGAAAGTCCAAACCCTCTGGAGAAGTCCCCACAAACCAAGCTGCCCTGCTGACCAGCTATTTCTCTGCTTTGTTTTCCAGTGGCACAGAGCAGAGAGCTGAGTGAGTCCTTCCAGCTCCTTCCACCACCAAAGTCCCTTTAATGGAACTGACAGCAGACTGCAGAGTGCTGGGTTATGCCGTGTGCTGGGGCCATGAGCTATGTTGAGGCTTTGGAATGTGTTGGGGTTGTGGGATGTACTGGGGTCGTGGGATGTGTCAATCCTGGCTGATTCACGTGGAAAAACCTTTCACAATCGGTTCCTTCCAGTTTGTTTAATTCCTTCTTGGGCCCAAAGTGGTCATTGGACTCCTCCCAGAAAAAAGGGTTTGGGGTCAGGGTGTGAGAGCTGATGGCATGGAAACGTGTCCCCTCTGACCATGCATTTCATTTGCTTCTATTTTGCAGAGAGAAAAGATGCAGAGTTGGGTAAGTCTCCTTCCCTAAAGCGAGGGAATTCAGGGTGTCCCCATGGCATCAGCCGTGGAATGAGCTGCTGTCCCCTCTGACCATGCACTGCTCTGCTCTTTCCTTTCCAGTGGAGAAAGCTGCAGCATTGGGTGAGTTATATTCCCCAAGCCAAAGTACTTTGGGTCTTCCCATTGGAAGTTATTTCCTCAGACCATCCTTTCTGTTGTGTTTGCTTTGGCATCATGTTAGTAAAATGCCTTCT。

BG3引物扩增对应基因序列

TGGGTCTTCCCATTGGAAGTTATTTCCTCAGACCATCCTTTCTGTTGTGTTTGCTTTGGCATCATGTTAGTAAAATGCCTTCTTGGGACCAAAGTGGTCATTGGCCACTTCCCAGAAAAAAAGATTTGGGGGCAGGGTGTGGGAGCTGATGGCATGGAAATTTGTCCCCTCTGACCATGCTTTTCCTTTGCTTCTTTTTGCAGAGAGAAAAGATGCAGAGTTGGGTAAGTCTCCTTCCCCACAGCGAGGGAATTCAGGGTTTCCCCATGGCGTTAGCCACGGGATGAGCAGCTGTCCTCTCTGACCATGCACTGCTCTGCTCTTTCTTTTCCAGCGGAACAAGCAGCGCTATCGAGTGAGTCTCCCCCTCCATTTTTATTATTTTTAAATGTTCAGCCTCCGGTAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCATACACTGACTCTGCTTTTCCTTTGCAGAGCAAAGAGATGCAATGTTGGGTGAGTCTCCCACCTGAAACCAAAGAGATTTGGGGTCTTCCCATGGGATCAGCCATGGGATGATAACCTGAACCTTCTCATCGTGCGTTTCTTATTTGTTCCTTTTGCAGAGAAACACGTTCTAAAACTGGGTGAGTCCTCACTCCCAAATTATAAAGCAAAGGGTTCTGCCTGTGTGAGCTGTGGGATCAGACGTTCCACTCATCATGCATTGCTTTTCTCTTTCTTTTTCAGAGGAAAAGACAGACGAAGTGGGTGAGTCTACATTCACTAAAGCAAAGAAATATGGGGTCTCCCATGAGATGACAAGCTGTCCCAAGAAATCATGTGGTGCTTTTTCTTGTCTTTTTATTTATTTATTTATTTATTTGCAGAGAATTGGAATTCAGTGCTGAGTAAGTTGCAGTCACTGAACTGAGGGAATGTGGGGTCTTCCTAAGGGACTGCGTAGGGGAGAAGTTCCCATGCACTGCTTTTCTCTTTCTTTTCCAGAGAAAGACAGTGAAGAGATGGGTGAGTCTCTCCTCCCAAATTAAAAACGTTGGGGTTCCCATGTGGGAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCAACCATCTTTTTTACTTTTCCTTTGCAGGTTATGGCTTTGCAGAACTGAGTAAGTCTCCCTCCCAACACGGAAGGGATTTGTGGTCTTCCCATGGGATCAGCCATGGGATGATCATCTGACCCCTCTCATCATGCATTTCATATTTGTTTCTTTTGCAGAGAAACTGGCTGCAGAACTGGGTGAGTGCTGCCTCCCAAATTAAATAAAAAGGGGGTCTGCCTGGGAGAGTGGTGGGATGGCACGTTCCTCTCACTGCGTGTTGCTTTTCCTTTCTTTTCCAGAGAAACACTCTGAAGAGATGGGTGAGTCTCCCCTCCCCAATTATAAAAGCTGGGGACTTCTTGTGGGAGCTGTGGGATGAGCTCTTCCTCTCATCATGCGCTGTTTCTGCTTTTCCTTTGCAGGGACAAGGGATTTAAAGTTGGGTGAGTCTCTCTTCCCAAACCATACA。

