CN107937552B - 一种与苏淮猪肉色性状相关的snp标记及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪肉色性状相关的SNP标记及其引物和应用。所述SNP标记位于猪12号染色体上的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体g.45318896核苷酸位点，且具有为G/A多态性，所述SNP标记与苏淮猪的肉色a值(红度值)极显著相关。一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。本发明提供的SNP标记与苏淮猪的肉色性状相关，可以通过鉴定该SNP标记来筛选肉色a值高的猪品系，所得的肉色a值高的品系具有重要的经济效益与社会价值。

Description

一种与苏淮猪肉色性状相关的SNP标记及其引物和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪肉色性状相关的SNP标记及其引物和应用。

背景技术

我国是猪肉消费及产量第一大国，猪肉品质一直是养猪生产者与消费者持续关注的热点之一。目前评价猪肉品质主要有肉色、嫩度、肌内脂肪、PH值、滴水损失、系水力等重要指标。随着人民生活水平的提高和养猪业的迅速发展，人们更加关注猪肉品质，而不是猪肉的产量，猪肉的肉色对于消费者而言是一项可直接感受的印象指标，因此是消费者购买优质猪肉时考虑的最主要的因素。

骨骼肌作为猪肉中的重要组成成分，直接决定着猪肉的肉质品质。因此，对猪骨骼肌生长发育调控机理的探究一直是畜牧科学领域中的热点。肌纤维类型的差异会直接导致肌肉颜色的变异。在氧化型纤维占比例较高的肌肉中，其肌红蛋白含量更高，肌肉颜色更鲜红，肉色评分相对较高。而在酵解型纤维占比例较高的肌肉中，其肌红蛋白含量较低，肉色便越显苍白，导致较低的肉色评分。

miRNA基因遗传变异的出现可能会改变pri-miRNA的转录，影响pre-miRNA加工或稳定性，从而导致成熟miRNA表达水平的增加或减少。另一方面，miRNA基因序列的变化会进而影响它们与靶mRNA之间的相互作用。也正因为miRNA可潜在调控多个靶标的表达，所以其序列的变异往往会引发多功能效应，导致个体表型发生变异。例如，已有研究发现，miR-208b与miR-1前体序列所在基因片段上均存在一个遗传突变，可显著影响miR-208b和miR-1在骨骼肌中的表达，且该位点均与猪肌肉纤维特征及肉质性状表型变异存在显著相关。

苏淮猪是由江苏农业厅批准，由南京农业大学和淮阴种猪场联合培育的黑毛猪新品种。其以淮猪母本,大白猪为父本进行杂交选育而成。苏淮猪结合了淮猪的产仔性能和大白猪的生长性能，是一个优良的培育品种。苏淮猪面部较为清秀，呈轻微凹陷，全身被毛黑色，其具有抗逆性强，适应性强，耐粗饲，肉质好等优点。由于是培育的新品种，所以目前关于苏淮猪的肉质遗传机制的研究还较少，因此苏淮猪的肉质的遗传机制是一个值得研究的领域。

从国际猪QTL数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)知，目前在猪所有的常染色体及性染色体上都定位到影响肉质的QTL，肉色是肉质的一个重要的并且直观的指标，这些QTL大部分是利用微卫星标记定位的QTL，置信区间多在10-20cM，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，肉色的较低的平均遗传力，提供与猪肉色相关的SNP标记。

本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物和检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。

一种与苏淮猪肉色性状相关的SNP标记，所述miRNA的前体序列的SNP标记位于猪7号染色体上的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体g.45318896核苷酸位点，且具有G/A多态性，所述SNP标记与苏淮猪屠宰后2小时a值(肌肉的红度值)极显著相关。g.45318896位点具有AA基因型苏淮猪个体的宰后2h肉色a值比GG型高，呈极显著水平，但与GA型之间无显著性差异；GA型苏淮猪个体的宰后2h肉色a值比GG型个体要高，且达到显著水平。

一种基于本发明所述的SNP开发分子标记的方法，以含有本发明所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使本发明所述的SNP标记转化为分子标记。

