CN114561475B - 一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法及其应用及试剂盒 - Google Patents

一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法及其应用及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法，其包括以下步骤：(1)提取待测鸡DNA样本；以所述待测鸡DNA为模板，进行PCR扩增，检测是否具有序列如SEQ ID NO：1所示的分子标记。本发明还公开了SH3RF2基因分子标记在肉鸡体重选育中的应用、试剂盒、以及用于肉鸡体重选育的分子标记。本发明利用了SH3RF2基因的第6内含子和外显子剪接区域存在19bp的小片段插入缺失变异，该插入突变获得的分子标记显著影响肉鸡6‑12周龄的体重。使用该分子标记，可以快速检测肉鸡群体中不同个体的基因型，进而依据基因型来预测不同个体体重的差异，进行肉鸡体重的选育，从而提高选育效率。

Description

一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法及其应用及试 剂盒
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法及其应用及试剂盒。
背景技术
分子标记辅助选择(MAS，marker-assisted selection)是目前畜禽分子育种最为常规和有效的育种手段，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。目前，MAS技术应用主要集中在基因聚合(Genepyramiding)、基因渗入(Gene transgression)、根据育种计划构建基因系等方面。在鸡育种中最为典型的育种案例即为鸡性连锁矮小基因(dw基因)的鉴定，目前多家育种公司利用该基因的分子标记辅助选育，从而培育出节粮型的矮脚肉鸡和蛋鸡，为推动鸡育种做出极大贡献(牛晓艳，2006；孙建等，2011；楼立峰等，2010)。
家鸡在驯化过程中，根据人类的需求，人工培育出快大型商品肉鸡和高繁殖力的商用蛋鸡。通过全基因组遗传选择分析，可以揭示控制家鸡重要经济性状的遗传调控机制，进而对鸡进行针对性的选育。2012年，Rubin等人对鸡的多个品系进行全基因组的重测序，发现了许多鸡基因组中的选择性清除区域。结果发现，位于13号染色体上的SH3RF2基因存在18kb的插入缺失突变，该大片段缺失突变与生长性状密切相关，并且缺失型在快大型肉鸡中得到固定，而在低生长或者未经选育的品系中基因频率较低(Rubin等,2010)。这为研究SH3RF2基因与生长性状的关系提供了前期基础。现有技术认为SH3RF2基因上18,961bp的大片段缺失突变是影响肉鸡体重的重要标记，但是在我国大多数地方鸡品种中均未发现此大片段缺失等位基因的存在，中国农业大学曲鲁江研究组同步对国内15个鸡种进行长片段缺失检测，均检测不到大片段的缺失存在(赵妤娟等，2012)。
以上研究表明，前期针对鸡SH3RF2的遗传标记不存在于当前国内多个地方品种中。而针对该基因是否可以作为国内肉鸡体重性状分子选育的遗传标记基因，值得开展更为精细的基因变异扫描和鉴定，从而确定有效的遗传标记位点，为实施国内肉鸡的分子辅助选育提供新的分子标记，从而促进肉鸡体重的分子选育工作。
发明内容
本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种与肉鸡体重相关的分子标记，其能够对鸡进行有效体重选育。
为了实现以上发明目的，本发明提供了一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法，其包括以下步骤：
(1)提取待测鸡DNA；
(2)以所述待测鸡DNA为模板，进行PCR扩增，检测是否具有序列如SEQ ID NO：1所示的分子标记。
优选地，使用引物对扩增所述待测鸡DNA，所述引物对的正向引物序列如SEQ IDNO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，所述PCR扩增的反应体系总体积为10μL，其中所述待测鸡DNA模板1μL，正向引物和反向引物各0.2nmol/μL，PCR通用预混液5μL，最后加入去离子水至总反应体积为10μL。
优选地，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min后，循环33次95℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸3min。
另一方面，本发明还提供了SH3RF2基因分子标记在肉鸡体重选育中的应用，其中，所述分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列第35个碱基处发生19bp的插入突变，所述插入突变的序列如SEQ ID NO：2所示，对应如SEQ ID NO：1所示的序列的第17-35个碱基片段。
另一方面，本发明还提供了一种用于肉鸡体重选育的分子标记，其中，所述分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列第35个碱基处发生19bp的插入突变，所述插入突变的序列如SEQ ID NO：2所示，对应如SEQ ID NO：1所示的序列的第17-35个碱基片段相同。
另一方面，本发明还提供了引物对，其中，所述引物对特异性扩增所述的分子标记，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。
另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括用于检测分子标记的PCR扩增引物对，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列第35个碱基处发生19bp的插入突变，所述插入突变的序列如SEQ ID NO：2所示，对应如SEQ ID NO：1所示的序列的第17-35个碱基片段相同。
优选地，所述试剂盒还包括PCR通用预混液。
另一方面，本发明还提供了一种肉鸡体重选育方法，其中，应用所述的试剂盒对待测样品进行检测。
本发明利用了SH3RF2基因的第6内含子和外显子剪接区域存在19bp的小片段插入缺失变异，该插入突变获得的分子标记显著影响肉鸡6-12周龄的体重。使用该分子标记，可以快速检测肉鸡群体中不同个体的基因型，进而依据基因型来预测不同个体体重的差异，进行地方鸡种肉鸡生长性状如体重的选育，剔除生长体重较轻的个体，从而提高选育效率。
附图说明
图1是本发明分子标记的PCR产物检测分型图。图中，II为插入型基因型，DD为未插入型基因型，ID为杂合型，M为DL2000分子标志物，用于判断序列长度。
图2是本发明分子标记所涉及的19bp插入变异的测序图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
除非特别说明，以下实施例中所使用的的实验仪器、试剂、通用实验步骤均为现有的实验仪器、试剂、通用实验步骤，本领域技术人员可通过商业渠道购买获得。
实施例1：肉鸡体重相关SH3RF2基因分子标记的制备、分型检测和应用
1、检测样本DNA的制备
采用苯酚-氯仿抽提法进行鸡基因组DNA的制备。
首选，采集100μL待测样本(1-5周龄任意日龄)的待测鸡全血样，放入含有EDTA-Na2的离心管中(EDTA-Na2终浓度为1.2mg/mL)进行混匀，即为抗凝待检血样。