BG4引物扩增对应基因序列

GAGAAACACTCTGAAGAGATGGGTGAGTCTCCCCTCCCCAATTATAAAAGCTGGGGACTTCTTGTGGGAGCTGTGGGATGAGCTCTTCCTCTCATCATGCGCTGTTTCTGCTTTTCCTTTGCAGGGACAAGGGATTTAAAGTTGGGTGAGTCTCTCTTCCCAAACCATACAGATTTGGGGTCTTCCCACAGCATCAGCCATGGGATGATAATCGGACCCTTCTCATCATGTGTATCTTATTGGTTCCTTTTGCAGAGCGACTAGCTGCCAAACTGGGTGAGTCCCCCCTCCCAAATTAAATAAAAAATGGGGTCTGCCTGTGTGAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCATGCGCTGCTTTTCTCTTCCTTTTCCAGAACATCAAACTAAAGAATTGGGTGAGTCTTCTTTCCCCAACCCCAAGAAATATGCGTTTCCCATGGGATGACAAGCTGTGCCACCTCATCATGCCCTGTTTTTTCTGTTCTTTTTGCAGAGAAACAGCATTCACAGTTCCGTAAGTTGCAGTCACTGAACTGAAGGAATGTGGGGTCTTCCCAAAGTCCTGCATGTGGGATGAAAAATCCCCTCTGACCATGCACTGCTTTTCTCCTTCTATTCCAGAGAGACACTTTCAGAATATGTGTGAGTCTCCCAACCCCTGATAAATAAAAACGTTGGGGTCTTGCTGTGTGAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCACGTACTCTTTCTGATTTTCTTTTGCAGATTTAAGTGCTGGAAAACAGAGTAAGTCTCCCTCCCTGCACAGAAGGAACTTACGGTTTTCCCATGGGATCAGCCATGGGATCATCATCCGACTCTTCTCATCATGAATTTCGTCTTTCTTTCTTTTGCAGAGAAAATGGTTACAAAACTGGGTGAGTCCAACCTCCCAAACTAAATTAAAAACAGTCAGACTTTGTGAGCTGTG。

BG5引物扩增对应基因序列

AGAAAATGGTTACAAAACTGGGTGAGTCCAACCTCCCAAACTAAATTAAAAACAGTCAGACTTTGTGAGCTGTGGGATGAGACGTTCCTCTCATCATGTGCTGCTTTCCTTTTACTTTTCCAGAGGAACACTGTGAATGGATGGGTGAGTCTCCCCTCTCACATTAAAAATGTTGGGGTCTTCCTGTGAGAGCTGTGGGATGAGCTGTTCCTCTCATCGTGCACTGTTTCTGCTTTTCCTTTGCAGTGAGAAGGAATGTAAAGTTGGGTGAGTCTTCTTCCCCAACCAAAGAGATTCGGAGTCTTCCATGGGATCAGCCATGGGATGATAACCTGAACCTTATCATGTGTTTCTTATTTGTTCCTTTTGCAGAGGCAGCAGCTGTAAAAGTGGGTGAGTCTCCCCTCCCAAATTAAAAATGTTGGGGTCTTCCTGTGAGAGCTGTGGGATGAGCTGTTCCTCTCATCGTGCACTGTTTCTGCTTTTCCTTTGCAGTGAGAAGGAATGTAAAGTTGGGTGAGTCTTCTTCCCCAATCAAAGAGATTCGGAGTCTTCCGTGGGGTCAGCCATGGGATGATAAGCTGAACCTTATCACGTGTTTCTTATTTGTTCCTTTTGCAGAGGCAGCAGCTGTAAAAGTGGGTGAGTCCTCCCTCCCAAATCAAATACAAAAGGGGATCTGCCTGTGTGAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCACGCATTGTTTTTCTCATTCATTTCCAGGACACAAAGCTAAAGAATCAGGTGAGTCTTCTTCCCTGTCCCAAAGGACTATGGGTTTCCCATGGGATGACAAGCTGTGCCACCTCCTCATGAGGTGCTTCTTCTTTCTTTTTGCAGAGAAACAGAAATCGGAGCTGAGTAAGTTGCAGTCACTGAAATGAGGGAATGTGGGGTCTTCCCAAAGTCCTGCGTATGGGATGAAAAATCCCCTCTGACCATGCACTGCTTTTCTCCTCCTTTGCCAGAGGAGCGCCATGAGGAGATGGGTGAGTCTCCCCTCCCATATTAAAATCGTTGGGGTCTTCCTGTGTGAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCACACATTGTTTTTCTTTTCCAGGGCAACAAGCTAAAGAATCAGGTGAGTCTTCTTCCCCGTCCCAAAGGACTATGGGTTTCCCATGGGATGACAAGCTGTGCCACCTCCTCATGAGGTGCTTCTTCTTTCTTTTTTGCAGAGAAACAGAAATCGGAGCTGAGTAAGTTGCAGTCACTGAACTGAGGGTATTTGGGGTCCTTTCAAGGGACTGTGTATGGGATGAAAAATCCCCTCTGACCATGCACTGCTTTTCTCCTTCTTTGCCAGAGGAGCGCCATGAGGAGATGGGTGAGTCTCCCCTCCCATATTAAAATCATTGGGGTCTTCCTGTGTGAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCGTGCGGTGCTTTTCTCTCTTTTCCAGCAGAACAAACTGAAGCAGTG。