其中，所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3；所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第221位，存在G/A多态性。

按照本发明上述方法得到的分子标记。

所述的分子标记优选序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第221位，存在G/A多态性。

一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。

一种检测本发明所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增苏淮猪基因组中含有本发明所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的G/A多态性。

所述的检测本发明所述的SNP标记的方法，优选包括以下步骤：

(1)取苏淮猪的耳组织样品并提取总DNA；

(2)用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用所述的引物进行PCR扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第221位的G/A多态性。

本发明所述的SNP标记、所述的分子标记、所述的引物对在筛选高肉色苏淮猪品系中的应用。

一种筛选苏淮猪品系肉色a值高的的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体上g.45318896核苷酸位点的基因型，选育g.45318896核苷酸位点的AA型或GA型个体作为种猪，所生产后代肉色更好。

有益效果：

本发明提供的SNP标记与苏淮猪的肉色性状显著相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选肉色a值高的苏淮猪品系，所得的选肉色a值高的苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

附图说明

图1为miR-22前体序列的不同基因型的DNA测序结果峰图。

图中箭头所指的是g.45318896核苷酸位点的不同的基因型，由上指下分别为GG、GA和AA型。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1、实验动物来源

江苏省淮安市淮阴种猪场

2、SNP标记的获得

苏淮猪群体肉色性状的观测值进行描述性统计分析，屠宰后24h肉色b值的变异系数高达28.35％，屠宰后2h肉色a值的变异系数也达到了25.82％。为初步解析引起苏淮猪肉色性状变异的分子机理，我们在300头苏淮猪中随机选择了8个个体，以其DNA为模板，利用设计的特异性引物扩增包含Ssc-miR-22前体序列在内的688bp长度片段。测序、比对后，发现存在多个突变位点，选择其中一个G/A突变位点即g.45318896核苷酸位点作为下一步研究的对象。

3、提取基因组DNA

采集300头苏淮猪的耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。

使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组DNA，所需试剂包括：

裂解液实验室配备

蛋白酶K(德国MERCK生物科技有限公司)

Tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)

Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)

氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)

无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)

3M乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)

具体步骤如下所述：

(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离心管中；

(2)加入裂解液(自己配备)800μL，及蛋白酶K 30μL(20mg/ml)；

(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；

(4)加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；

(5)取650μL上清加Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；

(6)取550μL上清，加氯仿800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；

以下步骤换1.5ml的离心管

(7)取450μL上清，加无水乙醇800μL，3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；

(8)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000μL 70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；

(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；

(10)样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。

4、300头苏淮猪的肉色性状的测定

具体测定方案如下：

(1)对每头猪最后肋骨处的背最长肌进行采样，200g。

(2)将色差计的镜头垂直置于镜面上，镜口紧扣肉面(不能漏光)，同时避开肌内脂肪和肌内结缔组织。测定并分别记录肉样的亮度值(L*)、红度值(a*)、黄度值(b*)。每个样品至少测定三个点，取平均值，肉色性状的测定在屠宰后2h进行。

5、目的片段PCR扩增与测序

用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增：取DNA模板2μL、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的引物各0.25μL、PCR Mix试剂10.4μL、双蒸水7.1μL；设置PCR扩增体系：预变性96℃2min；变形96℃20s；退火60℃30s；延伸72℃45s；35个循环；然后延伸72℃7min。

PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小为688bp，将扩增产物进行测序，测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读g.45318896G/A的基因型，然后使用SAS 9.1软件中的一般线性模型对肉色值与基因型值间的相关效应进行分析。将性别、基因型作为固定效应，日龄作为协变量包括在模型中。对于确定关联的基因型的平均特征值进行对比，使用SAS中的Tukey-Kramer程序检测显著性差异。显著性的P值经过10000次的随机抽样校正。