然后，取15μL上述抗凝待检血样于1.5mL离心管中，分别加入470μL 1×STE缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司，货号ST459)、12.5μL 20％(w/v)SDS(十二烷基磺酸钠)和5μL 10mg/mL蛋白酶K，混合后置于55℃水浴锅或恒温箱消化4-5小时；然后用Tris饱和酚抽提2次，用氯仿-异戊醇(体积比23：1)抽提1次，取沉淀用75％(v/v)乙醇洗涤并烘干，最后用100μL TE缓冲溶液(Tris-EDTA缓冲液)(上海碧云天生物技术有限公司，货号ST725)进行DNA溶解，置于低温冰箱保存，用于后续PCR扩增检测。
2、分子标记序列的扩增制备
根据以下扩增引物对进行PCR扩增。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
具体引物信息如下：
正向引物F：GGCTGCACCAGGAAGAGTGA(SEQ ID NO：3)
反向引物R：GTTGGTAGCACCTCACGGAT(SEQ ID NO：4)
选用以上步骤制得的待测鸡样本DNA作为PCR扩增模板，配制反应液：PCR反应总体积10μL，其中待测鸡基因组DNA模板1μL，正反向引物各0.2nmol/μL，PCR Mix(PCR通用预混液，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，货号为B639295)5μL，最后加入去离子水至总反应体积10μL。
PCR反应条件：95℃预变性3min后，循环33次95℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸3min。
3、PCR产物检测
PCR产物经2％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行检测，确认扩增产物的片段长度。
4、个体等位基因分型
PCR产物电泳检测的结果如图1所示，其中II为插入型基因型，DD为未插入型基因型，ID为杂合型，M为DL2000分子标志物，用于判断序列长度。
参照图1进行基因分型，具体为插入型(II)的个体的PCR扩增产物长度为151bp的一条电泳条带，未插入型(DD)个体的PCR扩增产物长度为132bp的一条电泳条带，杂合型(ID)个体的PCR扩增产物长度包含两种扩增长度151bp和132bp的两条电泳条带。
实施例2：SH3RF2基因相关分子标记与体重表型的关联分析及应用
利用本发明中的分子标记对肉鸡群体进行基因分型和关联分析。该分子标记位于鸡SH3RF2基因上第6外显子和第6内含子剪接区域，其序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列第35个碱基处发生19bp的插入突变，该插入突变的序列如SEQ ID NO：2所示(即SEQ ID NO：1的第17-35个碱基片段)。如图2所示，是本发明分子标记所涉及的19bp插入变异的测序图。
所选样本为杏花鸡(黄羽慢速型肉鸡)×隐性白洛克(白羽快大型肉鸡)杂交第二代群体。鸡群饲养于华南农业大学原种鸡场，采用符合NRC标准的玉米大豆饲料进行平养的方式饲喂。每周进行体重等生长性状指标的测定，在90日龄时采集血样，按照1.2mg/mLEDTA-Na2含量制备鸡的抗凝血样品，其中EDTA-Na2由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。依据实施例1中所述的方法进行抗凝血检测样本DNA的制备。
选取221个通过以上制得的个体样本的DNA进行基因分型检测，具体方法参照实施例1中分子标记序列的扩增制备、PCR检测和个体等位基因分型。
最后依据基因型和群体的生长表型体重指标进行基因型和表型间的关联分析，为育种筛选生长性状相关的优势等位基因提供方案。
实验结果及分析具体如下：
(1)根据实施例1中的方案进行群体的基因分型检测，其中检测后获得36个个体为插入型(II)，39个个体为未插入型(ID)，146个个体为杂合型(ID)。
(2)采用SAS 8.1软件(SAS Institute，1996)中的GLM程序进行关联分析，其数学模型如下：
Yijkl＝μ+Gi+Dj+Hk+eijkl
Yijkl为生长性状观察值，μ为生长性状群体均数，Gi为基因型效应，Dj为家系效应，Hk为批次效应，eijkl为随机误差效应。
(3)关联分析的结果与应用
鸡6-12各周龄体重与分子标记基因型间的关联分析结果如以下表1所示。
表1.鸡6-12各周龄体重与分子标记基因型间的关联分析结果
插入型(II) 杂合型(ID) 未插入型(DD) P值
6周体重 601.32±23.73 573.27±17.23 531.02±17.51 <0.05
7周体重 742.96±27.53 705.15±19.91 670.34±20.24 <0.05
8周体重 918.3±34.11 857.91±24.66 813.09±25.05 <0.05
9周体重 1108.2±49.68 1007.26±37.34 1008.99±39.38 <0.05
10周体重 1234.15±54.45 1125.35±40.97 1051.7±39.77 <0.05
11周体重 1417.92±59.78 1302.9±44.52 1220.65±43.3 <0.05
12周体重 1601.76±78.49 1444.05±58.48 1325.67±60.25 <0.01
可见，本发明提供的SH3RF2基因分子标记存在于我国地方鸡种的肉鸡群体中，突破了现有技术获取的18kb大片段插入缺失突变在地方鸡种中不存在的事实，以国内地方鸡种杏花鸡和隐性白羽洛克鸡杂交形成的F2资源家系群体中进行分型检测关联分析，证实此突变与肉鸡6-12周龄的体重显著关联，其中与12周龄的体重达到极显著关联，19bp插入型纯合个体12周龄的平均体重比未插入型纯合个体的平均体重多增重约200g。分析结果表明，该插入突变获得的分子标记与鸡的生长性状显著相关。
因此，位于鸡SH3RF2基因上的19bp插入型为生长性状的优势等位基因，可以作为预测肉鸡体重表型和个体筛选过程中的单个分子标记进行应用，可以用于鸡分子辅助选育过程中针对体重性状的个体筛选。此外，通过实际饲养实验已证实，通过检测该鸡分子标记，能够有效筛选出体重生长优势明显的鸡个体。
序列表
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法及其应用及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 1
ggctgcacca ggaagagtga gtgcgggcgg gggctgtgct atgggcagtg ctatgggctg 60
tgctatgggc tgtgctacgg gcagcgcagc tgtgcttggg atggatgcaa ggatccgtga 120
ggtgctacca ac 132
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 2
gtgagtgcgg gcgggggct 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctgcacca ggaagagtga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttggtagca cctcacggat 20