BG6引物扩增对应基因序列

CTCATCACACATTGTTTTTCTTTTCCAGGGCAACAAGCTAAAGAATCAGGTGAGTCTTCTTCCCCGTCCCAAAGGACTATGGGTTTCCCATGGGATGACAAGCTGTGCCACCTCCTCATGAGGTGCTTCTTCTTTCTTTTTTGCAGAGAAACAGAAATCGGAGCTGAGTAAGTTGCAGTCACTGAACTGAGGGTATTTGGGGTCCTTTCAAGGGACTGTGTATGGGATGAAAAATCCCCTCTGACCATGCACTGCTTTTCTCCTTCTTTGCCAGAGGAGCGCCATGAGGAGATGGGTGAGTCTCCCCTCCCATATTAAAATCATTGGGGTCTTCCTGTGTGAGCTGTGGGATGAGATGTTCCTCTCATCGTGCGGTGCTTTTCTCTCTTTTCCAGCAGAACAAACTGAAGCAGTGGGTGAGTCTTTGTCCCCAAACCAAAGGAATATGGGGCAATCCATGGGATGACAAGCTGTCCCATCTCATCATGTGTTGCTTTTCTATTCCTTTTTTCCAGTGGTAGAAACTGAAGAATAGGGTGAGTCTTTCCCAAACCAAAGCAATACAGGGTTTCCCATGGGATGACAAGCTGTCCCACCTCAGTATCCGTTCCTTTTTATTTCTTTTCCAGAAAAACCATCAGAAGAATCAGATTGAGAGATGAACTGCGCCTCGCAATAAGCACAGGAGTTAAGCTTCATAGATCAATAACTGCACAGCATACAAAACCACAATAACTCAAACAGAGTAAGGAGGAGCCAGTGTTTGTGTTGAGTGAGAACACTGCAGTTCTGTCAGCCAAAGCTGCCTGAGGGACCGCCCAATTGAGGGTGTGCGACCTCCAACTCAAAGCCAATTGGAAGAAAGAAACCATAGAAAGGAAGGAAAGGGGAGGAAGACAGAGATCCTGGAAGAGATATGGGCATTTGGGGAAATAGTGTGACCATGTATCAGGCTTTGTGGACATCTAACGAATATGTCATGTTTTTGTAAATACAAGCATGCACGCAGAAACAAAGGTAGAAAACTGCTTTGGGTGTTAGCACTGTTCTCTGTCCCTATGTAATAAAGAATACCTGCTGATGGCAATGG。

本发明的第二目的是提供一种MHC B-G座位全序列测定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

其中MHC B-G座位引物信息见表1，PCR反应体系(25uL体系)；

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

第一，本发明MHC B-G座位全序列测定试剂盒及SNP检测方法，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，能实现多重反应、自动化程度高。

第二，MHC基因的变异可反映基因组水平的变异，通过MHC基因的变异分析，可有效地评估品种遗传多样性的水平。MHC基因的变异水平常常被认为是脊椎动物机体免疫系统识别外来寄生物(细菌、病毒、寄生虫等)能力的重要部分。

第三，MHCB-G区编码产物又称Ⅳ类抗原，为禽类所特有；鸡MHC B-G座位全长6425bp，存在丰富的变异位点，获得MHC B-G座位全长序列比较困难，分析MHC B-G座位全基因序列SNP位点对于研究鸡免疫能力及群体遗传多样性具有重要意义，具有潜在的应用价值和社会效应。

附图说明

图1是本发明测序峰图与序列比较图；

其中：峰图下方大写字母为测序基因序列，峰图上方小写字母为Genbank红色原鸡基因序列，标注红色碱基处为突变位置，Y代表C/T突变，R代表A/G突变。横坐标代表基因序列的位置。

具体实施方式

本发明专利结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例：狼山鸡MHC B-G座位全序列测定及SNP检测方法

狼山鸡属蛋肉兼用型鸡种。原产江苏如东、南通两县。全国各地均有饲养。狼山鸡是我国古老的优良地方品种，并在世界家禽品种中负有盛名。

目前我国采用保种场和基因库保种，如东县狼山鸡保种场进行原地保护，国家级地方鸡种基因库(江苏)于2002年引种进行异地保护。狼山鸡遗传性能稳定，繁殖力、抗病力及适应性强，肉质品味鲜美，香气浓郁，致密香嫩，深受消费者欢迎。

