CN109628607B - 一种与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记及其应用。所述SNP标记位于猪12号染色体上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体上g.622808核苷酸位点，且具有为A/G多态性，所述SNP标记与苏淮猪中性洗涤纤维消化率极显著相关。一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。本发明提供的SNP标记与苏淮猪的中性洗涤纤维消化率相关，可以通过鉴定该SNP标记来筛选有较高的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体。

Description

一种与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记及其应用。

背景技术

中性洗涤纤维消化率水平是衡量猪对纤维消化的重要指标之一，并直接影响我国节粮、减排、高效养猪业的可持续发展。近年来，随着对日粮纤维理化特性和营养生理作用研究的深入，研究发现日粮纤维在增强猪的健康和维持胃肠道的微生态平衡方面具有重要的作用。地方品种猪具有耐粗饲的特性，且在长期饲喂过程中形成了使用纤维性饲料的习惯，而含有地方猪血统的合成品种是否继承了这一种质特性、是否降低了纤维性饲料的消化率还都未知。

苏淮猪是由淮安市淮阴种猪场、南京农业大学、江苏省畜牧总站和淮安市农业委员会等单位与1998年开始培育，2011年3月25日获得国家畜禽遗传资源委员会授予的新品种证书。苏淮猪是在新淮猪基础上再导入大白猪血统，通过横交、多世代选育而成，含新淮猪血统50％，大白猪血统50％。苏淮猪培育以来研究人员围绕苏淮猪耐粗饲做了一些研究，发现苏淮猪继承了中国地方猪种淮猪的耐粗饲特性，利用纤维能力较强。但限于研究方法、手段、材料及耐粗饲性状本身复杂性等众多因素的制约，苏淮猪猪种耐粗饲遗传机制并没有得到充分的揭示和有效的利用。

另外，值得注意的是，中国是养猪大国，而且养猪规模还在不断的增加，饲料用粮已经成为粮食主要用途之一，这进一步加剧了人畜争粮的危机。中国纤维资源丰富，在猪日粮中添加纤维不仅能节约粮食、在一定程度上解决人畜争粮问题，而且还能改善动物胃肠道微生物区系、提高动物福利。因此，通过鉴别苏淮猪中性洗涤纤维消化率变异的基因和标记，进一步提升苏淮猪的中性洗涤纤维消化率，对选育有较高的中性洗涤纤维消化率的群体具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供与苏淮猪粗纤维消化率相关的SNP标记。

本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物和检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。

一种与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记，所述SNP标记位于国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体上g.622808核苷酸位点，且具有为A/G多态性，所述SNP标记与苏淮猪中性洗涤纤维消化率极显著相关。该位点具有AA基因型的苏淮猪中性洗涤纤维消化率显著高于具有GG基因型的苏淮猪中性洗涤纤维消化率。

一种基于本发明所述的SNP开发分子标记的方法，以含有本发明所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使本发明所述的SNP标记转化为分子标记。

其中，所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO：2，下游引物：SEQ ID NO：3；所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第422位，存在A/G多态性。

按照本发明上述方法得到的分子标记。

所述的分子标记优选序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第422位，存在A/G多态性。

一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。

一种检测本发明所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增苏淮猪基因组中含有本发明所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的A/G多态性。

所述的检测本发明所述的SNP标记的方法，优选包括以下步骤：

(1)取苏淮猪的耳组织样品并提取总DNA；

(2)用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用所述的引物对进行PCR扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第422位的A/G多态性。

其中，步骤(2)所述的PCR优选扩增反应体系为：DNA模板2.5μL、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示的引物各1.25μL、PCR Mix试剂25μL、双蒸水20μL；其中所述DNA模板浓度为30ng/μL，所述引物的浓度为10mol/L，所述PCR Mix试剂为南京欧科生物技术有限公司的P394961L型号试剂；PCR扩增的反应程序为：预变性96℃2min；变性96℃20s；退火60℃30s，延伸72℃45s，35个循环；延伸72℃10min。

本发明所述的SNP标记、所述的分子标记、所述的引物在筛选有较高的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体中的应用。

一种筛选有较高的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体上g.622808核苷酸位点的基因型，选育g.622808核苷酸位点的AA型个体作为种猪。

有益效果：

本发明提供的SNP标记与苏淮猪的中性洗涤纤维消化率相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选有较高的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体。

附图说明

图1为有较高的中性洗涤纤维消化率和相对较低的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体全基因组关联分析获得基因组染色体上SNP标记-log₁₀(P)值的分布情况。其中，猪的18条常染色体及X染色体信息标识于X轴，SNP与中性洗涤纤维消化率相关性的-log₁₀(P)值按SNP在基因组中的位置显示Y轴。虚线表示的是染色体显著水平阈值，实线表示的是基因组显著水平的阈值。GWAS结果发现12号染色体上包含1个与中性洗涤纤维消化率相关的SNP位点。

图2为使用本发明的引物扩增g.622808基因位点片段的电泳图。使用本发明的引物扩增g.622808基因位点片段的电泳图，扩增的基因位点片段长度为495bp。

图3为g.622808的突变位点不同基因型的DNA测序结果峰图。

A图为GG基因型的DNA测序结果峰图，B图为AG基因型的DNA测序结果峰图，C图为AA基因型的DNA测序结果峰图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1、实验动物来源