表1给出了g.45318896G/A突变位点在苏淮猪群体中对肉色a值的影响效应。由表1可知，苏淮猪群体中，g.45318896AA基因型个体的宰后2h肉色a值比GG型高0.83，呈极显著水平(P＝0.0037)，但与GA型之间无显著性差异；GA型个体的宰后2h肉色a值比GG型个体要高0.49，且达到显著水平(P＝0.013)。由此可见，在苏淮猪中，继代选育g.45318896G/A位点的AA型个体，均可逐步提高苏淮猪的肉色的a值，达到提高苏淮猪肉质的目的。

表1.g.45318896 G/A SNP位点与苏淮猪肉色性状a值的关联分析

<110> 南京农业大学

<120>一种与苏淮猪肉色性状相关的SNP标记及其引物和应用

<160> 3

<210> 1

<211> 688

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<222>

<223> 含a>g核苷酸位点的分子标记

<400> 1

ggtccacatg ctcacctaat acctggggcc catactgggt ggggtgtgtc caggctccca 60

ggtcctgcct tctctgaggg ctgaggaggc ttgcgtcccc tataggtagc cggggcaaga 120

ggttgagctt tctacagcct gcagttctgg aaagagaagc aaggaagtag gtttagagct 180

acctcttttc tctcactgaa ggcccaggtc agagtcaaga gctctcatta gaagattgaa 240

catctgctgg ggctggactt tgatggctag tgggacagtg tccctgtgac atggccctgg 300

tcaggtcttt ccaatttttc cttcctttcc ctttaggaag ctgtacctca catatcctct 360

cctggctgag ccgcagtagt tcttcagtgg caagctttat gtcctgaccc agctaaagct 420

gccagttgaa gaactgttgc cctctgcccc tggcttcgag gaggaagagg agatggagct 480

gctttcctct tcatctggaa ggtgacagaa ctggggctgg gacggtctga acagcaaaag 540

tcatgatccc tttcgggaaa gggaacccta ttcagttgag gagtttcgct cacattgacc 600

tggccagaga ggaaatttca gagtagagac cctggatgca gtggagaatg atggctctgt 660

gtgcccaagg ttagttggtc ctcgtgcg 688

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物

<400> 2

ggtccacatg ctcaccta 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物

<400> 3

cgcacgagga ccaactaa 18

Claims (8)

1.一种基于与苏淮猪肉色红度值相关的SNP标记开发分子标记的方法，其特征在于以含有与苏淮猪肉色红度值相关的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述的与苏淮猪肉色红度值相关的SNP标记转化为分子标记; 所述SNP标记位于猪12号染色体上的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体上g.45318896核苷酸位点，且具有G/A多态性，所述SNP标记与苏淮猪的肉色红度值极显著相关；所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3，所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第221位，存在G/A多态性。

2.按照权利要求1所述的方法得到的分子标记；其特征在于所述的分子标记序列如SEQID NO：1所示，所述的SNP位点位于第221位，存在G/A多态性。

3.一种用于检测权利要求1中所述的与苏淮猪肉色红度值相关的SNP标记的引物对，其特征在于上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。

4.一种检测权利要求1中所述的与苏淮猪肉色红度值相关的SNP标记的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取苏淮猪的耳组织样品并提取总DNA；

（2）用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用上游引物为：SEQ ID NO：2和下游引物为：SEQ ID NO：3进行PCR扩增；

（3）扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第221位的G/A多态性。

5.与苏淮猪肉色红度值相关的SNP标记在筛选肉色红度值高的苏淮猪品系中的应用，所述SNP标记位于猪12号染色体上的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体上g.45318896核苷酸位点，且具有G/A多态性，所述SNP标记与苏淮猪的肉色红度值极显著相关。

6.权利要求2所述的分子标记在筛选肉色红度值高的苏淮猪品系中的应用。

7.权利要求3所述的引物对在筛选肉色红度值高的苏淮猪品系中的应用。

8.一种筛选肉色红度值高的苏淮猪品系的方法，其特征在于包括检测苏淮猪国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体上g.45318896核苷酸位点的基因型，选育g.45318896核苷酸位点的AA型和GA型个体作为种猪。