翅静脉采集30只狼山鸡全血，应用传统的苯酚/氯仿法提取DNA，并将DNA浓度稀释到50ng/μl。

本发明中狼山鸡MHC B-G座位全序列测定试剂盒，包括：

检测方法中MHC B-G座位全序列测定条件的优化

(1)引物设计：根据GenBank上登录的红色原鸡MHC B-G座位序列，利用Primer5.0设计扩增6425bp全序列的特异性引物，经过PCR预扩增和条件优化，最终选择6个特异性引物，引物信息见表1。

(2)以提取的DNA进行PCR扩增，获得目的片段。MHC B-G座位特异性引物在梯度PCR仪上进行。

PCR反应体系(25uL体系)，参照狼山鸡MHC B-G座位全序列测定试剂盒，包括(1)

在200μl的PCR薄壁管中，按照上述PCR反应体系加入各试剂，充分混匀后短暂离心，在梯度PCR仪上进行

(3)PCR反应结束后取5μl反应产物在2％琼脂糖胶，1×TBE中电泳，检测反应是否成功，是否是目的片段。

(4)对目的片段进行克隆、测序

PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，使用胶回收试剂盒回收，连接到pMD18—T载体上，转化于DH5a大肠杆菌感受态细胞，涂布于Amp/X–gal-IPTG/LB平板上克隆，挑取单个白色菌落进行培养，挑选鉴定为阳性的克隆，送上海生物技术有限公司进行双向测序。

(5)SNP分析：通过chromas软件读取,通过双向重复测序进行校正，序列拼接，所获序列用Clustalw软件进行比对，与Genbank基因序列进行比较，统计单倍型和单核苷酸多态性(SNP)。

BG1引物扩增对应基因序列

BG2引物对应的基因片段序列

BG3引物扩增对应基因序列

BG4引物扩增对应基因序列

BG5引物扩增对应基因序列

BG6引物扩增对应基因序列

SEQ ID NO 1

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120>鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法及试剂盒