江苏淮安市淮阴种猪场。

计算274头苏淮猪中性洗涤纤维消化率的育种值，计算模型为

Y(中性洗涤纤维消化率)＝Sex(性别)+Sampling batch(批次)+Pen(栏舍)+age(测定日龄)+additive effect+Residual，

其中包括固定效应----性别、批次和栏舍，协变量----测定日龄，随机效应----个体加性遗传值。

2、提取基因组DNA

采集中性洗涤纤维消化率较高的25个个体与中性洗涤纤维消化率较低的25

个个体的耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。

使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组DNA，所需试剂包括：

裂解液实验室配备

蛋白酶K(德国MERCK生物科技有限公司)

Tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)

Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)

氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)

无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)

3M乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)

具体步骤如下所述：

(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离心管中；

(2)加入裂解液(自己配备)800μL，及蛋白酶K 30μL(0mg/ml)；

(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；

(4)加入Tris饱和酚800μL，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；

(5)取650μL上清加Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；

(6)取550μL上清，加氯仿800μL，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；以下步骤换1.5ml的离心管

(7)取450μL上清，加无水乙醇800μL，3M乙酸钠40μL，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；

(8)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000μL 70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；

(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；

(10)样品加100μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μL于-20℃下保存备用。

3、猪全基因组5万个(50K)SNP基因型检测

上述个体的DNA在Illumina Beadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP(Illumina，美国)基因型判定。利用PLINK(1.9)对所有样本50K芯片数据进行质量控制，剔除检出率低于0.95、家系孟德尔错误率高于0.05的个体；最小等位基因频率小于0.05的SNP标记。

4、全基因组关联(GWAS)分析

使用GEMMA软件对分型个体的50K SNP标记型数据和中性洗涤纤维消化率表型数据进行GWAS分析，采用Bonferroni校正法控制多重检验，将基因组显著性阈值确定为0.05标记数。GWAS的结果显示，猪12号染色体上存在1个与中性洗涤纤维消化率显著相关的SNP位点(图1)。

5、50头苏淮猪的中性洗涤纤维消化率结果分析(单因素方差分析)

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (422)..(422)

<223> r=a或g

<400> 1

ccccgcaacc agtcgtgact atgtgaggaa acgtccataa aaatgtctac accacgggtc 60

ccaagggctc cggggtctgc gagggcccac gtgccagaag gggggcgccc caaccactca 120

gggacagaag ctcccgagct caagactctg ctgggctccc ctgggtgtcc cccctgcccc 180

cagctgctcc tgagtctctg gaaagacgct ttacagtgaa ctagacaacg cgatgcagcg 240

tttcccaggt cgtgcacctg agcaggggtc gtgggagcgc ctggttggta gccggctgga 300

ccctgggacc cgttacttac aacgggcgtc tcgcgtgggg acgagcctgc cacctgtggg 360

attggcacca actccgggca gctgtgtgag cacggagtta aggtgcagga cgacagctgg 420

crtccacaga gaactggaaa ttgtttggca tggaagcccc gcacatttgg cgtctgaagt 480

gttgaaagtg tttctttagg aaggcgactc agcagacagg ctggaacagc cggatccctg 540

aataaccgtc ccaccaggga gcactggcca tacccacagc acacagaata aataatttga 600

gctggatcac agagctgtgc ttaaaagccg agactaagct tccagaaaga accaggactc 660

tcctgtgtct tctgggtccc aggtgcccca aagggagaaa accatggaag g 711

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacagtgaac tagacaacgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catggttttc tccctttggg 20

Claims (7)

1.一种基于与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记开发分子标记的方法，其特征在于以与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对SEQ ID NO：2和 SEQ ID NO：3，以苏淮猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记转化为如SEQ ID NO：1所示的分子标记；所述的与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记位于SEQ ID NO：1所示序列的第422位，存在A/G多态性；所述SNP标记位于国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体上g. 622808核苷酸位点，且表现为A/G多态性，所述SNP标记与苏淮猪中性洗涤纤维消化率极显著相关，该位点具有AA基因型的苏淮猪中性洗涤纤维消化率显著高于具有GG基因型的苏淮猪中性洗涤纤维消化率。

2.按照权利要求1所述的方法得到的分子标记；其特征在于，所述的分子标记序列如SEQ ID NO：1所示，所述的SNP位点位于第422位，存在A/G多态性；所述SNP标记与苏淮猪中性洗涤纤维消化率极显著相关，该位点具有AA基因型的苏淮猪中性洗涤纤维消化率显著高于具有GG基因型的苏淮猪中性洗涤纤维消化率。

3.一种用于检测权利要求1中所述的与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记的引物对，其特征在于上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。

4.一种检测权利要求1中所述的与苏淮猪中性洗涤纤维消化率相关的SNP标记的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取一头苏淮猪的耳组织样品并提取总DNA；

（2）用已提取的苏淮猪基因组DNA为模板，使用权利要求3所述的引物对进行PCR扩增；

（3）扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQ ID NO：1第422位的A/G多态性。

5.权利要求1所述的SNP标记作为检测靶点在筛选有较高的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体中的应用。

6.权利要求3所述的引物对在筛选有较高的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体中的应用。

7.一种筛选有高的中性洗涤纤维消化率的苏淮猪群体的方法，其特征在于包括检测国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体上g. 622808核苷酸位点的基因型，选育g.622808核苷酸位点的AA型个体作为种猪。

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