Claims (10)

1.一种利用分子标记对鸡进行体重选育的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取待测鸡DNA；
(2)以所述待测鸡DNA为模板，进行PCR扩增，检测是否具有序列如SEQ ID NO：1所示的分子标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用引物对扩增所述鸡样本DNA，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系总体积为10μL，其中所述待测鸡DNA模板1μL，正向引物和反向引物各0.2nmol/μL，PCR通用预混液5μL，最后加入去离子水至总反应体积为10μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min后，循环33次95℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸15s；最后72℃延伸3min。
5.SH3RF2基因分子标记在肉鸡体重选育中的应用，其特征在于，所述分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列第35个碱基处发生19bp的插入突变，所述插入突变的序列如SEQ ID NO：2所示，对应如SEQ ID NO：1所示的序列的第17-35个碱基片段。
6.一种用于肉鸡体重选育的分子标记，其特征在于，所述分子标记的序列如SEQ IDNO：1所示，在该序列第35个碱基处发生19bp的插入突变，所述插入突变的序列如SEQ IDNO：2所示，对应如SEQ ID NO：1所示的序列的第17-35个碱基片段相同。
7.引物对，其特征在于，所述引物对特异性扩增权利要求6所述的分子标记，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。
8.一种试剂盒，其包括用于检测权利要求6所述的分子标记的PCR扩增引物对，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR通用预混液。
10.一种肉鸡体重选育方法，其特征在于，应用权利要求8或9所述的试剂盒对待测样品进行检测。
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