<160> 18

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 1

TCATATTCTC CCCACACTTC TT 22

SEQ ID NO 2

<210>2

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 2

CCCACCCTTA CCACTATCCT T 21

SEQ ID NO 3

<210>3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 3

TGGGTCATTTG TCGTCAATG 19

SEQ ID NO 4

<210>4

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 4

AGAAGGCATT TTACTAACAT GATG 24

SEQ ID NO 5

<210>5

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 5

TGGGTCTTCC CATTGGAAGT TAT 23

SEQ ID NO 6

<210>6

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 6

TGTATGGTTT GGGAAGAGAG ACT 23

SEQ ID NO 7

<210>7

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 7

GAGAAACACT CTGAAGAGAT GGGT 24

SEQ ID NO 8

<210>8

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 8

CACAGCTCAC AAAGTCTGAC TG 22

SEQ ID NO 9

<210>9

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 9

AGAAAATGGT TACAAAACTG GGT 23

SEQ ID NO 10

<210>10

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 10

CACTGCTTCA GTTTGTTCTG CT 22

SEQ ID NO 11

<210>11

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 11

CTCATCACAC ATTGTTTTTC TTTTC 25

SEQ ID NO 12

<210>12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 12

CCATTGCCAT CAGCAGGTAT TC 22

SEQ ID NO 13

<210>13

<211> 1351

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>常规合成的引物

<400> 13

TCATATTCTC CCCACACTTC TTCCCCATAT TCTTTCCAAA TCCTCTTCCC CATCTCCTCC 60

ACCGTCTCTT TCTCACAGTC CTTCCTCTCT CTCCCTAAAT TCTTCCCCCC TCCTCTTCTC 120

CAGCACAGAT GGCCTTCACA TCGGGCTGCA ACCACCCCAG TTTCACCCTC CCCTGGAGGA 180

CCCTCCTGCC TTATCTCGTG GCTCTGCACC TCCTCCAGCT GGGATCAGGT AGGGGTCTGT 240

GGGGCTGCTG TGCCTGGCAC AGGTGTTGCT GTGCCGCTCC ATGCCCCACA TTAACACAGA 300

CACCATCTCA CCATCTCTCC GTGCCCTTCT CATTGCCCAG CCCAGCTCAC GGTGGTGGCA 360

CCGAGCCTCC GTGTCACTGC CAACGTGGGA CAGGATGTTG TGTTGCGCTG CCACTTGTCC 420

CCATGCAAGG ATGCTCGGAG CTCAGACATC AGATGGATCC AGCAGCGGTC CTCTCGGCTT 480

GTGCACCACT ACCGAAATGG AGTGGACCTG GGGCAGATGG AGGAATATAA AGGGAGAACA 540

GAACTGCTCA GGGATGGTCT CTCTGATGGA AACCTGGATT TGCGCATCAC TGCCGTGACC 600

TCCTCTGATA GTGGCTCATA CAGCTGTGCT GTGCAAGATG GTGATGCCTA TGCAGAAGCT 660

GTGGTGAACC TGGAGGTGTC AGGTCAGTGG CTAGGGTGTC TAAGGATGGA GAGCTGATGG 720

ATCGCAGCCT TTGGAAGTGG TCAGGGCTGA ACAGCTCCAT GAGATGCTGG AATTGCAGTG 780

GGCGCACGCT GTGATTTGGA GATGGGTCTG CATGGATGAG GTGGTTGGGT TGGGTTTCTG 840

GGATGGGTTT CTCCATGGCT CAGTGGCAGT GGGCACACAA TGCTGAGCAG CTCCTCCACC 900

TGTGCCAATG TGGAGATGCT GCTATTGTGT GTCACTGCTC CCTGCTTGCT GCCCCTTCGG 960

GTTCTGTGAT CTCCAGAAGT CAAAGTCATG CTTGTCTACA TAAGGCAATG GAAAAGGAAC 1020

CCTTGTCCTG ATGTTTTTTT CAGATCCCTT TTCCCAGATC ATCCTTTACT GGACAGTGGC 1080

TCTGGCTGTG ATCATCACAC TTCTGGTTGG GTCATTTGTC GTCAATGTTT TTCTCCATAG 1140

AAAGAAAGGT AAGCTGACAG TGGAGGGGAT GGAGCACAGG GAGGTGTTGT GCATGGACAG 1200

GGATGGTCGG GGTGGTGCTG AGCTCTGGTC CATGGAGGTA CACAGGAGGA GGAACGGTGA 1260

CTTTTCATGG GATTCCCAGT GCTCATTAAA TAACATTTGC CTTTCTTTTT GGGAATAAAG1320

GAAGGGGAAA AAGGATAGTG GTAAGGGTGG G 1351

SEQ ID NO 14

<210>14

<211> 989

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BG2 引物对应的基因片段序列

<400> 14

TGGGTCATTT GTCGTCAATG TTTTTCTCCA TAGAAAGAAA GGTAAGCTGA CAGTGGAGGG 60

GATGGAGCAC AGGGAGGTGT TGTGCATGGA CAGGGATGGT CGGGGTGGTG CTGAGCTCTG 120

GTCCATGGAG GTACACAGGA GGAGGAACGG TGACTTTTCA TGGGATTCCC AGTGCTCATT 180

AAATAACATT TGCCTTTCTT TTTGGGAATA AAGGAAGGGG AAAAAGGATA GTGGTAAGGG 240

TGGGCAGATA GGAATGTGGC TGGACTGTGG GGCAGGTGGA AAGTCCAAAC CCTCTGGAGA 300

AGTCCCCACA AACCAAGCTG CCCTGCTGAC CAGCTATTTC TCTGCTTTGT TTTCCAGTGG 360

CACAGAGCAG AGAGCTGAGT GAGTCCTTCC AGCTCCTTCC ACCACCAAAG TCCCTTTAAT 420

GGAACTGACA GCAGACTGCA GAGTGCTGGG TTATGCCGTG TGCTGGGGCC ATGAGCTATG 480

TTGAGGCTTT GGAATGTGTT GGGGTTGTGG GATGTACTGG GGTCGTGGGA TGTGTCAATC 540

CTGGCTGATT CACGTGGAAA AACCTTTCAC AATCGGTTCC TTCCAGTTTG TTTAATTCCT 600

TCTTGGGCCC AAAGTGGTCA TTGGACTCCT CCCAGAAAAA AGGGTTTGGG GTCAGGGTGT 660

GAGAGCTGAT GGCATGGAAA CGTGTCCCCT CTGACCATGC ATTTCATTTG CTTCTATTTT 720

GCAGAGAGAA AAGATGCAGA GTTGGGTAAG TCTCCTTCCC TAAAGCGAGG GAATTCAGGG 780

TGTCCCCATG GCATCAGCCG TGGAATGAGC TGCTGTCCCC TCTGACCATG CACTGCTCTG 840

CTCTTTCCTT TCCAGTGGAG AAAGCTGCAG CATTGGGTGA GTTATATTCC CCAAGCCAAA 900

GTACTTTGGG TCTTCCCATT GGAAGTTATT TCCTCAGACC ATCCTTTCTG TTGTGTTTGC 960

TTTGGCATCA TGTTAGTAAA ATGCCTTCT 989

SEQ ID NO 15

<210>15

<211> 1520

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BG3引物扩增对应基因序列

<400> 15

TGGGTCTTCC CATTGGAAGT TATTTCCTCA GACCATCCTT TCTGTTGTGT TTGCTTTGGC 60

ATCATGTTAG TAAAATGCCT TCTTGGGACC AAAGTGGTCA TTGGCCACTT CCCAGAAAAA 120

AAGATTTGGG GGCAGGGTGT GGGAGCTGAT GGCATGGAAA TTTGTCCCCT CTGACCATGC 180

TTTTCCTTTG CTTCTTTTTG CAGAGAGAAA AGATGCAGAG TTGGGTAAGT CTCCTTCCCC 240

ACAGCGAGGG AATTCAGGGT TTCCCCATGG CGTTAGCCAC GGGATGAGCA GCTGTCCTCT 300

CTGACCATGC ACTGCTCTGC TCTTTCTTTT CCAGCGGAAC AAGCAGCGCT ATCGAGTGAG 360

TCTCCCCCTC CATTTTTATT ATTTTTAAAT GTTCAGCCTC CGGTAGCTGT GGGATGAGAT 420

GTTCCTCTCA TCATACACTG ACTCTGCTTT TCCTTTGCAG AGCAAAGAGA TGCAATGTTG 480

GGTGAGTCTC CCACCTGAAA CCAAAGAGAT TTGGGGTCTT CCCATGGGAT CAGCCATGGG 540

ATGATAACCT GAACCTTCTC ATCGTGCGTT TCTTATTTGT TCCTTTTGCA GAGAAACACG 600

TTCTAAAACT GGGTGAGTCC TCACTCCCAA ATTATAAAGC AAAGGGTTCT GCCTGTGTGA 660

GCTGTGGGAT CAGACGTTCC ACTCATCATG CATTGCTTTT CTCTTTCTTT TTCAGAGGAA 720

AAGACAGACG AAGTGGGTGA GTCTACATTC ACTAAAGCAA AGAAATATGG GGTCTCCCAT 780

GAGATGACAA GCTGTCCCAA GAAATCATGT GGTGCTTTTT CTTGTCTTTT TATTTATTTA 840

TTTATTTATT TGCAGAGAAT TGGAATTCAG TGCTGAGTAA GTTGCAGTCA CTGAACTGAG 900

GGAATGTGGG GTCTTCCTAA GGGACTGCGT AGGGGAGAAG TTCCCATGCA CTGCTTTTCT960

CTTTCTTTTC CAGAGAAAGA CAGTGAAGAG ATGGGTGAGT CTCTCCTCCC AAATTAAAAA 1020

CGTTGGGGTT CCCATGTGGG AGCTGTGGGA TGAGATGTTC CTCTCATCAA CCATCTTTTT 1080

TACTTTTCCT TTGCAGGTTA TGGCTTTGCA GAACTGAGTA AGTCTCCCTC CCAACACGGA1140

AGGGATTTGT GGTCTTCCCA TGGGATCAGC CATGGGATGA TCATCTGACC CCTCTCATCA 1200

TGCATTTCAT ATTTGTTTCT TTTGCAGAGA AACTGGCTGC AGAACTGGGT GAGTGCTGCC 1260

TCCCAAATTA AATAAAAAGG GGGTCTGCCT GGGAGAGTGG TGGGATGGCA CGTTCCTCTC 1320

ACTGCGTGTT GCTTTTCCTT TCTTTTCCAG AGAAACACTC TGAAGAGATG GGTGAGTCTC 1380

CCCTCCCCAA TTATAAAAGC TGGGGACTTC TTGTGGGAGC TGTGGGATGA GCTCTTCCTC 1440

TCATCATGCG CTGTTTCTGC TTTTCCTTTG CAGGGACAAG GGATTTAAAG TTGGGTGAGT 1500

CTCTCTTCCC AAACCATACA 1520

SEQ ID NO 16

<210>16

<211> 959

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BG4引物扩增对应基因序列

<400> 16

GAGAAACACT CTGAAGAGAT GGGTGAGTCT CCCCTCCCCA ATTATAAAAG CTGGGGACTT 60

CTTGTGGGAG CTGTGGGATG AGCTCTTCCT CTCATCATGC GCTGTTTCTG CTTTTCCTTT 120

GCAGGGACAA GGGATTTAAA GTTGGGTGAG TCTCTCTTCC CAAACCATAC AGATTTGGGG 180

TCTTCCCACA GCATCAGCCA TGGGATGATA ATCGGACCCT TCTCATCATG TGTATCTTAT 240

TGGTTCCTTT TGCAGAGCGA CTAGCTGCCA AACTGGGTGA GTCCCCCCTC CCAAATTAAA 300

TAAAAAATGG GGTCTGCCTG TGTGAGCTGT GGGATGAGAT GTTCCTCTCA TCATGCGCTG 360

CTTTTCTCTT CCTTTTCCAG AACATCAAAC TAAAGAATTG GGTGAGTCTT CTTTCCCCAA 420

CCCCAAGAAA TATGCGTTTC CCATGGGATG ACAAGCTGTG CCACCTCATC ATGCCCTGTT 480

TTTTCTGTTC TTTTTGCAGA GAAACAGCAT TCACAGTTCC GTAAGTTGCA GTCACTGAAC 540

TGAAGGAATG TGGGGTCTTC CCAAAGTCCT GCATGTGGGA TGAAAAATCC CCTCTGACCA 600

TGCACTGCTT TTCTCCTTCT ATTCCAGAGA GACACTTTCA GAATATGTGT GAGTCTCCCA 660

ACCCCTGATA AATAAAAACG TTGGGGTCTT GCTGTGTGAG CTGTGGGATG AGATGTTCCT 720

CTCATCACGT ACTCTTTCTG ATTTTCTTTT GCAGATTTAA GTGCTGGAAA ACAGAGTAAG 780

TCTCCCTCCC TGCACAGAAG GAACTTACGG TTTTCCCATG GGATCAGCCA TGGGATCATC 840

ATCCGACTCT TCTCATCATG AATTTCGTCT TTCTTTCTTT TGCAGAGAAA ATGGTTACAA 900

AACTGGGTGA GTCCAACCTC CCAAACTAAA TTAAAAACAG TCAGACTTTG TGAGCTGTG 959

SEQ ID NO 17

<210>17

<211> 1495

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BG5引物扩增对应基因序列

<400> 17

AGAAAATGGT TACAAAACTG GGTGAGTCCA ACCTCCCAAA CTAAATTAAA AACAGTCAGA 60

CTTTGTGAGC TGTGGGATGA GACGTTCCTC TCATCATGTG CTGCTTTCCT TTTACTTTTC 120

CAGAGGAACA CTGTGAATGG ATGGGTGAGT CTCCCCTCTC ACATTAAAAA TGTTGGGGTC 180

TTCCTGTGAG AGCTGTGGGA TGAGCTGTTC CTCTCATCGT GCACTGTTTC TGCTTTTCCT 240

TTGCAGTGAG AAGGAATGTA AAGTTGGGTG AGTCTTCTTC CCCAACCAAA GAGATTCGGA 300

GTCTTCCATG GGATCAGCCA TGGGATGATA ACCTGAACCT TATCATGTGT TTCTTATTTG 360

TTCCTTTTGC AGAGGCAGCA GCTGTAAAAG TGGGTGAGTC TCCCCTCCCA AATTAAAAAT 420

GTTGGGGTCT TCCTGTGAGA GCTGTGGGAT GAGCTGTTCC TCTCATCGTG CACTGTTTCT 480

GCTTTTCCTT TGCAGTGAGA AGGAATGTAA AGTTGGGTGA GTCTTCTTCC CCAATCAAAG 540

AGATTCGGAG TCTTCCGTGG GGTCAGCCAT GGGATGATAA GCTGAACCTT ATCACGTGTT 600

TCTTATTTGT TCCTTTTGCA GAGGCAGCAG CTGTAAAAGT GGGTGAGTCC TCCCTCCCAA 660

ATCAAATACA AAAGGGGATC TGCCTGTGTG AGCTGTGGGA TGAGATGTTC CTCTCATCAC 720

GCATTGTTTT TCTCATTCAT TTCCAGGACA CAAAGCTAAA GAATCAGGTG AGTCTTCTTC 780

CCTGTCCCAA AGGACTATGG GTTTCCCATG GGATGACAAG CTGTGCCACC TCCTCATGAG 840

GTGCTTCTTC TTTCTTTTTG CAGAGAAACA GAAATCGGAG CTGAGTAAGT TGCAGTCACT 900

GAAATGAGGG AATGTGGGGT CTTCCCAAAG TCCTGCGTAT GGGATGAAAA ATCCCCTCTG 960

ACCATGCACT GCTTTTCTCC TCCTTTGCCA GAGGAGCGCC ATGAGGAGAT GGGTGAGTCT 1020

CCCCTCCCAT ATTAAAATCG TTGGGGTCTT CCTGTGTGAG CTGTGGGATG AGATGTTCCT 1080

CTCATCACAC ATTGTTTTTC TTTTCCAGGG CAACAAGCTA AAGAATCAGG TGAGTCTTCT 1140

TCCCCGTCCC AAAGGACTAT GGGTTTCCCA TGGGATGACA AGCTGTGCCA CCTCCTCATG 1200

AGGTGCTTCT TCTTTCTTTT TTGCAGAGAA ACAGAAATCG GAGCTGAGTA AGTTGCAGTC 1260

ACTGAACTGA GGGTATTTGG GGTCCTTTCA AGGGACTGTG TATGGGATGA AAAATCCCCT 1320

CTGACCATGC ACTGCTTTTC TCCTTCTTTG CCAGAGGAGC GCCATGAGGA GATGGGTGAG 1380

TCTCCCCTCC CATATTAAAA TCATTGGGGT CTTCCTGTGT GAGCTGTGGG ATGAGATGTT 1440

CCTCTCATCG TGCGGTGCTT TTCTCTCTTT TCCAGCAGAA CAAACTGAAG CAGTG 1495

SEQ ID NO 18

<210>18

<211> 1090

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BG6引物扩增对应基因序列

<400> 18

CTCATCACAC ATTGTTTTTC TTTTCCAGGG CAACAAGCTA AAGAATCAGG TGAGTCTTCT 60

TCCCCGTCCC AAAGGACTAT GGGTTTCCCA TGGGATGACA AGCTGTGCCA CCTCCTCATG 120

AGGTGCTTCT TCTTTCTTTT TTGCAGAGAA ACAGAAATCG GAGCTGAGTA AGTTGCAGTC 180

ACTGAACTGA GGGTATTTGG GGTCCTTTCA AGGGACTGTG TATGGGATGA AAAATCCCCT 240

CTGACCATGC ACTGCTTTTC TCCTTCTTTG CCAGAGGAGC GCCATGAGGA GATGGGTGAG 300

TCTCCCCTCC CATATTAAAA TCATTGGGGT CTTCCTGTGT GAGCTGTGGG ATGAGATGTT 360

CCTCTCATCG TGCGGTGCTT TTCTCTCTTT TCCAGCAGAA CAAACTGAAG CAGTGGGTGA 420

GTCTTTGTCC CCAAACCAAA GGAATATGGG GCAATCCATG GGATGACAAG CTGTCCCATC 480

TCATCATGTG TTGCTTTTCT ATTCCTTTTT TCCAGTGGTA GAAACTGAAG AATAGGGTGA 540

GTCTTTCCCA AACCAAAGCA ATACAGGGTT TCCCATGGGA TGACAAGCTG TCCCACCTCA 600

GTATCCGTTC CTTTTTATTT CTTTTCCAGA AAAACCATCA GAAGAATCAG ATTGAGAGAT 660

GAACTGCGCC TCGCAATAAG CACAGGAGTT AAGCTTCATA GATCAATAAC TGCACAGCAT 720

ACAAAACCAC AATAACTCAA ACAGAGTAAG GAGGAGCCAG TGTTTGTGTT GAGTGAGAAC 780

ACTGCAGTTC TGTCAGCCAA AGCTGCCTGA GGGACCGCCC AATTGAGGGT GTGCGACCTC 840

CAACTCAAAG CCAATTGGAA GAAAGAAACC ATAGAAAGGA AGGAAAGGGG AGGAAGACAG 900

AGATCCTGGA AGAGATATGG GCATTTGGGG AAATAGTGTG ACCATGTATC AGGCTTTGTG 960

GACATCTAAC GAATATGTCA TGTTTTTGTA AATACAAGCA TGCACGCAGA AACAAAGGTA 1020

GAAAACTGCT TTGGGTGTTA GCACTGTTCT CTGTCCCTAT GTAATAAAGA ATACCTGCTG 1080

ATGGCAATGG 1090

Claims

1.鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）引物设计：设计鸡MHC B-G座位全序列测定的特异性引物，特异性引物包括SEQ IDNO 1-12；

（2）DNA提取：从鸡全血中提取DNA；

（3）PCR扩增：以步骤（2）提取的DNA通过所述特异性引物SEQ ID NO 1-6进行PCR扩增，获得目的片段；MHC B-G座位特异性引物的PCR扩增在梯度PCR仪上进行；

（4）琼脂糖胶电泳检测： PCR反应结束后，琼脂糖胶电泳检测反应是否成功，是否是目的片段；

（5）对目的片段进行克隆、测序： PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，使用胶回收试剂盒回收，克隆，挑取单个白色菌落进行培养，挑选鉴定为阳性的克隆，双向测序；

（6）SNP分析：将步骤（5）所获序列用Clustalw软件进行比对，与Genbank基因序列进行比较，统计单倍型和单核苷酸多态性SNP。

2.根据权利要求1所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是，步骤（3）所述PCR扩增的反应体系为：

（1）DNA模板50ng/ul 3μL，

（2）10×Buffer缓冲液 2.5μL，

（3）dNTP 2.5mM/each 0.5μL，

（4）Taq酶5U/μL 0.5μL，

（5）灭菌ddH₂O 18μL，

（6）正反向引物混合物SEQ ID NO 1-12 0.5μL。

3.根据权利要求2所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是，步骤（3）所述PCR扩增的反应条件为：95°C 预变性 10min，然后 35 个循环的95°C 变性20-30s,退火55-60°C 20-30 s,72℃ 20-30s，然后72℃ 5min，4℃保存；特异性引物SEQ ID NO 1-12的退火温度55-60°C。

4.根据权利要求1、2或3所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法，其特征是，步骤（2）所述提取的DNA通过所述特异性引物SEQ ID NO 1-12进行PCR扩增后的长度分别为1351、989、1520、959、1495、1090。

5.一种应用权利要求1-4所述的鸡MHC B-G座位全序列测定和SNP检测方法的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括特异性引物SEQ ID NO 1-12。